Комплекс протеинов: Многокомпонентный протеин — купить протеиновые комплексы в интернет-магазине: цены

ЛУЧШИЕ КОМПЛЕКСНЫЕ ПРОТЕИНЫ — Спортивное Питание в Геленджике

100% Whey Gold Standard от компании Optimum Nutrition

Информация: спорт-вики – википедия научного бодибилдинга

ОЦЕНКА

Экспертиза качества

Сывороточный протеин 100% Whey Gold Standard от компании Optimum Nutrition — является классикой жанра среди сывороточных протеинов, одним из самых известных и популярных в своем сегменте. Во многих рейтингах спортивного питания этот протеин занимает лидирующие позиции.

Считается, что именно 100% Whey Gold Standard привёл к успеху Optimum Nutrition как производителя. 100% Whey Gold Standard – номер 8 в топ 20 сывороточного протеина по версии supplementreviews.com, ну а на bodybuilding.com 100% Whey признавался продуктом номер 1 по продажам в мире среди сывороточных протеинов уже 8 раз.

Ну а теперь посмотрим, чем еще отличается 100% Whey Gold Standard, кроме позитивных имиджевых моментов.

Самые распространенные версии фасовки 100% Whey Gold – банки по 0,9 и 2,3кг, мешки по 4,5кг; производится продукт в США. Наибольший спектр вкусов доступен в упаковках, в банках.

Состав: 100% Whey Gold Standard состоит из изолята и концентрата сывороточного протеина, сывороточных пептидов. Утверждается, что изолят – это основной компонент. Важными составляющими являются Аминоген и Лактаза – компоненты, которые практически исключают возникновение проблем с пищеварением при приеме продукта. В качестве подсластителя используется ацесульфам. Плюс к этому, естественно, в составе имеются ароматизаторы и еще лецитин. Вот и все, ничего лишнего. Содержание пищевых нутриентов в порошке: белок – 82%, жир – 3%, углеводы – 10%. В порции 24 г протеина. Более 5 гр BCAA в каждой порции.

Вкус: Существующая на рынке линейка 100% Whey Gold Standard представлена 22 вкусами (шоколадная мята, белый шоколад, банановый крем, тропический пунш, двойной шоколад, соленая карамель, клубника-банан и т.  д.), а также 3 вкуса без искусственных ароматизаторов, красителей, подсластителей (Natural: шоколад, ваниль и клубника). В России проблематично найти магазин, где представлено в наличии всё многообразие, да и поставки очень нерегулярные. Вкус, как правило, слабо выраженный. Явный плюс то, что он ненавязчивый.

Растворимость: Растворяется в шейкере прекрасно (в любой жидкости). Однако, прилично пенится при этом.

Усваиваемость: С этим абсолютно никаких трудностей, даже у чувствительных к лактозе.

Результаты экспертизы «Росконтроля»

Согласно свидетельству о государственной регистрации, эта белковая смесь является специализированным пищевым продуктом для питания спортсменов. По проверенным показателям продукт соответствует требованиям ТР ТС 027/2012 «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания». Экспертиза показала, что в составе исследуемого образца нет опасных и вредных вещества — тяжелых металлов (

кадмия, свинца, ртути), мышьяка, афлатоксина и антибиотиков.

Кроме того, в образце нет каких-либо посторонних растительных компонентов белковой и углеводной природы. В составе образца — практически идеальное соотношение аминокислот. Кроме того, в 100% Whey Gold Standard содержится препарат «Aminogen», представляющий собой фермент (комплекс пептидаз микробиального происхождения), улучшающий усвоение аминокислот и расщепление белков и способствующий наиболее эффективному их усвоению.

Описание Производителя

ON 100% WHEY GOLD STANDARD это чистый сывороточный белок с минимальным содержанием жиров, насыщенных жиров, холестерина, лактозы и других углеводов.

Подобно предшественникам, Optimum Nutrition 100% WHEY GOLD STANDARD содержит в себе первоклассные оптимальные пищевые добавки, составляющие протеиновую смесь:

 

Состав:

Порция 30,4 г

• Энергетическая ценность 120 ккал
• Белки (протеин) 24 г
• Углеводы 3 г
• Холестерин 30 мг
• Кальций 140 мг
• Натрий 60 мг
• Калий 150 мг
• Смесь энзимов 25 мг
• Аминоген и Лактаза (Standardized to 100,000 FCC units/g)

Аминокислоты

• Л-триптофан 405 мг
• Л-валин 1422 мг
• Л-треонин 1654 мг
• Л-изолейцин 1573 мг
• Л-лейцин 2531 мг
• Л-лизин 2233 мг
• Л-фенилаланин 748 мг
• Л-метионин 492 мг
• Л-аргинин 505 мг
• Л-цистеин 494 мг
• Л-тирозин 703 мг
• Л-гистидин 423 мг
• Л-пролин 1509 мг
• Л-глютаминовая кислота 4082 мг
• Л-аспарагиновая кислота 2508 мг
• Л-серин 3753 мг
• Л-глицин 1373 мг
• Л-аланин 1180 мг

В зависимости от вкуса вес порции может меняться (от 29,4 до 33 грамм), при этом несущественно может меняться и состав (количество углеводов, холестерина, натрия, железа и др. ) при неизменном количестве белка в порции – 24 грамма. Вследствие этого количество порций протеина в одинаковых по весу упаковках для разных вкусов будет различаться.

Таким образом, каждая порция 100% Whey Gold Standard даст Вам чистейший сывороточный протеин, минимум жиров, минимум холестерина и лактозы. При этом можно выделить основные особенности данного бренда:

• Высокое содержание протеина в каждой порции 100% Whey Gold Standard (24 гр.)
• Комплекс содержит специальные пищеварительные ферменты для лучшего усвоения сывороточного белка
• Быстро растворяется
• В каждой порции комплекса содержится 5 граммов аминокислот ВСАА и более 4 граммов глютамина
• Данный протеин подходит людям, которым не рекомендуются продукты с лактозой

Несколько коктейлей в день дадут вам востребованную порцию белка и незаменимых аминокислот, требуемых для роста ваших мышечных объёмов. Минимальное содержание углеводов не позволит откладываться жировой прослойке, при этом белковый компонент активно работает на прирост чистой мышечной ткани.

Состояние перетренированности знакомо многим спортсменам. Это происходит после чрезвычайно интенсивных физических нагрузок. При этом мышечные волокна получают микроповреждения, которые срастаются во время отдыха. Именно поэтому периоды восстановления очень важны, и как раз в этот период повреждённым тканям необходимы аминокислоты, ВСАА, минералы и витамины. Всем этим и обеспечивает организм 100% Whey Gold Standard. А приём смеси перед тренировкой поможет не только эффективно наращивать мускулы, но и защитит их от перетренированности и катаболизма.

 

Как принимать Whey

Gold Standard

100% Whey Protein Gold Standard от Optimum Nutrition рекомендуется принимать 2 раза в дни тренировок (первый прием утром, второй – через 30 минут после занятий) и один раз в дни отдыха (утром, либо же между приемами пищи). Можно принимать больше 2 порций, а можно и меньше, все зависит от количества употребляемого вами белка, для роста мышечной массы атлету требуется от 1. 5 до 2 г белка на 1 кг массы тела, рассчитывайте нужно количество порций протеина Голд Стандарт Whey исходя из этой формулы. Для приготовления белкового коктейля, нужно размешать 1 порцию добавки с 0.3л любой жидкости (вода, 

молоко, сок), не стоит размешивать более 3 скупов протеина за один раз.

Optimum Nutrition 100% Whey Gold Standard против Syntha-6, что выбрать?

100% Whey Protein Gold Standard от Optimum Nutrition является лучшим протеиновым порошком в мире. Но многие не знают, что и Optimum Nutrition и BSN принадлежат одной и той же материнской компании, молочного гиганта Glanbia.Тем не менее, Whey Gold удивительно отличается от Syntha 6 и это пример фантастического способа того, как выпускаются продукты по сути одной компанией, которые не конкурируют напрямую между собой.

Несмотря на это, многие всё же хотели бы сравнить оба продукта между собой, чтобы узнать, какой из них лучше…

1. 100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ИНГРЕДИЕНТЫ:

Whey Gold является гораздо более простым продуктом. Его белковая смесь состоит из изолята сывороточного белка и концентрата сывороточного протеина. Единственные другие ингредиенты – это ароматизаторы и пищеварительные ферменты.

С другой стороны, Syntha-6 является гораздо более сложным протеиновым порошком. Он содержит белковую смесь, состоящую из концентрата сывороточного протеина, изолята сывороточного белка, казеината кальция, мицеллярного казеина, изолята молочного белка, яичного альбумина и глютамин-пептидов. Как и Whey Gold, Syntha-6 содержит некоторые пищеварительные ферменты, но его диапазон ароматизаторов и добавок гораздо обширнее.

Победитель: ничья. Иначе трудно выбрать, так как это зависит от ваших конкретных потребностей в продукте. Смесь, которая используется в Whey Gold превосходно подходит для восстановления после тренировки, благодаря своим быстро действующим белкам. Однако Syntha-6 обеспечивает более длительный, более устойчивый профиль высвобождения, что делает его многоцелевым белком. Когда дело доходит до качества, оба продукта сделаны одной и той же материнской компанией, используя один и тот же источник сырья.

2. 100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ДОЗИРОВКА:

Whey Gold обеспечивает 24 г. белка на порцию. Syntha-6 обеспечивает 22 г белка на порцию. Однако на этом сходство заканчивается. Порция 100% Whey Gold Standard может быть как 29,4 г (в зависимости от вкуса) по сравнению с 47 г порции для Syntha-6. Другими словами в Whey Gold до 81,6% белка, в то время как в Syntha-6 всего лишь около 47% белка, с углеводами жирами и клетчаткой, составляющих основную часть остатка. Whey Gold содержит всего 2 г углеводов и 1 г жира на порцию, в то время, как Syntha-6 содержит около 15 г углеводов и 6 г жира. Хотя эти макроэлементы, конечно, имеют своё место в диете (например, гейнеры), они не особенно благоприятны в протеинах.

Победитель: Optimum Nutrition 100% Whey Gold Standard

3. 100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ЭФФЕКТИВНОСТЬ:

Когда дело доходит до эффективности, оба продукта имеют свои достоинства. Оба обеспечивают высокое качество белков для активных людей. Какой из них более эффективный, зависит от ваших конкретных целей.

Победитель: ничья. При этом, если Вам нужен чистый белок, то Whey Gold является лучшим выбором. Однако, если вы хотите некоторые дополнительные калории или что-то ближе к заменителям пищи, то Syntha-6 является лучшим выбором.

4. 100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ВКУС И СМЕШИВАНИЕ:

Оба продукта обладают разнообразием вкусов, начиная от обязательных шоколада и ванили, до экзотических. Тем не менее, следует сказать, что Whey Gold имеет больше вкусов на выбор. Смешиваемость отличная у обоих продуктов. Текстура Whey Gold намного плотнее, чем у воды, в то время как у Syntha-6 консистенция схожая с коктейлем.

Когда дело доходит до вкуса, Syntha-6 лучший выбор, поскольку обладает более насыщенным вкусом, по сравнению с довольно мягким Whey Gold.

Победитель: BSN Syntha-6

5. 100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ЦЕНА И КАЧЕСТВО:

На первый взгляд Whey Gold и Syntha-6, кажется, не слишком отличаются по стоимости. Однако, учитывая значительно большее содержание белка и размер порции в Whey Gold в отношении стоимости, Whey Gold явный победитель.

Победитель: Optimum Nutrition 100% Whey Gold Standard

100% Whey Gold Standard против Syntha 6 – ОБЩИЙ ПОБЕДИТЕЛЬ:

Whey Gold бьёт Syntha-6 в сегменте дозирования и количества белка на порцию. Syntha-6 получила победу в категории вкуса. В категории «ингредиенты и эффективность» — ничья. Это означает, что победителем является Optimum Nutrition 100% Whey Gold Standard

Необходимо отметить, что результаты вышеприведённого сравнения не могут быть согласованы всеми и, поскольку мнения между людьми могут различаться, они должны быть использованы при выборе одного или второго продукта только в качестве ориентира

Атлеты, оставляя свои отзывы об 100% Whey Protein Gold Standard на различных интернет площадках, делятся своим опытом употребления данной спортивной добавки:

 

Антон * * * * *

Купил две банки. В принципе доволен. Употребляю на протяжении года. Личный рейтинг вкуса по убыванию: 1)Тропический пунш; 2) Клубника; 3) Дабл. шоколад; 4) Ваниль Айс крим. Худшим оказался (мороженное) Rocky Road, довольной резкий и противный запах, еле выпил и то через силу. Раньше мешал с водой…

Достоинства: Хороший прирост мышечной массы, разнообразность вкусов

Недостатки:  Смущает отсутствие мембраны под крышкой. Над крышкой простой черной пленкой запаяно. Друг привозил из-за бугра банку этой фирмы, на ней очень плотно была прилеплена фирменная мембрана ON. Советую

Виктор * * * * *

Один из лучших протеинов, для меня в том числе. Очень рекомендую!!

 

Макс * * * * *

Самый лучший протеин

Достоинства: Хорошо усваивается, вкус отличный

Недостатки:  Цена

 

Алексей * * * * *

Порывшись в сети нашел информацию, что этот протеин 8 лет назад занимал 1-е место в мире. Купил. Честно Вам скажу – ДОВОЛЕН. Проблем с усвоением не было, вкус супер. Печенье-крем всем советую. У меня даже супруга начала пить протеин. Говорит: «Вкусненько»

Достоинства: Качество, вкус

Недостатки: Нет

 

Влад * * * *

Брал вкус Double Rich Chocolate, на молоке, если делать, похож на какао. До этого пил соленую карамель (брал не здесь), тоже интересный вкус, даже на воде.

Достоинства: Оригинал USA

Недостатки: Нет

Гость * * * * *

50% пользователей считают этот отзыв полезным

Протеин отличный. Запах приятный, вкус тоже. Чтобы хорошо размешать в молоке с ложкой придется постоять пару тройку минут

Достоинства: Запах, вкус, качество

Недостатки: Пока не нашел

 

Руслан Слободанюк* * * * *
100% пользователей считают этот отзыв полезным

Фишка этого прота, что это комплекс. Сам пртеин .аминокислоты и глютамин. Поэтому он лучше работает.

Николай

Не факт, взял как-то мешок, разница конкретная – и во вкусе и в результатах. Очень многое зависит от того у кого покупаешь, нужно брать у проверенного поставщика.

 

Константин * * * * *

100% пользователей считают этот отзыв полезным

Искал оригинальный продукт — нашёл. в общем, голограмма есть, банка запечатана. это именно американский, не европейский протеин. поживём-увидим каким будет эффект. брал в первый раз, поэтому немного удивил размер банки, реально большая. рекомендация — при отправке упаковывать надо в белую непрозрачную плёнку, зачем, чтобы всё отделение новой почты видело, что Вы получаете

Достоинства: лучший протеин, если верить рейтингам

 

nachdiv

Заказываю его через этот [реклама вырезана]. Проверял на сворачиваемость — все в норме! Пью с молоком. Разводится прекрасно. Даже вообще идеально. Пробовал все шоколадные вкусы, лучший, пожалуй, — двойной кофе мокко. Консистенция тоже получается приятная. Другие теперь даже не использую. Хотя, хочу еще синту попробовать

Комплекс протеинов Supreme Isolate| 1825 г | Fit&Shape

---

Высококонцентрированный белок для интенсивной мышечной нагрузки!   

---

SUPREME ISOLATE — инновационная формула, содержащая мультифункциональный комплекс протеинов: качественный изолят сывороточного, молочного и яичного протеина. Каждый тип протеина имеет свою биологическую ценность и свой уникальный аминокислотный состав. Благодаря этому сочетанию SUPREME ISOLATE улучшает поступление аминокислот в мышцы на протяжении нескольких часов.

☝️SUPREME ISOLATE создает все необходимые условия для естественной работы мышц и их максимальной отдачи, повышает выработку энергии, существенно укрепляет защитные функции организма и расширяет пределы адаптационных возможностей спортсменов.

☝️SUPREME ISOLATE — дополнительный источник белка и микронутриентов в рационе питания спортсменов силовых, скоростно-силовых и игровых видов спорта для быстрого набора сухой мышечной массы, ускорения процесса восстановления, сокращения сроков адаптации (как к физической нагрузке, так и к изменяющимся условиям внешней среды), поддержки иммунитета и уменьшения жировой прослойки, увеличения взрывной силы мышц и выносливости, профилактики перенапряжений, повышения психической устойчивости и работоспособности. Подходит для применения как в тренировочном, так и в соревновательном периодах подготовки спортсмена.

✍Сывороточный протеин активизирует и усиливает метаболизм мышц и помогает поддерживать чистую мышечную массу.

✍Молочный протеин обладает антикатаболическими свойствами (предупреждает распад мышечной массы) и усиливает эффект от приема сывороточного протеина. Совместное  использование ускоряет синтез белка и создает условия для продолжительной подпитки мышц аминокислотами.

✍Яичный протеин содержит весь спектр заменимых и незаменимых аминокислот, необходимых для роста мышц, и отличается высокой биологической ценностью, поскольку практически полностью усваивается организмом. В нем содержится большое количество лейцина, который  играет первостепенную роль в синтезе белка и важен для производства энергии. Яичный протеин богат серосодержащими аминокислотами, которые принимают активное участие в выработке гормонов. Он содержит большое количество витаминов, минералов и микронутриентов.

SUPREME ISOLATE:

☑️быстрое и эффективное увеличение мышечной массы;
☑️повышение работоспособности и устойчивости к физическим нагрузкам; 
☑️укрепление иммунитета:
☑️увеличение взрывной силы мышц и силовой выносливости:
☑️ускорение восстановления и снижение сроков адаптации к физическим нагрузкам.

Способ приема:

Растворите порцию 30 г в 200-250 мл воды или обезжиренного молока. Рекомендуется принимать:

☑️в целях сохранения мышечной массы 2 раза в день за 30-60 мин до тренировки 30 г (молочную) дозу и сразу после ее окончания 30 г (водную) дозу из расчета 0,8 – 1 грамм белка на килограмм веса в сутки;

☑️для наращивания мышечной массы необходимо увеличить потребление белка до 2 грамм на килограмм веса в сутки, или 3-4 порции по 30 г в день. Первую порцию рекомендуется выпивать сразу после пробуждения перед завтраком.

Предостережения и условия хранения:

Этот продукт рекомендуется использовать не в качестве альтернативы разнообразному рациону питания, а как часть сбалансированной диеты для здорового образа жизни. Не превышайте рекомендуемую суточную норму.

Употребление продукта не рекомендуется детям, а также женщинам в период беременности и кормления грудью. 

Хранить в прохладном, сухом месте, недоступном для детей. 

Указанный срок годности действителен только для продукта в неповрежденной упаковке и при соблюдении всех условий хранения. 

Производитель не несет ответственности за любые убытки, причиненные в результате неправильного использования или хранения.

Состав:

SUPREME ISOLATE	100 г	Порция (30 г)
Энергетическая ценность	378 Ккал/1604 КДж	189 Ккал/802 КДж
Жиры	1 г	1 г
в т. ч. насыщенные	0 мг	0 мг
в т.ч. транс жиры	0 мг	0 мг
Протеин (белок)	88,5 г	26,5 г
Углеводы	1 г	1 г
в т.ч. сахара	0 г	0 г
Соль (NaCl)	0 г	0 г
Холестерин	0 мг	0 мг

Ингредиенты:

изолят сывороточного протеина, изолят молочного протеина, изолят яичного протеина, ароматизатор, натуральный краситель какао, подсластитель сукралоза.

Вкус:  шоколадный торт

Упаковка — банка 1825 г

Порций в упаковке:   60

Отзывов (0)

Написать отзыв

Нет отзывов об этом товаре.

Протеин WHEY COMPLEX 600гр Artlab

Whey Protein Complex Artlab — уникальная по составу низкокалорийная белковая смесь для наращивания и поддержания мышечной массы с великолепным аминокислотным профилем и максимально-быстрым усвоением. Один из самых качественных протеинов представленных на российском рынке спортивного питания.

Whey Protein Complex Artlab на 75% состоит из сывороточного изолята, сывороточного концентрата и гидролизата сывороточного белка от известных мировых поставщиков из Новой Зеландии, Франции и Швейцарии. Комплекс усилен глютамином, таурином и витаминеральной формулой.

Продукт позволяет увеличить выносливость, ускорить мышечный рост, улучшить восстановление и качество отдыха после тяжелых тренировок.

Действие Whey Protein Artlab

Сывороточный протеин один из самых ценных белков в природе, более совершенный аминокислотный профиль имеют только 100 % сывороточный изолят и яичный белок.

Прием сывороточного протеина идеален утром после сна и после завершения силовой тренировки. Whey Protein Complex Artlab — это:

• Богатый аминокислотный профиль с биологической ценностью (BV) белка 104;

   

   

• Мощный восстановительный комплекс включающий ВСАА, L–глютамин и таурин;

   

   

• Анаболический комплекс ZMA, состоящий из важных микроэлементов: цинка, магния и витамина В6, синергическое действие которых значительно повышает уровень анаболических гормонов в организме атлета;

   

   

• Плюс янтарная кислота — природный стимулятор нервной системы, противовоспалительное и антитоксическое средство, помогающее работе почек и кишечника. Используется при лечении хронических сердечно-сосудистых заболеваниях;

 

Как принимать Whey Protein Artlab

Для наращивания мышц, кроме адекватной программы тренировок вам непременно потребуется перейти на 5-6 разовое питание, и с каждым приемом пищи вы должны получать необходимое количество белка.

Сколько именно белка нужно вашему организму для роста? При хорошей генетике и предрасположенности к набору мышечной массы, как минимум 1,5 грамма на каждый килограмм общего веса. Но наиболее распространенная рекомендация: 2-5 граммов белка/кг общей массы в сутки. Эту дозу белка следует разделить на несколько приемов в день.

Белок в вашем рационе может быть животного или растительного происхождения, больше всего его содержится в постном мясе, куриных грудках, индейке, рыбе, яйцах, твороге, красной фасоли и продуктах из сои. Прием Whey Protein Complex Artlab — один из способов получить очередную порцию легко-усваиваемого белка, когда обычная пища недоступна.

Для приготовления порции протеинового коктейля растворите одну мерную ложку белковой смеси (около 40 грамм) в 300 мл воды или молока. Коктейль рекомендуется принимать 1-2 раза в день. Обязательный прием должен состояться сразу после завершения силовой тренировки. При необходимости количество порций протеина в день можно увеличить.

Учитывайте, что атлетам склонным к набору лишнего жира не подходят высоко-углеводные смеси (гейнеры) и прием сывороточного протеина будет оптимальным решением, если вы намерены расти. Сывороточный протеин — это минимум углеводов, а также полное усвоение в течении первых 30 минут после приема, что позволяет избежать использование столь ценного белка на энергетические нужды организма.

Ингредиенты: сывороточный изолят (альфа-лактальбумин – 63%, L-лактальбумин – 11%, иммуноглобулин – 4%, BSA – 3%) Fonterra, Новая Зеландия, УФ сывороточный концентрат Armor Proteines S.A.S., Франция, сывороточный гидролизат(AminoWhey-TM), L – таурин, L – глютамин, L – лейцин, L – изолейцин, L – валин, L- карнитин Lonza Ltd., Швейцария, смесь витаминов DSM Nutritional Products, Швейцария, какао, ароматизатор идентичный натуральному Bell Farm Industrial, Великобритания, подсластитель, гуаровая камедь, сукцинат Na.

Содержание порции Whey Protein Complex Artlab 40 грамм

  

Энергетическая ценность	150 ккал
Белки	30 г
L-глютамин	2г
L–лейцин	0,8 г
L–изолейцин	0,4 г
L–валин	0,4 г
Углеводы	6 г
Жиры	Менее 1,2 г
Янтарная кислота	160 мг
Кальций	160 мг
Магний	200 мг
Натрий	160 мг
Калий	80 мг
Фосфор	104 мг
Цинк	10 мг
Добавленные витамины
Витамин C	53 мг
Витамин E	13 мг
Витамин B1	1,8 мг
Витамин B2	1,7 мг
Витамин B6	2,3 мг
Витамин B12	1 мкг
Витамин B3	15,7 мг
Витамин H	0,12 мг
Пантотеновая кислота	10,1 мг
Фолиевая кислота	0,36 мг
L–карнитин	80 мг

Аминокислотный профиль 100 грамм белка Whey Protein Complex

L– Аланин	4,76 г
*L– Аргинин	3,14 г
L– Аспарагиновая кислота	7,52 г
L– Цистеин	2,02 г
L– Глютаминовая кислота	22,38 г
L– Глицин	1,88 г
*L– Гистидин	1,46 г
*L– Изолейцин	6,73 г
*L– Лейцин	11,57 г
L– Лизин	7,44 г
L– Метионин	2,48 г
L– Фенилаланин	2,88 г
Пролин	5,18 г
L– Серин	4,58 г
L– Треонин	5,23 г
L– Триптофан	1,22 г
L- Тирозин	2,83 г
L- Валин	6,35 г
L– Таурин	2 г
* незаменимые аминокислоты на 100 грамм белка

1200р.

Новый белок. Готов ли российский рынок к альтернативным кормовым белкам — Журнал «Агротехника и технологии» — Агроинвестор

Легион-Медиа

Журнал «Агротехника и технологии»

январь – февраль 2020

Читать номер

Ежегодный общемировой дефицит кормового белка превышает 30 млн т, а в России он составляет около 2-2,5 млн т. По данным Союза комбикормщиков, в нашей стране проблема частично решается за счёт импорта около 2,2 млн т белкового сырья и расширения посевных площадей сои на 500 тыс. га.

Однако сложившаяся ситуация заставляет специалистов искать альтернативные способы производства кормового белка, открывая для бизнеса новые возможности. В тенденциях на рынке кормовых белков разбирался корреспондент журнала «Агротехника и технологии»

Корма представляют собой комплекс протеинов, аминокислот, витаминов и микроэлементов. Соответственно, эффективность кормов зависит от степени и качества сбалансированности по этим показателям, убеждён Сергей Глухих, научный руководитель компании «Метаника» (биотехнологическая компания, реализующая проект по синтезу белка из газа метана). «Невозможно вести интенсивное сельское хозяйство на базе не сбалансированных в соответствии с продуктивностью животных, птицы и рыбы кормов. А с позиции кормовой и продовольственной безопасности страны очень важно, чтобы перечисленные ингредиенты комбикормов не поступали из-за границы, а производились непосредственно в стране», — поясняет он. 

Главный балансирующий ингредиент кормов — белково-витаминный концентрат (БВК) или попросту белок. Причём в кормах он должен быть как животного, так и растительного происхождения, обращает внимание специалист, и вводить его нужно строго по нормам в зависимости от вида и возраста животных. 

Сергей Глухих напоминает, что источниками растительных белков выступают все злаковые, бобовые (соя), масличные культуры и др., вплоть до обычного сена и соломы. К белкам животного происхождения относится рыбная и мясокостная мука, сухие кормовые дрожжи, некоторые отходы перерабатывающей промышленности и БВК. 

Дефицит этого белкового продукта в России, как отмечает научный руководитель «Метаники», превышает 2 млн т в год. В среднем, по его данным, каждая тонна БВК полноценно балансирует до 20 т комбикормов. 

«В советское время проблему пытались решать разными способами, вплоть до производства кормовых белков из отходов нефти. И, надо сказать, достигли определённых успехов: объём производства довольно качественного продукта превышал 1 млн т», — рассказал Алексей Аблаев, к. т.н., президент Российской биотопливной ассоциации.

По его словам, в начале 1990-х годов на российском рынке появились большие объёмы сои по бросовым ценам, и это уничтожило промышленное производство кормовых белков из альтернативных источников. Дефицит стали восполнять сначала за счёт поставок североамериканской, а затем южноамериканской сои, что поставило российских сельхозпроизводителей в зависимость от конъюнктуры мировых рынков.

Одновременно с этим за последние 10 лет в связи с изменением климата и истощением водных ресурсов в несколько раз выросли цены на рыбную муку, что сделало её дорогой альтернативой традиционным кормовым белкам, продолжает Алексей Аблаев.

«Дефицит объясняется, во-первых, нехваткой рыбной муки, мировое производство которой составляет всего 5-6 млн т в год, из-за ограниченности ресурсов мирового океана, — добавляет Сергей Глухих. — К тому же на рынке часто встречается фальсифицированная продукция». 

Ещё одна причина, которую выделяет Сергей Глухих, — уничтожение в процессе перестройки биотехнологической промышленности, которая некогда планировала полностью обеспечить сельское хозяйство БВК, производимыми на гидролизных и биохимических заводах, а также заводах БВК, работавших на очищенных парафинах нефти и лёгких углеводородах.  

Кроме того, к дефициту, по его мнению, привело уничтожение заводов по производству кристаллической аминокислоты — лизина, который мы сегодня импортируем (в основном из Китая), причём в более примитивном виде лизин сульфата. Хотя, добавляет Сергей Глухих, в последнее время в России стали уделять внимание развитию данного направления — введены в строй несколько заводов по производству лизина.

Он сообщил, что в результате сложившейся ситуации зоотехники восполняют дефицит кормового белка за счёт сои, в большинстве случаев генномодифицированной, или же добавляя в корма больше зерновых составляющих, что неэффективно и экономически не выгодно.

«Поскольку климатические условия многих регионов нашей страны не подходят для выращивания сои,  большую её часть на рынке традиционно составляет импорт, — напоминает Алексей Аблаев. — И, несмотря на то что в последние годы посевы сои в России растут, дефицит кормовых белков продолжает оставаться проблемой, вынуждающей специалистов искать другие источники получения протеинов».

Где взять кормовой белок? 

По оценке Евгения Лунеева, члена совета директоров компании «Протелюкс» (производство кормового протеина из природного газа), объём мирового рынка кормовых протеинов достигает $ 30-40 млрд. При этом рынок протеинов животного происхождения составляет $ 18-25 млрд. К слову, основной объём выпуска сегодня приходится на рыбную муку ($ 8-10 млрд). Однако, как признаёт специалист, дальнейший рост производства рыбной муки сдерживается ограниченными объёмами водных биоресурсов мирового океана, которые можно вылавливать без угрозы нарушения экологического баланса.

Это, по его мнению, позволяет предположить, что основной рост производства будет обеспечиваться за счёт одноклеточных протеинов — водорослей, бактерий, грибов, дрожжей. Ожидается, что среднегодовые темпы роста сегмента превысят 8 %.

Сергей Глухих рассказал, что современная наука (в первую очередь, биотехнология) позволяет производить белок из широкого ассортимента сырья. Главное, чтобы это сырьё было доступно и стоило как можно меньше. Так, в качестве сырья могут выступать отходы перерабатывающей промышленности (мясопереработки, молочной, масложировой, мукомольной промышленности и др.) и сельского хозяйства.

«Уникальным источником протеина в рационах животных и птицы является дрожжевой белок из отходов пищевых и перерабатывающих производств:  свекловичный и спиртовой жом, пивная дробина, спиртовая барда, различные кофейные жмыхи, отходы крахмало-паточного производства», — считает Сергей Перегудов, генеральный директор компании «Биокомплекс» (утилизация и переработка отходов). По его словам, получение белка путём их переработки позволяет увеличить объёмы производства более дешёвых кормовых добавок.

Однако, как замечает специалист, высокая волатильность цен на зерно в России не позволяет делать прогнозы на среднесрочную и дальнесрочную перспективу (хотя бы на ближайшие 5-10 лет) при реализации инвестиционных проектов, например, по переработке спиртовой барды и пивной дробины. «Поэтому тем, кто занимается такими проектами, интереснее ориентироваться на экспорт, который к тому же выгодно отличается высоким уровнем экспортных цен, — уверен он. — Кроме того, в европейских и азиатских странах, в отличие от России, альтернативные белки уже давно присутствуют в рецептуре кормов для сельскохозяйственных животных и пользуются повышенным спросом».

Так, по данным Сергея Перегудова, в Европе доля зерновых в структуре корма составляет 50-70 %, а остальные 50-30 % приходятся на альтернативный белок, полученный преимущественно путём переработки отходов пищевых производств. Тогда как в российском кормопроизводстве превалирует зерновое сырьё, доля которого доходит порой до 90 %.

По мнению Сергея Глухих, самым перспективным направлением в настоящее время является производство БВК из природного газа и его гомологов, а также из сжигаемого на нефтяных месторождениях попутного нефтяного газа (ПНГ), шахтного метана и биогаза. Специалист уверен, что зоотехники всех направлений животноводства помнят этот белок: в советское время он назывался гаприн.  

Поясним, в чём заключается суть процесса производства. Метанотрофные («поедающие метан») бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами. 

По словам Сергея Глухих, разработки в этой области начали вестись ещё в 60-х годах прошлого века. Ранее подобные корма пытались получать из нефти, но состав сырья не позволял гарантировать экологическую безопасность конечного продукта. Требовалось проведение глубокой очистки, что существенно повышало его себестоимость. «В современном, доработанном виде данная технология позволяет решить проблемы, связанные с экологией и охраной природы, снизить цену БВК, сделав его более доступным, и в конечном итоге снизить цену продуктов питания», — подчёркивает специалист. 

Алексей Аблаев также считает, что получение кормовых белков из бактерий и газа является растущим сегментом рынка с большим потенциалом.

«К сожалению, подобные проекты нуждаются в инвестициях, которых современной отечественной биотехнологии критически не хватает, — добавляет Вячеслав Лень, генеральный директор компании «Метаника». — Если в Советском Союзе было создано целое министерство, курирующее данную сферу, то сейчас развитием технологии пытаются заниматься буквально несколько компаний».

Белок из газа

Проектов по производству биопротеина мало, но тем не менее они есть. Так, Алексей Аблаев рассказал, что первый в стране масштабный проект по промышленному производству кормового биопротеина был запущен в 2018 году компанией «Протелюкс», которая приобрела у датской Unibio эксклюзивную лицензию на использование в России технологии по переработке природного газа (метана) с помощью бактерий в объёме до 1 млн т в год.

Кстати, в начале декабря стало известно, что Unibio привлекла дополнительный капитал от корпорации Mitsubishi, которая планирует инвестировать средства в том числе в производство белка из метана.

Как объяснил Евгений Лунеев, биопротеин представляет собой нейтральный порошок, содержащий в составе до 72-75 % аминокислот (протеина), при этом источником белка является бактерия Methylococcus capsulatus, питающаяся природным газом. Он производится при помощи естественного процесса и не содержит токсинов. Технология экологически безопасна: выбросы углерода и азота при производстве сведены к минимуму.

По словам члена совета директоров «Протелюкса», технологический процесс разделён на несколько этапов. На первом газы вводятся в петлю ферментера и перемешиваются с жидкостью, пока не разделятся в свободном пространстве петли. Промышленный чистый кислород используется для процесса ферментации. Затем раствор из воды и химикатов добавляют в ферментер. Химикаты регулируют pН. После гомогенизации биомассу высушивают в сушилке и хранят в мешках или бункерах. Как заявляют авторы проекта, на производство 105 тыс. т продукции затрачивается 220 млн куб. м природного газа в год.

В 2020 году завод, расположенный в г. Ивангороде Ленинградской области, планируется вывести на мощность 5,8 тыс. т готовой продукции в год с возможностью увеличения до 20 тыс. т. Пока он находится в стадии опытно-промышленной эксплуатации. Ведутся переговоры с производителями кормов о продаже готовой продукции. Отгружено несколько тестовых партий. «По содержанию белка биопротеин близок к рыбной муке и по цене будет сопоставим», — обещает Евгений Лунеев.

В рамках развития проекта в течение следующих 10 лет предполагается построить до 10 заводов по выпуску биопротеина. «На базе технологии в России будет создана новая высокотехнологичная отрасль с оборотом более $ 1,5 млрд», — заявляет член совета директоров «Протелюкса». Также в планах компании обеспечение выхода продукции на экспортный рынок объёмом $ 12-15 млрд. 

«Если “Протелюкс” реализует свои планы в полном объёме, то потребность в других аналогичных проектах в России отпадёт. Но пока на рынке есть место для всех, кто сумеет предложить протеин по разумной цене: от дрожжевых протеинов до протеина из газа», — уверен Алексей Аблаев.

К слову, новые проекты не заставили себя ждать. Так, компания «Метаника» заявила о реализации на территории индустриального парка Свободной экономической зоны Севастополя проекта по созданию научно-технологического производственного комплекса по получению белка из метана — НТПК «Метан-Крым». 

По словам генерального директора «Метаники» Вячеслава Лень, изначально проект в своей основе базировался на том уровне технологии и оборудования, который был достигнут на полупромышленной установке, работавшей в Светлом Яре до 1995 года. Но в нынешнем виде технология существенно отличается от Светлого Яра, а также от решения датской Unibio и американской Calysta. Последняя, кстати купила норвежскую компанию BioProtein A/S. и привлекла к реализации проекта инвесторов, в числе которых Cargill и Mitsui Group.

«У нас нет внешнего рецикла КЖ (культуральной жидкости), и мы работаем на воздухе, а не на кислороде, что обеспечивает экономию электроэнергии, а это одна из основных составляющих в себестоимости биопротеина, — рассказал Вячеслав Лень про особенности используемой технологии. — На предприятии отказались от барботажного перемешивания, угнетающего клетки микроорганизмов. Кроме того, на новой производственной площадке нет контура охлаждения в ферментере (это ноу-хау компании) и нет постферментационного газа, как в Светлом Яре, благодаря чему можно производить тонну белка, тратя не более 2 тыс. куб. м газа». 

Также применяется совершенно другой подход к производственной культуре микроорганизмов. «У нас она смешанная, т. е. состоит из нескольких штаммов, каждый из которых выполняет свою важную роль, работая на результат, — объясняет руководитель проекта. — А всё внутреннее ламинарно-вихревое движение КЖ осуществляется за счёт применения ещё одного ноу-хау — специально разработанной смешивающей аэрирующей головки. Кстати, питательную среду мы можем готовить даже на морской воде». 

В итоге, по его словам, удаётся получить продукт с высокой долей сырого протеина в составе — 77-79 %. Содержание в нём незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов несколько выше, чем в рыбной муке. При этом цена конечного продукта, по прогнозу Вячеслава Лень, будет ниже. Что касается экономической составляющей, то, по расчётам компании, себестоимость производства не превысит $ 1 тыс. за тонну белка, а цена реализации составит более $ 1 тыс. за тонну. 

Однако животноводческим предприятиям не стоит тешить себя надеждой, что стоимость кормов снизится благодаря применению альтернативных источников белка. «О сокращении затрат на 1 кг корма за счёт альтернативного белка речи не идёт, — предостерегает Алексей Аблаев. — Речь главным образом идёт о том, чтобы они не выросли». 

В лучшем случае, по его прогнозам, затраты останутся на том же уровне. Но при отсутствии конкуренции со стороны других поставщиков протеина, цены однозначно будут расти. «Многое зависит от урожая сои и колебания цен на рынке — всё это оказывает влияние на остальные протеины», — добавляет Алексей Аблаев. Эксперт также подчёркивает, что стоимость кормового белка тесно связана с составом продукта, количеством протеина и его усвояемостью.

После ввода предприятия в эксплуатацию, а может быть, и значительно раньше, «Метаника» планирует войти в Союз производителей комбикормов, а также другие отраслевые союзы, что, как ожидает Вячеслав Лень, полностью решит вопрос сбыта готовой продукции. «Являясь научно-производственной компанией, мы видим заинтересованность потенциальных заказчиков в оборудовании для производства белка из метана», — отмечает он. По оценкам компании, спрос на новый продукт только в России составит не менее 400-500 тыс. т в год.

Ещё один проект, о котором необходимо рассказать, стоит несколько особняком от остальных и подразумевает превращение органических отходов газификацией в синтез-газ для синтеза метанола с последующим получением полноценных кормовых белков меприна, эприна. Также дополнительно можно синтезировать такие продукты, как этанол, водород и синтетическое экологическое топливо. 

«По такой технологии утилизации отходов птицеводства и животноводства реально получить в год из 150 тыс. т отходов 30 тыс. т кормового белка меприна или эприна», — заверяет Игорь Жарков, технический директор московского офиса компании RNR (проектирование и строительство заводов по газификации ТБО, отходов птицеводства, медицинских отходов, иловых осадков).

Проект включает в себя три составляющие: экологически безопасную утилизацию органических отходов без вредных выбросов и захоронений, превращение их в высококачественный кормовой белок, обеспечение птицефабрики или животноводческой фермы электроэнергией и теплом. «Таким образом аграрии могут значительно снизить себестоимость производства и не зависеть от поставщиков электроэнергии, тепла и белковых кормовых добавок», — отмечает Игорь Жарков. Он напоминает, что в себестоимости производства, например, мяса птицы, затраты на электро- и тепловую энергию составляют 7-10%, а затраты на корм достигают 50-65%.

Технологическая схема выглядит следующим образом. Сначала пиролизом утилизируется 85-95 % органики помёта и подстилки, а также другие производственные и бытовые отходы, вследствие чего получают пиролизный газ. Около 5-15 % золы идёт в минеральные удобрения и минерализируется в строительный песок. Дальше с помощью плазмы пиролизный газ преобразуется в синтез-газ, который, в свою очередь, перерабатывается в метанол и электроэнергию. После чего метанол перерабатывается в кормовой белок. Применяется полностью водооборотное снабжение водой и очистка воды с окислением в свехкритическом состоянии, что полностью предохраняет водоёмы от попадания вредных веществ.

Как объяснил Игорь Жарков, кормовой белок из метанола представляет собой инактивированную бактериальную биомассу ацидофильных метилотрофных бактерий, выращиваемых на средах, содержащих метанол. Специалист отмечает, что по качеству он соответствует кормовым белкам животного происхождения (рыбной и мясокостной муке). Продукт характеризуется высоким уровнем сырого протеина (не менее 70 %) и содержит весь комплекс витаминов группы В. Его продуцентом является факультативный метилотроф Acetobacter methylicum ВСБ-867. Штамм выделен из почвы, не патогенен и не токсичен.

«Технология позволяет получать полноценные белки из бесконечного источника — отходов, которые необходимо утилизировать для сохранения природы и здоровья людей. Кроме того, получаемые кормовые белки будут иметь конкурентную цену на рынке», — заключает Игорь Жарков.

Взгляд в будущее

«Для того чтобы получить растительный белок, нужны тысячи гектаров пахотной земли и огромный труд многих сельхозтоваропроизводителей, — рассуждает Вячеслав Лень, сравнивая различные источники альтернативных белков. — В то время как на производстве БВК трудятся миллиарды дрожжевых и бактериальных микроорганизмов, а процесс удвоения биомассы происходит в течение нескольких часов». 

Он подчёркивает, что синтетический белок получают пока только в научных целях химики, а вот биотехнология способна производить белок природный, т. к. в качестве накопительных культур используются штаммы микроорганизмов, первоначально взятые у природы с доработкой их продуктивности до норм рентабельного предприятия.  

Вячеслав Лень уверен: наиболее выгодной и перспективной технологией производства альтернативного кормового белка для нашей страны является та, что базируется на самом массовом, доступном, стабильном и недорогом сырье, а в России это — природный газ. «Диверсифицируя часть экспортных объёмов и перерабатывая газ в белок, мы способны не только решить проблемы с кормами и продуктами питания в стране, но и стать экспортёрами альтернативного белка с очень приличной добавленной стоимостью по сравнению с сырьевым экспортом», — заключает он. 

Заместитель директора по развитию ГК «ЗООПРОТЕИН» (производство кормов для животных из личинок мух) Алексей Истомин считает, что микробный белок (гаприн) как технология может глобально изменить рынок. «Но всё же одно дело — производить белок из природного сырья (метана), и совсем другое — использовать отходы для производства кормов», — делает оговорку специалист. 

Он напоминает, что рано или поздно природных ресурсов будет недостаточно, или же их использование нарушит природный баланс. «В случае с гаприном, опять же, используются природные ресурсы, и, хотя сегодня их много, в будущем, возможно, наступит та же дилемма», — не исключает Алексей Истомин.

Поэтому совершенно другое дело, по его мнению, — использование отходов, которые всегда будут в достаточном количестве. «С одной стороны, благодаря совершенствованию технологий объём отходов будет сокращаться, с другой, рост мирового населения будет способствовать его увеличению. В итоге эти два процесса уравновесят друг друга», — прогнозирует Истомин. Специалист уверен, что уже сейчас нужно решить задачу, как использовать отходы с максимальной выгодой. 

В свою очередь, Алексей Аблаев полагает, что производство протеинов из газа гораздо рентабельнее, чем, например, из насекомых или микроводорослей. Тем более если у компании есть доступ к месторождениям, позволяющим получить дешёвый газ (сырьё).  «При этом технологически такие проекты намного сложнее, и рисков больше, — отмечает Аблаев. — Метан в сочетании с кислородом под высоким давлением — взрывоопасная смесь и рецепт для катастрофы, поэтому такими проектами должны заниматься исключительно профессионалы».

В любом случае проблем со сбытом конечного продукта после запуска подобных предприятий не возникнет, убеждён президент Российской биотопливной ассоциации.  «При разумном соотношении качества и цены альтернативные протеины наверняка будут востребованы. Основными потребителями станут крупные агропромышленные предприятия и производители комбикормов», — говорит он.

Однако генеральный директор компании «Биокомплекс» Сергей Перегудов не разделяет оптимизма коллеги. «Вертикально-интегрированным холдингам интереснее расширять посевные площади и инвестировать в производство зернового белка, а не усложнять жизнь рискованными проектами. Да и зачем, если есть своё дешёвое зерно?» — задаёт он риторический вопрос.

Сейчас, по мнению Сергея Перегудова, надо сфокусироваться на точках роста, которые лежат на поверхности и не требуют больших затрат. «Например, в  РФ доля орошаемых земель составляет около 13 %, тогда как в мире орошается 48 % полей. Чувствуете точку роста? Достаточно установить дождевальную машину, и урожайность сои повысится на 150 %, пшеницы — на 100 %, кукурузы — на 150 %», — утверждает глава «Биокомплекса». Тем более, продолжает он, сегодня действует ведомственная программа «Развитие мелиоративного комплекса России» на 2020-2022 годы, предусматривающая субсидирование затрат на орошение в рамках одного проекта от 30 до 50 % в зависимости от региона.

Ещё один риск проектов по получению альтернативного белка — общественное мнение. Вернее, как уточняет Сергей Перегудов, потребительские фобии, сформированные СМИ, которые заставляют в штыки воспринимать все альтернативные, нетрадиционные продукты. «И как, например, в свете растущего тренда на экологизацию Группа “Черкизово”, продвигающая концепцию “от поля до прилавка”, впишет в свою зерновую цепочку альтернативный белок, синтезированный из отходов или природного газа? Как объяснит это потребителям?» — вопрошает Сергей Перегудов.

По мнению Алексея Аблаева, негативное отношение к альтернативному белку может исходить от экологов и определённой категории людей, которые любят поднимать панику, как только появляется новый продукт или технология. «Они либо не располагают достаточными знаниями, либо находятся во власти предрассудков и не способны здраво смотреть на вещи, — предполагает президент Российской биотопливной ассоциации. — Хотя есть и третий вариант: их мнение проплачено компанией, которая действует в своих интересах. Яркий пример — история с запретом ГМО».

Теоретически, рассуждает он, выступать против альтернативных способов получения белка выгодно российским компаниям, импортирующим сою из Южной Америки. Хотя пока масштабы производства протеина несопоставимы с объёмами импорта — несколько тысяч тонн картину на рынке не изменят. Пока это, скорее, экспериментальные проекты.

Загрузка…

Комплекс протеинов со спирулиной, 300г — Green Proteins

Многокомпонентный комплекс протеинов со спирулиной,  300г — Green Proteins

GREEN PROTEINS COMPLEX – ЭТО СБАЛАНСИРОВАННАЯ СМЕСЬ НАТУРАЛЬНЫХ И НАТИВНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТЕИНОВ (ПОДСОЛНЕЧНЫЙ, КОНОПЛЯНЫЙ, ТЫКВЕННЫЙ, КЕДРОВЫЙ), ПРОИЗВЕДЁННЫХ БЕЗ ТЕРМИЧЕСКОЙ И БЕЗ ХИМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ С ДОБАВЛЕНИЕМ ПЕРЕМОЛОТОЙ ПИЩЕВОЙ ВОДОРОСЛИ СПИРУЛИНЫ.     

• без ГМО, лактозы, сои и глютена; 
• полный состав аминокислот; 
• витамины и минералы; 
• приятный вкус;
• хорошо усваивается организмом.

Green Proteins Complex – обладает приятным вкусом и запахом. Его можно легко размешать в воде, идеально сочетать с растительным молоком, использовать как основу для полезного фруктового смузи, добавлять в каши или в другие блюда домашнего приготовления.

GREEN PROTEIN COMPLEX содержит 2 грамма спирулины в каждой порции, что в совокупности с большим содержанием белка составленным из четырёх растительных протеинов создаёт уникальную гармонию питательных веществ, которые не только полезны и необходимы организму, но и приятны на вкус! По-настоящему, суперфуд.

Все виды растительного белка имеет свою сильную сторону, пользу и определённый аминокислотный состав. Но в совокупности они могут давать синергетический положительный эффект за счёт сбалансированного аминокислотного состава, комплекса витаминов, минералов, а также различных благоприятно действующих веществ.  

ПОДСОЛНЕЧНЫЙ ПРОТЕИН. Универсальный и качественный по своему происхождению растительный белок из ядер подсолнечника. Сильный аминокислотный состав, хорошее усвоение, приятный и знакомый вкус семечек. В составе богатый состав витаминов, особенно Е и В6, а также минералов — кальций, магний, калий, фосфор, селен.
Большой интерес в составе семечек и белка на их основе представляет хлорогеновая кислота, которая имеет целый ряд полезных свойств: жиросжигание и улучшение обмена веществ, снижение уровня сахара в крови, улучшение состояния кожных покровов  и стенок сосудов, оказывает антимикробное и противовоспалительное действие, положительно воздействует на костно-мышечную систему, сильный антиоксидант.

КОНОПЛЯНЫЙ ПРОТЕИН. Один из наиболее экзотических и популярных видов растительного белка. Производится из ядер конопля и имеет полный аминокислотный состав, в том числе и все незаменимые. Конопляный протеин является хорошим источником клетчатки, которая в качестве натурального сорбента нормализует работу кишечника, очищает организм от токсинов и шлаков, снижает уровень холестерина.  
Содержит полиненасыщенные жирные кислоты Омега-3, причём в идеальном соотношении к Омега-6, а именно 1 к 3. Это полезный жир, который благоприятно влияет на работу мозга, сердечно-сосудистой системы и суставы, улучшает здоровье кожи и волос.

ТЫКВЕННЫЙ ПРОТЕИН. Семечка тыквы очень богата белком, за счёт этого содержание протеина в продукте достигает 70%. Белок по составу выделяется большим содержанием незаменимой аминокислоты триптофан, которая благоприятно влияет на нервную систему и настроение. Источником серотонина, так называемого «гормона счастья» является  именно эта незаменимая аминокислота. Триптофан позволяет нормализовать качество и продолжительность сна.
В белке семечки тыквы много и других незаменимых аминокислот. Например, лейцин, изолейцин и валин дают в сумме аж 17,8 мг. на 100 г. белка.  Содержание глицина, аргинина и метионина в сумме составляет  26 мг. на 100 г. белка, что важно для синтеза организмом креатина, который благоприятно влияет на силовую выносливость и рост мышечной массы.

КЕДРОВЫЙ ПОРТЕИН. Кедровый протеин обладает всеми полезными свойствами кедрового ореха, но в концентрированном  виде. В сравнении с обычным кедровым орехом кедровый протеин имеет в 4 раза больше легкоусвояемого белка, содержащий все незаменимые аминокислоты и в 6 раз меньше жирность. 
Невероятно богат на содержание микро-, макроэлементов  и витаминов, которые также находятся в своём естественном природном состоянии: А, Е, К, В1, В2, В3, В5, В6, В9, С.

СПИРУЛИНА. Морская водоросль спирулина обладает уникальным составом, который включает в себя около двух тысяч биологически активных веществ, витамин, аминокислот и ферментов.  Её используют в космосе для жизнеобеспечения на борту космических кораблей во время длительных миссий, а Всемирная Организация Здравоохранения отнесла её к наиболее ценным источникам питательных веществ на Земле.
Стоит отметить содержание в спирулине витаминов группы В и В12, в том числе, которые имеют большое влияние на состояние нашего здоровья, поддерживают иммунитет, работу нервной системы, контролируют рост тканей. Это особенно важно для тех, кто придерживается веган питания, ведь, как правило, риск дефицита В12 и цинка выше у тех, кто придерживается растительной диеты, исключающей мясо или молочные продукты.

ИНГРЕДИЕНТНЫЙ СОСТАВ: концентрат подсолнечного белка, концентрат конопляного белка, концентрат тыквенного белка, концентрат кедрового белка, спирулина
ПРЕИМУЩЕСТВА: высокоэффективная смесь четырёх натуральных протеинов; 2 грамма спирулины в каждой порции; концентрация полезных веществ; очень богатый комплексный состав витаминов и минералов; все компоненты в естетсвенном природном состоянии, в том числе витамины, белок не денатурированный; не содежит искусственных добавок, без красителей, ароматизаторов и прочего; без ГМО, без сои и глютена; спирулина сочетатся с белковым комплексом, что даёт приятный вкус, даже, на воде.
ДЛЯ ЧЕГО: здоровье и иммунитет; набор мышечной массы; сжигание лишних жиров; сила и выносливость; красота кожи, волос, ногтей.
ПИЩЕВАЯ ЦЕННОСТЬ 100г: Белок — 60г; Жир — 8 г; Углеводы — 15; Энергетическая ценность 354 кКал.

О поставщике

Green Proteins – производитель натуральных нативных протеинов, изготавливаемых без термической и без химической обработки. Вот, что ребята пишут о себе:

«Мы уже более 3 лет работаем на рынке полезного, спортивного и веганского питания. Вывели на рынок продукты, которые получили широкую известность и зарекомендовали себя. Это «Протеин Спецназ» и «СанПротеин».

В производстве нашей продукции мы стремимися всегда использовать только экологичные, природные и разлагаемые компоненты, чтобы распространять и поддерживать ценности этичного взаимодействия с окружающей средой».

Купить комплекс протеинов  в Минске вы всегда можете в Шанти Лавке

Протеин – действие протеина, виды и побочные эффекты

Протеин — спортивная добавка, состоящая из концентрированной белковой смеси. Белок является основным строительным материалом для мышц и одним из главных компонентов спортивной диеты. Активный рост мышечной массы возможен, когда потребность в протеине удовлетворена. Обеспечить организм качественным белком без добавок сложно, поэтому на помощь приходит спортивное питание.

Виды протеина

Выделяют разные виды белка, различные по составу, скорости усвоения и назначению.

Сывороточный протеин

Быстрый протеин представляет собой белок, отличающийся стремительной абсорбцией. К такой категории относятся все белки, входящие в молочную сыворотку, а также белки из продуктов животного происхождения (рыба и мясо). Последние применяются в производстве редко. Быстрый сывороточный протеин предназначен для стремительного увеличения мышечной массы. Он способен повысить содержание аминокислот в организме, что особенно актуально после спортивных занятий. Для лучшего усвоения сочетайте его с приёмом аминокислотного комплекса BCAA.

Сывороточный протеин пойдёт на пользу всем, кто занимается спортом и хочет увеличить объём мышц.

Особенности приёма зависят от целей:

1. При высоком обмене веществ и отсутствии лишнего веса белок принимается несколько раз в день. Идеальное время для приёма – после пробуждения и в завершение занятия. Также рекомендуется употреблять белок между приёмами пищи и за 1,5 часа до нагрузок, то есть по 3–5 30-граммовых порций в день.
2. Людям, желающим сбросить вес, нужно пить белок перед тренировкой, после неё и утром. При похудении нужно принимать комплексный протеин (о нём ниже), но утром и после тренировки можно принимать и сывороточный в количестве 50% от рекомендуемой порции (то есть по 15 г).

Три формы быстрого белка:

1. Концентрат обладает средней степенью очистки. В его составе есть лактоза и немного ненасыщенного жира. Концентрат усваивается на 90% в течение 3–4 часов. Плюс — невысокая цена.
2. Изолят — это обработанный концентрат, который содержит до 97% чистого белка. Его полное усвоение длится 3 часа.
3. Гидролизат – самая дорогая версия сывороточного белка. Он частично разрушен ферментами, что намного ускоряет абсорбцию. Следует учитывать, что он повышает выделение инсулина.

Какая форма быстрого протеина предпочтительна? Ряд исследований показывает, что при интенсивных тренировках и соблюдении диеты любой вид сывороточного протеина даёт отличный эффект. По этой причине бессмысленно платить большие деньги за гидролизат.

Казеин

Казеин – один из самых популярных видов протеина среди профессиональных бодибилдеров. Медленный протеин получают в результате ферментного преобразования молока. Попадая в организм, такой сложносоставной белок переваривается долго. В это время он даёт необходимые аминокислоты.

К плюсам медленного протеина относится гипоаллергенность. Он незаменим для спортсменов с аллергией на быстрый или яичный белок.

К сожалению, медленное усвоение казеина приводит к торможению усвоения других видов белка. Кроме того, он имеет низкую биологическую активность и может снижать аппетит. В последнее время стал доступен мицеллярный казеин, который лучше усваивается и обладает приятным вкусом, но стоит дороже.

Когда следует принимать казеин:

1. 1. При наборе мышечной массы такой вид белка не рекомендован. Его целесообразно употреблять только на ночь в сочетании с сывороточным белком. Если вам приходится пропустить приём пищи, можете принять 30–40 г белка, чтобы остановить разрушение мышечной ткани. Размер порции составляет от 30 до 45 г.
   2. Казеиновый протеин можно использовать при похудении для устранения чувства голода. Если необходимо ускорить сжигание жира, следует принимать казеин на ночь. Он оказывает термогенный эффект и снижает аппетит, что поможет с ночным голодом и перееданием. Во время диеты коктейли из казеина можно пить 3–4 раза в день: утром, перед занятием, в перерывах между едой и на ночь. Порция составляет 15–20 г.

Протеиновый комплекс

Комплексы представляют смесь разных видов белков. Они дают максимальное содержание аминокислот в крови и мышцах через короткое время после приёма, при этом обеспечивают ткани питательными веществами на долгое время.

Комплексные протеины можно принимать для различных целей: они помогут тем, кто хочет набрать мышечную массу, снизить вес или поработать над рельефом. Однако исследования показывают, что сывороточный протеин является более эффективной добавкой.

Кратность приёма и дозировка зависит от целей:

1. При желании увеличить массу стоит принимать протеин перед сном, чтобы мышцы были обеспечены необходимыми веществами ночью. Также его можно использовать вместо сывороточного белка за несколько часов до занятия. После тренировки лучше отдать предпочтение быстрому протеину. Можно принимать протеиновый комплекс вместо основной пищи, когда нет возможности полноценно поесть. Если в течение нескольких часов не удаётся поесть, следует выпить 30 г комплексного протеина.
2. Режим приёма во время похудения схож со схемой данной выше. Пейте протеин перед сном и в периоды длительного отсутствия пищи. Также им можно заменить 1 или 2 приёма пищи. Порция должна быть в 2 раза меньше, то есть всего 15 г.

Таким образом, сывороточный протеин считается самым эффективным видом данной добавки. К его минусам относится большой расход при высокой цене. При необходимости вы можете успешно сочетать его с более экономичным комплексным белком или казеином.

Возможные побочные эффекты протеина

Существует мнение, что спортивное питание (в частности, протеин) может вызвать серьёзные побочные эффекты, а при долгосрочном применении значительно ухудшить здоровье. В действительности отрицательное влияние протеина на организм не имеет научных подтверждений.

Протеиновые добавки можно использовать мужчинам и женщинам в любом возрасте. Это не приведёт к ухудшению здоровья, так как протеин производится путём особой очистки из пищевого сырья. То есть белок имеет естественное происхождение и направлен на то, чтобы помочь нашему телу справиться с интенсивным уровнем современной жизни.

Это не отменяет вероятности индивидуальной непереносимости белка. Обычно она проявляется в виде аллергической реакции или как расстройство пищеварения. С последним можно успешно бороться, применяя дополнительные ферменты или снизив дозу добавки.

Ещё одним побочным явлением могут стать запоры. Они вызваны неправильной диетой и недостаточным потреблением жидкости. При корректировке питания и достаточном питье эта проблема быстро решается.

Протеин – это удобная добавка, которая значительно упрощает жизнь современным спортсменам, позволяет ускорить прогресс от тренировок и при необходимости может быть использована в качестве заменителя пищи.

Многокомпонентный протеин * Лучший комплексный или сывороточный

Выбор протеина может превратиться в головную боль, если Вы не сильно разбираетесь в специфике этого товара. В этой статье мы подробно расскажем о многокомпонентных протеиновых добавках.

Комплекс протеинов – из чего состоят и кому нужны?

 

Комбинированный протеин – это союз из нескольких видов белка (казеин, сывороточный и другие), каждый из которых обладает уникальным перечнем свойств и преимуществ.

Комбинация из яичного, сывороточного и казеинового протеина считается лучшей при регулярных физических нагрузках. Состав яичного и сывороточного белков обогащён необходимыми аминокислотами (в т.ч. БЦАА). Они быстро усваиваются и мгновенно наполняют организм полезными веществами. Казеин же характеризуется медленным темпом усвояемости, что позволяет равномерно подпитывать организм в течение 6-8 часов после приёма.

Нередко в составе комплексных протеинов можно найти соевый белок, который насыщает организм аргинином и повышает секрецию гормона роста.

Комплексные протеины подойдут и для набора мышечной массы, и для снижения веса. Вне зависимости от целей спортсмена, эта добавка дополнит рацион питания и незамедлительно продемонстрирует положительный эффект.

Как принимать многокомпонентный протеин?

Универсальность добавки позволяет принимать протеин в любое время и для любых задач. Но всё же следует скорректировать время и кратность приёма, в зависимости от желаемого результата.

Для набора массы. Идеальное время приёма – перед сном. Быстрые белки моментально снабдят ваши мышцы важными аминокислотами, а медленные будут перевариваться во время сна. Также не лишним будет порция протеина, если ожидается большой промежуток без пищи.

Для рельефа. Принимайте в перерывах между приёмами еды. Тандем быстрых и медленных белков будет долго насыщать организм.

Важно! Из-за наличия казеина (медленного белка) в составе, следует принимать добавку более чем за 2 часа до тренировки. Иначе во время тренировки возможен дискомфорт в желудке.

Что лучше – сывороточный или комплексный протеин?

Для того чтобы разобраться в этом вопросе следует сравнивать эти 2 варианта.

Сывороточный протеин:

• обладает высокой скоростью усвоения;
• мгновенно насыщает организм всеми необходимыми аминокислотами;
• ускоряет процесс построения мышечной массы;
• имеет богатый состав аминокислот;
• доступная стоимость.

Комплексный протеин:

• содержит в составе медленные белки;
• полноценно дополняет дневной рацион спортсмена;
• идеально подходит при отсутствии возможности принять обычную пищу.

Каждый вид протеина имеет свои преимущества. Выбрать сывороточный или многокомпонентный – решать только Вам. Но, если соотносить эти виды добавок с сушкой и набором массы, то, скорее всего, будет так: сывороточный протеин (иззолят, гидролизат) – сушка; многокомпонентный – набор массы.

Не стоит забывать, что большинство комплексных протеинов на 70-80% состоят из сывороточного белка, потому очень большой разницы между ними нет.

Лучший многокомпонентный протеин – ТОП 3!

Очень часто недобросовестные производители в погоне за удешевлением товара, добавляют в состав растительные белки, у которых большое количество недостатков. Для того, чтобы Вы не тратили деньги на некачественный продукт, мы составили список из трёх достойных конкурентов в звании «Лучший комплексный протеин».

Syntha 6 BSN

Состав добавки включает в себя сразу 6 видов протеина. Один коктейль на основе Синты 6 будет поддерживать баланс аминокислот в организме до 6-7 часов. В процессе изготовления не использовались различные примеси, которые могут повредить работе организма.

Безусловным преимуществом, которое отмечают все, кто хоть раз попробовал продукт, является неповторимый вкус. Он заставит Вас по-новому взглянуть на спортивное питание.

Состав

Шесть видов белка с разной скоростью усвоения не позволят организму впасть в процесс голодания, и тем самым разрушать мускулатуру.

В одной порции (44 г):

• Белок – 22 г;
• Жиры – 6 г;
• Углеводы – 15 г;
• 200 калорий.

Помимо основных элементов в состав включены такие вспомогательные вещества:

• глютамин;
• папин;
• бромелайн;
• кальций;
• фосфор;
• БЦАА;
• другие.

Глютамин улучшает состояние иммунитета и способствует ускорению набора мышечной массы. БЦАА замедляют процесс катаболизма, а бромелайн и папин облегчают усвоение повышенных порций белка.

Syntha 6 от BSN – протеин, который удовлетворит как новичков, так и профессионалов. Сбалансированный состав и качественный белок помогут достичь любых целей в тренажерном зале.

Chaos and Pain Cannibal Cronus

Известный производитель спортивного питания Chaos and Pain сделали протеин Cannibal Cronus, который выгодно выделяется своим разнообразием белка в составе. Компания решила не ограничиваться стандартным сывороточным протеином, и добавила в состав еще и яичный, мясной, гороховый и пшеничный белки. Каждый компонент будет отвечать за свои задачи и покрывать отдельные потребности. Подобный союз способен выдать максимально эффективный результат!

Белок – это строительный материал мышечной массы. Увеличив количество потребляемого протеина (в разумных пределах), ускорится процесс наращивания мышечных волокон.

В сфере бодибилдинга уже не первый десяток лет спорят о лучшем источнике для получения белка. Точного ответа нет. Но можно с уверенностью заявить, что разная скорость усвоения белков в составе одного коктейля только улучшит конечный результат!

Состав

В одной порции (29 г):

• Белок – 22 г;
• Жиры – 1,5 г;
• Углеводы – 4г;
• 124 калории;
• другие компоненты (среди которых: Витамины группы А и С, кальций, и др.).

Главной целью данного продукта является скорейшее восстановление организма после тренировочного стресса.

Syntrax Matrix 5.0

Уже долгие годы один из лидеров в сегменте комплексных протеинов. После появления на рынке он стремительно завоевал популярность среди опытных спортсменов со всех уголков мира. Главный принцип компании Syntrax: использовать составляющие высочайшего качества. Производитель не приемлет дешевые формы протеина, к которым часто прибегают конкуренты. Этот факт обусловил лояльность и любовь потребителя.

Формула Матрикс 5.0

Уникальная формула Матрикс 5.0 включает в себя следующие основные компоненты:

• сывороточный белок;
• молочный;
• яичный;
• глютамин;
• мицеллярный казеин.

Сывороточный протеин – бессменный лидер среди белковых добавок. Его качество, эффективность и высокий анаболический отклик доказан не одной группой учёных.

Молочный протеин – отличается от сыворотки только скоростью усвоения (у молочного – она ниже).

Яичный протеин – белок с идеальным аминокислотным составом и высоким показателем скорости усвоения.

Глютамин – аминокислота, которая поддерживает тело в тонусе и повышает работоспособность.

Мицеллярный казеин – медленный белок, который будет равномерно расщепляться в течение 6-7 часов после приёма.

Состав

В одной порции (32 г):

• Белок – 23 г;
• Жиры – 2 г;
• Углеводы – 3 г;
• другие витамины, минералы и полезные вещества.

Заключение

Комплексные протеины – отличный способ восполнить недостаток белка в суточном рационе питания. Одна порция добавки не только моментально снабдит Вас аминокислотами, но и растянет период полезного действия на длительный промежуток. В это время Вы можете не беспокоится о том, что организм не будет получать необходимых веществ. Многокомпонентный протеин обо всём позаботится за Вас!

Идентификация белкового комплекса и количественный комплексом с помощью CN-PAGE

Дизайн эксперимента и воспроизводимость данных

Количественные протеомные исследования на основе ЖХ-МС / МС дают большие и информативные наборы данных, но подвержены большим вариациям, что отрицательно влияет на статистический анализ. Поэтому настоятельно рекомендуется обезопасить себя от технических изменений, разработав строгие и строгие рабочие процессы ¹⁴ . Следует проявлять особую осторожность при выборе подходящих методов, используемых для экстракции белковых комплексов, фракционирования и пробоподготовки для масс-спектрометрии, любой из которых или все они могут служить источником технических вариаций.Имея это в виду, мы разработали рабочий процесс, позволяющий обрабатывать экстракты природного белка для сравнительного анализа комплексома растений в различные суточные моменты времени. В этом подходе выделенные белковые экстракты разделяются нативным фракционированием в ПААГ с последующим изменением процедуры расщепления в геле и анализом тандемной масс-спектрометрией (рис. 1). Native-PAGE был выбран для разделения белков по сравнению с обычно используемым SEC, потому что он обеспечивает простое, эффективное и экономичное решение для фракционирования белка ^10,12,15,16 .Это также позволяет создать экспериментальный план, при котором можно приготовить несколько копий образцов и запустить их параллельно на одном геле. Это, в свою очередь, снижает риск внесения дополнительных технических изменений, которые обычно связаны с подготовкой и разделением проб.

Рисунок 1

Визуальное представление экспериментального рабочего процесса, используемого для изучения комплексных изменений. Схематическое изображение рабочего процесса, используемого для изучения изменений в белковом комплексоме. Белковые экстракты получали из полностью разросшихся листьев Arabidopsis thaliana в нативных условиях и разделяли с помощью нативного PAGE.Затем белки переваривали с использованием модифицированной процедуры расщепления в геле, а пептиды обессоливали с использованием колонок C18. Полученные пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС / МС, а необработанную спектральную информацию экспортировали в MaxQuant для идентификации белков и количественного определения без метки на основе пиков. Все последующие анализы данных были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R.

В качестве доказательства концепции исследования мы решили проанализировать Arabidopsis thaliana Col-0 растений, собранных в конце светового периода (ED), когда растения являются фотосинтетически активными, и в конце ночи (EN), когда рост растений зависит от внутренних запасов углерода.Нативные белки и интактные белковые комплексы экстрагировали из четырех биологических повторностей при 4 ° C в буфере, не содержащем детергента, и разделяли с использованием 1D нативного PAGE. Нативный гель, приготовленный для этого исследования, показал высокую воспроизводимость разделения белков для всех дорожек. Это было необходимо для получения 20 фракций для каждого из восьми биологических образцов путем разрезания геля по всей ширине (дополнительный рис. 1). Чтобы свести к минимуму технические вариации и загрязнение, фракции образцов были подготовлены для масс-спектрометрического анализа с использованием HiT-Gel, недавно разработанного высокопроизводительного метода разложения в геле ¹⁷ .Необработанные спектральные данные 160 фракций образца были обработаны с помощью MaxQuant. Мы идентифицировали 2338 белков на основе уникальных пептидов в ED и 2469 в EN с перекрытием 88,3% между двумя условиями (рис. 2). Высокая степень перекрытия является предпосылкой для точного сравнения изменений комплексома при ED и EN. Перекрытие между биологическими повторами при ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна (рис. 2) с перекрытием 92,5% (ED) и 87,6% (EN). Мы рассчитали коэффициент вариации (CV), используя относительное содержание белков всех идентифицированных белков в четырех биологических повторностях в обеих временных точках.Результат был представлен в виде гистограммы с нормальной кривой (дополнительный рис. 2A, B). Мы также использовали относительное содержание белков для всех идентифицированных белков в качестве входных данных для корреляционного анализа Пирсона между всеми возможными парами биологических реплик одного и того же состояния (рис. 2D). В каждом из парных сравнений мы обнаружили корреляцию выше 0,9. Таким образом, мы можем сделать вывод, что наш экспериментальный рабочий процесс приводит к воспроизводимым протеомным данным с большим количеством совпадений в идентифицированных белках и низкой вариабельностью от образца к образцу.Чтобы определить, не является ли высокая воспроизводимость между нашими экспериментами следствием горизонтального переноса, мы проводим дополнительный эксперимент. Такое же количество белкового экстракта (300 мкг) обрабатывали на двух центральных дорожках геля для электрофореза в ПААГ. Десять случайно выбранных гелевых фракций вырезали, обрабатывали и анализировали с помощью ЖХ-МС / МС (дополнительный рис. 2С). Всего было идентифицировано 20 белков, что предполагает минимальный горизонтальный перенос между полосами геля. Большинство идентифицированных белков аннотировано одним пептидом (дополнительный рис.2D).

Рисунок 2

Оценка идентификации и воспроизводимости белков в наборах данных. Количественная оценка необработанной спектральной информации без метки была выполнена в MaxQuant для создания наборов данных по белкам в ED и EN. ( A ) Перекрытие между всеми идентифицированными белками в ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна. ( B ) В качестве меры воспроизводимости было рассчитано перекрытие 4 биологических повторов в ( B ) ED и ( C ) EN и визуализировано в виде диаграммы Венна.( D ) Корреляционную матрицу Пирсона использовали в качестве дополнительной меры воспроизводимости на уровне белка. Коэффициенты корреляции рассчитывались для белков попарно по всей матрице для каждой фракции каждой биологической реплики по сравнению с другой.

Профилирование белков и деконволюция профилей

Основной целью нашего исследования было создание эффективного метода сравнительного анализа белковых комплексов. После идентификации и количественной оценки белков были рассчитаны профили миграции всех белков по градиенту молекулярной массы, чтобы позволить дальнейший анализ данных, такой как кластеризация, идентификация белковых комплексов и статистический анализ изменений в содержании белковых комплексов между ED и EN.

В основе нашего конвейера обработки данных лежит статистическое программное обеспечение R. Наш конвейер анализа данных начинается с реконструкции профилей миграции белка путем объединения соседних фракций, вырезанных из геля. На следующем этапе мы идентифицировали локальные максимумы (пики) вдоль градиента молекулярной массы для каждого белка, используя функцию точек поворота (пакет pastecs) в R (рис. 3). Локальные максимумы были отфильтрованы, чтобы удалить максимумы ниже 20% от наивысшего относительного содержания вдоль профиля белка.

Рисунок 3

Схематическое изображение деконволюции профиля белка. Один белок из эксперимента ED был выбран в качестве примера, чтобы проиллюстрировать процедуру деконволюции профиля белка. В этом случае профиль элюции выбранного белка можно упростить до четырех отдельных пиков. На первом этапе алгоритм определяет локальные максимумы в сложном профиле элюирования. После определения локальных максимумов выполняется строгий процесс фильтрации для выявления отдельных пиков, которые, скорее всего, скрыты в сложном профиле.На этом этапе вновь идентифицированные пики сравниваются с локальными максимумами, и генерируются деконволютированные пики, где наблюдается четкое перекрытие.

Затем мы отделили кажущиеся массы для всех идентифицированных белковых пиков от их мономерных масс, которые мы получили из базы данных TAIR10 ¹⁸ . Это предоставило нам обзор состояния олигомеризации (R _app ) всех пиков белка, идентифицированных в наших экспериментах. Распределение видимых масс идентифицированных белков визуально суммировали с помощью диаграмм рассеяния (дополнительный рис.3). Мы применили двукратное отсечение мономерной массы к нашим данным, потому что ранее было показано, что это хороший порог для идентификации белков в олигомерных сборках ^10,15 . Большинство идентифицированных белков (89%) в наших данных приходилось на фракции, соответствующие диапазонам размеров, превышающим их мономерную массу. Менее 11% пиков было идентифицировано в мономерном диапазоне, и белки испытали минимальную деградацию, на что указывает небольшое количество пиков с R _app менее 0.5. Эти данные показывают, что большинство белков находится в комплексах. В качестве дополнительного доказательства белковых комплексов в наборе данных мы использовали гистограмму, чтобы суммировать распределение мономерных масс по сравнению с наблюдаемыми диапазонами размеров каждого локального максимума (дополнительный рис. 4). Гистограмма показала, что мономерные массы в основном наблюдались в узком и более низком окне диапазона масс, чем у кажущихся масс. Это еще раз подтверждает, что белковые комплексы фиксируются в нашем наборе данных.

Затем каждую из хроматограмм белка деконволюционировали на отдельные пики, которые представляют независимые гомо- или гетеромерные состояния олигомеризации белка. В случае взаимодействия белков белки, которые взаимодействуют с образованием сборки, также будут иметь общий пик. Из-за гетерогенного состава белковых комплексов не ожидается, что все возможные взаимодействующие элементы будут демонстрировать идентичные профили элюирования белка. Партнеры по взаимодействию могут скорее разделять одну вершину, но иметь общий очень отдаленный профиль.Следовательно, сложные белковые профили проблематичны в подходах к кластеризации, которые полагаются на евклидово расстояние между целыми профилями. После деконволюции каждый пик можно рассматривать как отдельный объект, независимый от других пиков в исходном профиле (рис. 3). Хотя деконволюция профиля была успешно реализована в основанном на SEC анализе белковых комплексов млекопитающих, насколько нам известно, она не проводилась в исследованиях на растениях и в подходах, основанных на PAGE.

Мы использовали набор из 4 параметров для деконволюции профилей обилия белков. на изолированные пики.Вкратце, профиль анализировали, переходя от фракции к фракции и начиная с самой низкой молекулярной массы. В каждой позиции использовалось дерево решений. Только относительное содержание белка, превышающее 5% от максимального содержания в общем профиле, считалось частью деконволютированного пика (минимальный рассматриваемый сигнал). Если содержание фракции превышает содержание предыдущей, то профиль считается повышающимся к пику, а следующие фракции анализируются. Если численность снижается до <70% от максимальной численности в текущем пике, сценарий считает, что профиль переходит на нисходящий уклон, и доля пика фиксирована.Пик считается завершенным, когда сигнал пересекает минимальный рассматриваемый сигнал или относительное содержание в следующей фракции увеличивается на> 30% по сравнению с предыдущей. Наконец, предполагаемый пик должен соответствовать еще двум критериям, чтобы его принял сценарий деконволюции: во-первых, записанная доля пика должна быть аннотирована в виде локальных максимумов (см. Выше), а во-вторых, относительное содержание в месте пика должно быть > 20% от максимальной численности в общем профиле.Затем мы удалили деконволютированные пики, представляющие мономерное состояние, сравнив размер каждого пика с мономерной молекулярной массой соответствующего белка согласно базе данных TAIR10.

Недавние подходы к изучению комплексома у растений не смогли преодолеть проблему, представленную сложными профилями белков в экспериментах по нативному фракционированию ^10,15,16 . Чтобы обойти проблему формы пика и множественных пиков на профиль белка, исследователи сосредоточили свой анализ на положении максимального содержания белка в профиле и рассмотрели белки с аналогичными максимумами в качестве предполагаемых партнеров по взаимодействию.Это решение действительно дает представление об образовании белковых комплексов, но исключает возможность идентификации совместно элюируемых белковых комплексов в остальных фракциях. Ранее сообщалось, что деконволюция профилей элюирования является возможным решением, и мы применили наш собственный метод деконволюции для решения проблемы ¹² . Используя двукратное отсечение молекулярной массы, чтобы исключить деконволютированные пики, представляющие мономерные белки, мы обнаружили 1768 (ED) и 1758 (EN) белков в диапазоне размеров, указывающих на образование белкового комплекса (рис.4A – C) с перекрытием 1798 белков между ED и EN. Большинство (приблизительно 74%) белков показывают только один пик, указывающий на образование комплекса, в то время как приблизительно 16% имеют два пика, 7% 3 и 2% 4 пика (фиг. 4D). Пять пиков наблюдались только примерно в 1% белков. Следовательно, большинство белков обнаруживается только в одном белковом комплексе в нашем собственном анализе PAGE.

Рисунок 4

Оценка идентификации белкового комплекса между ED и EN.Перекрытие между белковыми комплексами, идентифицированными в каждом из биологических повторений в ( A ) ED и ( B ) EN, было рассчитано и визуализировано в виде диаграмм Венна. ( C ) Также была составлена ​​диаграмма Венна, чтобы показать перекрытие между общим количеством белка в комплексах, идентифицированных в ED и EN. ( D ) Белки, которые участвуют в образовании комплекса, должны иметь по крайней мере один пик в дополнение к их мономерному пику. Чтобы проиллюстрировать вероятность образования комплекса, количество пиков, продуцируемых каждым белком, было визуализировано в виде столбчатой ​​диаграммы.

Влияние деконволюции профиля на анализ данных

Чтобы продемонстрировать значение деконволюции, мы использовали профиль элюции полуальдегиддегидрогеназы аспартата (AT1G14810) в качестве примера (рис. 5A). После деконволюции исходного профиля распределения по размерам мы получили три различных пика. Затем все пики после деконволюции были сгруппированы на основе их евклидова расстояния. Три пика аспартат-полуальдегиддегидрогеназы были идентифицированы в трех независимых кластерах. Далее мы проанализировали кластеры с использованием аннотаций GO ¹⁹ для идентификации функционально связанных белков.В каждом из кластеров были идентифицированы функционально связанные белки, которые потенциально могут образовывать комплекс с аспартат-полуальдегиддегидрогеназой (рис. 5А). Предполагаемые партнеры по взаимодействию уникальны для каждого кластера. Мы предполагаем, что аспартат-полуальдегиддегидрогеназа образует различные олигомерные комплексы в разных диапазонах размеров. Идентификация этих кластеров была невозможна с использованием исходного и сложного белкового профиля аспартат-полуальдегиддегидрогеназы. Этот подход также можно использовать для эффективной идентификации более крупных комплексов с множеством субъединиц (рис.5Б). Однако он ограничен сложностью данных и не предназначен для однозначного прогнозирования новых взаимодействий. Тем не менее, данные могут быть полезны для подтверждения предсказанных взаимодействий или образования метаболонов в конкретном метаболическом пути. Кроме того, это может также помочь в подтверждении присутствия известных белковых партнеров в пути или предложить новые предполагаемые взаимодействия, которые будут руководить будущими исследованиями взаимодействия белков в меньшем масштабе.

Рисунок 5

Важность деконволюции белкового профиля для идентификации белковых комплексов.Профиль миграции аспартат-полуальдегиддегидрогеназы деконволюционировал до трех отдельных пиков. ( A ) Каждый из деконволютированных пиков был обнаружен в отдельном кластере после анализа иерархической кластеризации. Визуально были представлены профили белков, обнаруженных в одном кластере, которые также функционируют в том же клеточном процессе, что и аспартат-полуальдегиддегидрогеназа. Слева: окислительно-восстановительный процесс (AT1G14810_1), процесс биосинтеза метионина (AT1G14810_2), процесс биосинтеза лизина через диаминопимелат (AT1G14810_3).( B ) Чтобы определить влияние деконволюции на очень сложные профили белков, показан профиль элюции ряда белков пентозофосфатного пути. На верхней панели деконволюция не применяется, и в результате иерархическая кластеризация не может использоваться для идентификации белков как находящихся в комплексе. На нижней панели была выполнена деконволюция, которая дала четко определенные пики, которые можно было использовать в том же подходе иерархической кластеризации для идентификации комплекса из 16 белков.

Было обнаружено, что большинство белков в наборах данных существуют как белковые сборки (рис. 4, дополнительные рис. 3 и 4). Поскольку эти сборки должны быть стабильными в естественных условиях, субъединицы этих белковых комплексов должны оставаться собранными во время разделения и давать сопоставимые профили миграции. Мы решили рассчитать евклидово расстояние между всеми возможными парами деконволютированных пиков как меру сходства. Чтобы определить евклидово расстояние отсечения, которое отделяет прогнозы взаимодействия от пар невзаимодействующих белков, был проведен анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC).Кривые ROC требуют набора данных истинно положительных и истинно отрицательных пар белков (TP и TN). Набор данных TP был создан с использованием белковых комплексов Arabidopsis, аннотированных в категории TAIR GO «белковый комплекс» (GO: 0043234). Набор данных TN состоит из пар белков, причем один белок является частью набора TP, а второй выбирается случайным образом из оставшегося набора данных. Кривые ROC были построены для данных ED и EN с использованием как исходного, так и деконволютированного профиля белка (дополнительный рисунок 5). Каждая точка на кривой ROC представляет собой истинно положительный показатель (TPR), также называемый чувствительностью, и ложноположительный показатель (FPR), или 1-специфичность, в парах белков, которые считаются взаимодействующими на определенном пороговом евклидовом расстоянии.Мы наблюдали крутой подъем наших кривых ROC с сильным отклонением от линии отсутствия дискриминации. Это показывает, что по мере постепенного увеличения отсечения Евклидова расстояния истинно положительные взаимодействия обнаруживаются быстрее, чем ложноположительные взаимодействия (дополнительный рис. 5). Более того, кривые ROC, рассчитанные на основе профилей деконволюции белков, показали немного лучшую кривую, указывающую на то, что деконволюция способствовала повышению специфичности и чувствительности. Наши кривые ROC также показали более высокую чувствительность и специфичность, чем сообщалось ранее для аналогичных исследований, что подтверждает качество сгенерированных наборов данных ^12,20 .

Реконструкция биологически значимых путей

Чтобы оценить качество нашего набора данных, мы выбрали белки из биологически значимых путей и реконструировали белковые комплексы, используя деконволюцию пиков.

Первый белковый комплекс, протеасома, также является предпочтительным эталонным комплексом для оценки качества набора данных в других исследованиях ^10,15,16 . Этот комплекс присутствует во всех эукариотических клетках и отвечает за деградацию белков в цитозоле.Протеасома состоит из каталитической 20S ядерной частицы (CP) и 19S регуляторной субъединицы (RP) ²¹ . Визуально представленная в виде тепловой карты, мы смогли обнаружить как CP, так и RP в легко различимых кластерах (рис. 6). Центральная субъединица также была идентифицирована в меньшем диапазоне размеров, чем регуляторная субъединица, что соответствует литературным данным ²² . Однако нам не удалось обнаружить полностью собранную протеасому. Этого и следовало ожидать, поскольку полностью собранная протеасома A.thaliana имеет молекулярную массу приблизительно 2MDa и не может быть эффективно захвачен с помощью нативного метода PAGE.

Рисунок 6

Совместная миграция профилей протеасомных субъединиц белка. Белковые профили субъединиц, составляющих протеасомный комплекс, исследовали в ( A ) ED и ( B ) EN. Показанные тепловые карты представляют собой деконволютированные профили элюции белков, которые принадлежат регуляторным и коровым субъединицам протеасомного комплекса.Профили белков были нормализованы до максимального значения. Зеленые области указывают на фракцию, в которой наблюдалось наибольшее содержание белка. Коммиграция наблюдалась для составляющих регуляторных и основных субъединиц протеасомного комплекса. Справа от тепловых карт показаны профили элюирования белка, используемые для создания соответствующих тепловых карт. ( C ) Сравнение содержания протеасомных белков проводили в ED и EN. Общее содержание каждого из белков, принадлежащих основной (слева) и регуляторной (справа) субъединицам протеасомы, сравнивали между двумя временными точками.Содержание каждого из белков было суммировано по фракциям и представлено желтыми и синими кружками для ED и EN, соответственно.

На основании аннотаций в базе данных KEGG CP должен присутствовать в виде гетеромерной сборки из 23 α- и β-субъединиц, в то время как RP состоит из 32 белков ²³ . Использование SEC-подхода для изучения белковых комплексов Arabidopsis Aryal et al . ¹⁰ восстановило 16 (70%) белков ЦП и 3 белка (9.3%) от РП. Мы идентифицировали 20 (87%) и 22 (95%) совместно мигрирующих белков CP в ED и EN, соответственно (рис. 6). Для RP удалось обнаружить 24 (75%) совместно мигрирующих белка в ED и EN (фиг. 6). Этот анализ показывает, что наш подход является высоко воспроизводимым и обеспечивает улучшенное покрытие протеасомы по сравнению с предыдущими исследованиями ^10,16 . Мы также расширили этот анализ, чтобы сравнить относительные количества белков, которые образуют субъединицы протеасомы в ED и EN (рис.6). Наблюдалось, что распределение белковых соотношений является стабильным, что указывает на воспроизводимость измерений в оба момента времени.

В качестве второго анализа мы намеревались изучить состояния олигомеризации определенных ферментов в хорошо известном метаболическом пути. С этой целью мы выбрали цикл трикарбоновой кислоты (ТСА). Цикл TCA присутствует в митохондриях и управляет клеточным дыханием в окислительных условиях. Было высказано предположение, что ферменты в цикле TCA способны образовывать супрамолекулярные комплексы со слабыми и временными взаимодействиями ^24,25 .

Чтобы проверить эту теорию, мы применили наш метод для исследования 63 ферментов из базы данных KEGG, которые участвуют в реакциях цикла TCA и обратного цикла TCA (рис. 7A). Из этих 63 назначенных белков мы смогли обнаружить 40 (63,5%). Почти все обнаруженные ферменты имели состояние олигомеризации (R _{примерно} ) более двух, что указывает на образование комплекса (дополнительная таблица 1). Чтобы определить, какие из ферментов могут взаимодействовать друг с другом, мы выбрали ферменты, которые участвуют в восьми основных реакциях пути, и сравнили их профили элюирования.Почти на всех каталитических стадиях мы могли наблюдать, что ферменты имели очень похожие профили элюирования по градиенту размера, что позволяет предположить, что они могли образовывать белковый комплекс (рис. 7B).

Рисунок 7

Использование цикла TCA в качестве основы для тестирования идентификации белковых комплексов. Используя базу данных KEGG в качестве справочной, была составлена ​​блок-схема цикла TCA. На этой диаграмме ферменты, катализирующие индивидуальные реакции превращения субстрата, отмечены узлами.Эта блок-схема служила каркасом, на котором было выполнено сравнение узлов с набором данных ED. Удалось проверить почти все реакции превращения, за исключением сукцинил-КоА в сукцинат. Ферменты, участвующие в этом этапе, не были обнаружены ни в одной из экспериментальных повторностей. Впоследствии профили белков всех обнаруженных ферментов в каждом отдельном узле были объединены, чтобы наглядно проиллюстрировать возможности нашего метода для обнаружения взаимодействий между белками и белками. ( B ) Графический обзор сети взаимодействия PPI, спрогнозированной для цикла TCA с использованием набора данных ED.( C ) Показано совпадение между ИЦП, обнаруженными в наборе данных ED, и ИЦП, определенными Чжаном и его коллегами26. ( D ) Взаимодействия, выявленные между ферментами, которые катализируют последовательные реакции в цикле TCA, о которых не сообщалось Zhang и его коллегами26 ( E ) Прогнозируемые белковые взаимодействия внутри ферментных белковых комплексов аконитазы (слева) и цитратлиазы АТФ (справа) . Прогнозируемые взаимодействия наблюдались с использованием отсечки Евклидова расстояния, как было заранее определено с помощью анализа кривой ROC (10% FDR).Ферменты и их изоформы представлены узлами, а соединяющие их ребра показывают потенциальные взаимодействия.

Другой важный метод регуляции метаболизма зависит от микрокомпартментации ферментов, также известных как образование метаболонов ^26,27,28 . Недавно Zhang и соавторы показали каналирование субарет во взаимодействии цикла TCA и выявили сам интерактом ²⁹ . Используя эти данные PPI в качестве эталона, мы провели анализ белковых комплексов в отделении неотложной помощи.Чтобы идентифицировать потенциальные ИПП, в нашем анализе CN-PAGE мы вычислили евклидово расстояние между деконволютивными пиками всех ферментов, связанных с циклом TCA. Используя наш анализ кривой ROC, мы установили порог евклидова расстояния на основе 10% отсечки FDR. Если рассчитанное евклидово расстояние между двумя пиками после деконволюции было меньше порогового значения, мы считали, что белковая пара взаимодействует. Мы идентифицировали 27 ферментов, связанных с циклом TCA, с сетью из 74 взаимодействий (рис. 7B).Сеть взаимодействия, описанная Zhang et al . состоит из 158 взаимодействий между 38 белками, аннотированными в цикле TCA ²⁹ . Сравнивая два исследования, было обнаружено, что перекрываются только 11 белков. Эти белки производили 14 взаимодействий в исследовании Zhang et al . Из этих 14 PPI только два (ACO2 | ACO3 и ACO3 | IDH6) также наблюдались в нашем анализе взаимодействий между ферментами цикла TCA ²⁹ (рис. 7C).

В то время как исследование Zhang и соавторов сообщило о существовании метаболонов в цикле TCA, небольшое совпадение между данными их взаимодействия с белками и нашим подходом CN-PAGE указывает на то, что PPI и образование метаболонов в цикле TCA еще не полностью решены. .Метаболоны определяются как взаимодействия последовательных ферментов метаболического пути, которые позволяют эффективно направлять метаболиты ^26,28,30 . Поэтому мы проанализировали 74 PPI, предсказанные анализом кривой ROC для взаимодействий между последовательными ферментами цикла TCA, о которых не сообщалось Zhang et al . Мы наблюдали взаимодействие субъединицы аконитазы ACO2 с субъединицей изоцитратдегидрогеназы IDH6. Кроме того, в нашем наборе данных предполагалось, что две оставшиеся субъединицы изоцитратдегидрогеназы (IDh2 и IDH5) и кетоглутаратдегидрогеназа (ODC1-1) будут взаимодействовать.Наконец, мы предсказали взаимодействие между субъединицей цитратсинтазы (CSY4) с ACO1 (рис. 7D). Об этом конкретном взаимодействии не сообщили Чжан и его сотрудники ²⁹ . Однако образование метаболона между MDH, CYS и ACO было описано до ³¹ .

Кроме того, наши данные предполагают взаимодействия между известными белковыми комплексами, аконитазой (ACO) и тремя субъединицами цитратлиазы АТФ (ACL), которые играют важную роль в восстановительном цикле TCA ³² (рис.7E). Хотя для подтверждения этого предполагаемого взаимодействия требуются дальнейшие эксперименты, интересно предположить, что может происходить образование метаболона между ACO и ACL и поддерживать передачу субстратов от изоцитрата через цитрат к оксалоацетату.

Мы также предположили, что состояние олигомеризации ферментов может зависеть от факторов окружающей среды, таких как свет и температура. Поскольку цикл TCA работает в разных режимах при свете и в темноте, мы использовали наши наборы данных ED и EN для проверки этой гипотезы ³³ .Однако мы не смогли наблюдать никаких изменений в состоянии олигомеризации ферментов, связанных с циклом TCA, между двумя временными точками (дополнительная таблица 1). Было показано, что перестройки взаимодействия между комплексами цикла TCA играют роль в ответе растительных клеток на окислительный стресс ³⁴ . Отсутствие значительных изменений между ED и EN может указывать на то, что в нормальных условиях роста растения регулируют активность ферментов цикла TCA независимо от состояния олигомеризации — потенциально с помощью посттрансляционных модификаций ^35,36,37 .Также возможно, что перестройки в белковых комплексах цикла TCA между ED и EN незначительны и не могут быть разрешены с помощью нашего экспериментального подхода. Более того, изменения в сложном составе или содержании между ED и EN могут происходить в основном в нестабильных ИЦП, которые обычно недостаточно представлены в нашем наборе данных.

В будущих экспериментах установленный конвейер обработки проб и анализа данных может быть применен для изучения изменений в содержании и составе белковых комплексов в ответ на изменения в окружающей среде или вслед за восприятием биотического или абиотического стресса.

Количественный анализ комплексомов в ED и EN

Мы продолжили развитие нашего подхода к количественному сравнению белковых комплексов и применили его для изучения комплексома A. thaliana в ED и EN. Высокая воспроизводимость данных позволила нам сравнить изменения относительного содержания белковых комплексов между двумя временными точками. Площадь под кривой (AUC) была рассчитана для всех идентифицированных белков на основе профилей миграции после деконволюции.Используя отсечение Евклидова расстояния, полученное анализом кривой ROC (дополнительный рис. 5), были идентифицированы профили, предположительно представляющие белки одного и того же белкового комплекса. Затем данные были отфильтрованы для белков, которые присутствовали как в наборе данных ED, так и в EN. Это позволило нам специально исследовать изменения численности в отдельные моменты времени и в то же время исключить изменения, вносимые составом белка. Затем вычисляли среднее значение AUC для каждого из белковых комплексов и сравнивали между временными точками.Рассчитанные таким образом отношения показаны в виде горизонтальной гистограммы (фиг. 8A). Парный t-критерий использовался для проверки значимости наблюдаемых изменений. В то время как большинство белковых комплексов, которые мы идентифицировали, не показали значительных изменений в содержании между ED и EN, скопления пластидных рибосом показали более высокое содержание в EN, чем в ED (рис. 8B). На первый взгляд это наблюдение кажется противоречащим предыдущим исследованиям, которые показали, что количество рибосомных белков стабильно в течение всего суточного цикла у растений ³⁸ .Однако было показано, что трансляционная активность рибосом днем ​​выше, чем ночью ³⁹ . Сборки рибосом, разрешенные в нашем собственном анализе PAGE, имеют размер менее 1MD и, следовательно, представляют собой не полностью собранные рибосомы, необходимые для трансляции, а отдельные субъединицы. Это можно объяснить молекулярной массой полностью собранной пластидной рибосомы, которая составляет приблизительно 2 МДа и превышает диапазон размеров прозрачного геля нативного ПААГ, использованного в этом исследовании.Однако малая субъединица имеет молекулярную массу около 650 кДа и может растворяться в геле. Большая субъединица составляет примерно 1300 кДа и соответствует верхнему пределу диапазона размеров геля ^40,41 . Следовательно, более высокое количество сборок рибосомных белков, которые мы наблюдали, показывает, что неактивные рибосомы разбираются в течение ночи, и их субъединицы могут быть разделены в нашем собственном PAGE. Это объяснение также подчеркивает способность нашего метода точно определять, когда происходят изменения относительного содержания белка в белковых комплексах.

Рисунок 8

Комплексом Arabidopsis в ED и EN. Относительное содержание белковых комплексов из базы данных GO-Slim сравнивали в ED и EN. Были рассчитаны отношения AUC для субъединиц белкового комплекса, идентифицированные в ED и EN, и усреднены для белков, принадлежащих к одному и тому же комплексу. ( A ) Количество белков, из которых состоит комплекс. ( B ) Гистограмма общего содержания рибосомных белков, обнаруженных в каждой фракции геля.Анализ проводился для всех перекрывающихся рибосомных белков, которые присутствовали в обоих экспериментах.

Временная динамика образования и диссоциации белковых комплексов при цитомегаловирусной инфекции человека

Культура клеток и вирусная инфекция

Клетки MRC5 (ATCC) и HEK293T (ATCC) культивировали в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C в культуральной среде Среда Игла, модифицированная Дульбекко (Life Technologies), с добавлением 10% (об. / об.) FBS (Invitrogen) и 1% (об. / об.) раствора пенициллин-стрептомицин (GIBCO).Клетки тестировали на контаминацию микоплазмой с помощью ATCC с помощью агаровой культуры, ПЦР-анализа и окрашивания ДНК Hoechst. Клетки MRC5 использовали в течение десяти пассажей. Никакой дополнительной аутентификации клеточной линии не проводилось. Штамм HCMV AD169 был использован в качестве штамма дикого типа для этого исследования. Фибробласты инфицировали в половинном объеме среды при множественности инфицирования (MOI) 3 при 37 ° C в течение 2 часов. Затем среду заменяли свежей культуральной средой полного объема, и инфицированные клетки культивировали в течение указанного периода времени.Неинфицированные (ложные) клетки также культивировали в средах половинного объема в течение 2 ч, после чего среду заменяли на свежую культуральную среду полного объема.

Справочная РНК (пРНК) и миРНК

В этом исследовании были использованы следующие направляющие РНК и миРНК. Для CRISPR-опосредованного нокаута IGF2R использовались направляющие РНК: CRISPR_IGF2R_1 5 CT-CTTACCTCTCTCCGCTCCGA-3ʹ (HGLibA_30096) и CRISPR_IGF2R_2 5ʹ-GGCTTGTCCTGAGTTACGTG-3ʹ_30097L (HGGL). В качестве контрольной направляющей РНК использовали NegativeControl (Origene pCas-Scramble) 5ʹ-GCACTACCAGAGCTAACTCA-3ʹ.Для siRNA-опосредованного нокдауна WASHC2C использовались миРНК SASI_Hs01_00233696 (Millipore Sigma) (5ʹ-GAACCAAGCCUAGAACCAATT-3ʹ) и SASI_Hs01_00233697 (5ʹ-CAAACAUCAAGCCGU). Для siRNA-опосредованного нокдауна ACAT1 использованными siRNA были 5ʹ-GCGAAGAGGCUCAAUGUUA-3ʹ (Dharmacon J-009408-05), 5ʹ-CUACAAGGCAGGCAGUAUU-3ʹ (Dharmacon J-009408- Grmacon J-009408-Grmagu-3 (Dharmacon J-009408- Grmacon) и 009408-08). Для опосредованного миРНК нокдауна CD63 использовались миРНК siCD63 # 1 5ʹ-GGAUGCAGGCAGAUUUUAATT-3ʹ и siCD63 # 2 5ʹ-GGAUUAAUUUCAACGAGAATT-3ʹ.Для siRNA-опосредованного контроля нокдауна использовали siRNAs: Универсальный отрицательный контроль SIC005 и siGFP (5ʹ-GGUGUGCUGUUUGGAGGUCTT-3ʹ)

Подготовка проб для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS / MS) анализ клеток для анализа TPCA4 MRC

клеток. собирали из одной сливной чашки 15 см (6 × 10 ⁶ клеток) на условие. Клетки промывали 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и отделяли 2 мл трипсина (Life Technologies) с последующей нейтрализацией культуральной средой.Клетки центрифугировали при 250 × g в течение 5 мин, ресуспендировали в 0,5 мл PBS и аликвотировали (50 мкл / пробирка) в 10 пробирок для ПЦР. Каждую пробирку нагревали при разной температуре в течение 3 мин с помощью термоциклера Т100 (Bio-Rad). Использовались следующие температуры: 36,9, 40,2, 43,9, 46,6, 48,6, 52,7, 55,3, 58,5, 61,2 и 64 ° C. После нагревания клетки инкубировали при 4 ° C в течение 3 мин. Затем клетки лизировали в 100 мкл киназного буфера (75 мМ HEPES pH 7,5, 15 мМ MgCl ₂ , коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Fisher Scientific, # 78446) и 3 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP). ).Затем лизаты дважды замораживали и размораживали и подвергали механическому лизированию (1) иглой 21-го размера за десять движений и (2) иглой 26-го размера за шесть движений. Лизаты замораживали и снова оттаивали с последующим центрифугированием при 20000 × g в течение 20 мин при 4 ° C. Супернатанты восстанавливали и алкилировали 25 мМ TCEP и 25 мМ хлорацетамида в течение 30 минут при 55 ° C и гасили 25 мМ цистеином. Белки осаждали экстракцией метанолом и хлороформом и ресуспендировали в 50 мМ EPPS-KOH (pH 8.3). Концентрации белка определяли с помощью анализа BCA. Одинаковый объем белков из каждого нагретого образца использовался для последующих этапов и был скорректирован так, чтобы сумма содержаний белков для каждой временной точки заражения составляла 1 мг. Образцы белка переваривали трипсином (Thermo Scientific, #

, 1:50 вес / вес) в течение ночи при 37 ° C. Расщепленные пептиды доводили до 100 мМ EPPS (pH 8,3) и 20% ацетонитрила и метили с использованием набора 10-plex TMT (Thermo Scientific, # ) в течение 1 часа с последующим гашением 0.33% гидроксиламин. Два микролитра пептида из каждого образца подкисляли до 1% трифторуксусной кислоты (TFA) и обессоливали с помощью наконечников C18 StageTips согласно руководству (Fisher Scientific, № 14–386–2). Полученные пептиды сушили с помощью Speedvac и ресуспендировали в 5 мкл 1% муравьиной кислоты / 1% ацетонитрила. Два микролитра тестовой смеси пептидов анализировали методом ЖХ-МС / МС. Для определения подходящего количества смешивания использовался средний коэффициент обратного масштабирования для соответствия лог-логистической функции (optimize.curve_fit из Scipy v1.{b \ cdot \ log t — \ log a}}} \), где t ∈ \ ({\ Bbb T} \) = {36.9 ° C, 40.2 ° C, 43.9 ° C, 46.6 ° C, 48.6 ° C, 52,7 ° C, 55,3 ° C, 58,5 ° C, 61,2 ° C, 64 ° C} и a , b и c являются оценочными параметрами. На основе подобранной кривой и среднего содержания белка во все моменты времени для каждой температуры, рассчитанного с помощью анализа BCA, были оценены концентрации пептидов и определены средние объемы образцов, подлежащих смешиванию, так что общее содержание пептидов в смешанном TMT, помеченном образец составлял 100 мкг на образец.Образцы TMT были смешаны со средним объемом, умноженным на каждый коэффициент масштабирования. Смешанные образцы доводили до 1% TFA, инкубировали на льду в течение 15 минут, а затем центрифугировали при 4000 × g в течение 10 минут при 4 ° C. Пептиды элюировали на 10 фракций с помощью C18 StageTips. Элюции сушили и растворяли в смеси 5 мкл 1% муравьиной кислоты и 2% ацетонитрила с последующим анализом ЖХ-МС / МС с введением 2 мкл.

Анализ ЖХ-МС / МС для образцов TMT

Пептиды наносили на систему ВЭЖХ с нанопотоком (Dionex Ultimate 3000 nRSLC), оснащенную источником ионов EASY-Spray (C18, 50 мм × 75 мм, размер частиц 2 мм) .Для тестовой смеси пептиды фракционировали с линейным градиентом растворителя A (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя B (97% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты, 2,9% воды) от 6 до 18% растворителя B более 60%. мин и с линейным градиентом от 18 до 29% растворителя B в течение 30 мин при скорости потока 250 нл / мин. Элюированные пептиды распыляли непосредственно в прибор Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Спектры МС и МС / МС получали автоматически в режиме МС2, полностью зависящем от МС / данных. Полный диапазон сканирования был установлен на 350–1800 m / z при разрешении 120 000, с целью автоматической регулировки усиления (AGC) 3e6, максимальным временем инжекции (MIT) 30 мс и спектрами, записанными в профиле.Высокоэнергетическая диссоциация, вызванная столкновениями (HCD), была выполнена на 20 самых интенсивных ионах-предшественниках с длительностью динамического исключения 25 с. Окна изоляции MS2 были установлены на 1,2 m / z , с целью AGC 1e5, MIT 72 мс, фиксированной первой массой 100 m / z , диапазоном сканирования 200–2000 m / z , разрешением 45 000, а спектры записаны в центроиде. Анализ фракционированных образцов TMT был выполнен так же, как и анализ тестовой смеси, за исключением того, что окна изоляции MS2 были установлены на 0.8 м / з .

Анализ ЖХ-МС / МС для целевой МС с использованием PRM

Для целевого анализа МС пептиды применяли к той же системе ЖХ-МС, которая использовалась для вышеупомянутых прогонов TMT. Пептиды разделяли с градиентом 60 минут (от 4 до 14% растворителя B за 40 минут, от 14 до 25% за 20 минут при скорости потока 250 нл / мин). Один полный рабочий цикл прибора состоял из одного сканирования MS-SIM, за которым следовали от 1 до 30 сканирований PRM. Для полного режима MS-SIM прибор был установлен на полный диапазон сканирования 350–1800 m / z с разрешением 15 000, MIT 15 мс и целью 3e6 AGC.Для сканирования PRM ​​прибор был настроен на разрешение 30 000, MIT 80 мс, 5e5 AGC, окно изоляции 0,8 m / z , NCE 28 и фиксированную первую массу 150 m / z . Файлы RAW, содержащие спектры МС / МС, собранные в режиме PRM, были импортированы в Skyline для извлечения хроматограмм ионов продуктов (XIC) и расчета площадей пиков. Спектральную библиотеку пептидов человека и вируса герпеса генерировали с использованием Skyline (v4.0) из анализов DDA MS Murray et al. ⁸³ и Жан Бельтран и др. ⁹⁴ .Список пептидов фильтровали на основании интенсивности ионов и воспроизводимости площади пика в повторах. От двух до пяти наиболее интенсивных совместно элюируемых продуктов XIC использовали для количественной оценки площади пика. Площади пиков пептидов IGF2R, WASHC2C и CD63 были нормализованы по пептидам, используемым в качестве контролей загрузки из HIST1h3BA (QVHPDTGISSK и LLLPGELAK), HIST1h3AA (AGLQFPVGR), TUBB1 (FPGQLNADLR) и GAPDH (LVQINGNER). Для IP WASHC2C площади пиков комплексных белков WASH были нормализованы к площадям пептидов WASHC2C.

Идентификация и количественная оценка пептидов для образцов TMT

Все спектры МС / МС сравнивали с последовательностями белков в подмножестве вирусов человека и герпеса из базы данных UniProt-SwissProt, загруженной в апреле 2016 года, в сочетании с обычными контаминантами, с использованием алгоритма SEQUEST в Proteome Discoverer v2.2 (Thermo Fisher Scientific). Узел перекалибровки спектров использовался для выполнения перекалибровки точности массы в автономном режиме. Полностью триптическое ограничение было наложено на поиск в базе данных, допустимое количество пропущенных расщеплений было установлено равным 2, и было установлено статическое карбамидометилирование цистеина и статическая модификация TMT N-конца или лизина.В качестве динамических модификаций были выбраны ацетилирование Nh3-конца метионина, ацетилирование Nh3-конца с потерей метионина, окисление метионина и дезаминирование аспарагина. Допуск по массе предшественника составлял 5 частей на миллион, а допуск по массе фрагмента составлял 0,02 Да. Согласованные спектры оценивались Percolator на предмет вычисления вероятности ложного обнаружения (FDR) (использовался FDR 1%) на основе поиска в базе данных обратной последовательности. Допуск интеграции и метод интеграции узла квантификатора репортерных ионов были установлены как 10 ppm и наиболее достоверный центроид, соответственно.В согласованном рабочем процессе порог совместной изоляции составлял 30, а средний репортер S / N составлял 8 для количественной оценки репортера. Пептиды, содержащие дезамидированный аспарагин или глутамин, фосфорилированный серин, треонин или тирозин и окисленный метионин, исключались из количественного определения белка.

Обработка данных TMT для нормализации растворимой фракции

Для вменения недостающих значений содержания пептидов в каналах TMT (температуре) мы использовали интервальное деление на основе точек по обе стороны от пропущенных значений с гауссовым шумом.Если отсутствующее значение находится при 64 ° C, значения были подогнаны к экспоненциальному затуханию (константа затухания установлена ​​как ln1,5) с гауссовым шумом. Затем значения содержания общих пептидов из разных белков были распределены в соответствии с количеством совпадений пептидного спектра (PSM), используемых для количественной оценки. Например, общие пептиды были отнесены к белкам, как в \ ({\ mathrm {sp}} \ times \ frac {q} {Q} \), где sp — содержание общего пептида TMT, q — сумма спектральных отсчетов, используемых для количественной оценки при 37 ° C назначенного белка, а Q — общее количество спектральных отсчетов для белков, разделяющих пептид.Значения содержания белков рассчитывали как сумму содержаний пептидов, которые были количественно определены во все моменты времени инфицирования. Для вирусных белков для количественной оценки использовали последовательно идентифицированные пептиды. Чтобы получить нормализованную растворимость (df _{i, r} ), содержание белка было разделено на содержание в образце 37 ° C, где i и r представляют собой момент заражения и репликацию, соответственно. {\ mathrm { T}} \), где \ (1 \), f (·) и T представляют m -мерный вектор всех единиц, 10-мерный вектор, основанный на предполагаемых значениях аппроксимации лог-логистики. функция LL ( t ) и операция транспонирования соответственно.{\ mathrm {T}}} \ right)} \), где °, diag (·) ⁻¹ , u _k , U и 1 представляют произведение Адамара, обратное диагональная матрица, спектральный счет, обнаруженный во всех временных точках заражения в реплике k , общее количество спектральных подсчетов в репликах и 10-мерный вектор «все единицы», соответственно. Для нормализации между моментами заражения мы построили 10-мерный медианный вектор (MoM _cs ) для \ ({\ mathrm {MoM}} _ {{\ mathrm {cs}} _ i} \), где \ ({\ mathrm {MoM}} _ {{\ mathrm {cs}} _ i} \) представляет 10-мерный медианный вектор cs _i .2} \), где p _t и q _t представляют собой нормированную скорректированную растворимость белков p и q при температуре нагревания t . 2} \), где t представляет температуру нагрева, а _pi и p _mock представляет собой нормализованную скорректированную растворимость белка p в момент времени инфицирования и в неинфицированном состоянии, соответственно.Среднее евклидово расстояние было определено как \ (\ frac {{\ mathop {\ sum} \ nolimits_ {p, q \ in c} d \ left ({p, q} \ right)}} {{\ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} {\ left | c \ right |} \\ 2 \ end {array}} \ right)}} \), где c , | c | и d ( p , q ) представляют белки, идентифицированные как члены белковых комплексов как в CORUM, так и в наших наборах данных TMT, количество белков в c и расстояние между белками p и q соответственно.Средние евклидовы расстояния сравнивали для комплексов CORUM и случайных белков (т.е. содержащих такое же количество случайно выбранных белков, что и те, которые определены как предполагаемые члены комплекса CORUM из нашего набора данных). Чтобы лучше отобразить данные, мы также вычислили производную евклидова расстояния как \ ({\ mathrm {Ex}} = \ frac {1} {{1 + E _ {{\ mathrm {avg}}}}} \), где E _avg — среднее евклидово расстояние пар белков внутри комплекса. Ex ограничивает диапазон данных (0, 1), и это приводит к лучшему соответствию нормальному распределению по сравнению с евклидовым расстоянием.

Создание матрицы точечной диаграммы

Матрицы точечной диаграммы были созданы с использованием пакетов Python matplotlib (v3.1) и seaborn (v0.9). Белки (каналы TMT) или белковые комплексы с пропущенными значениями в каждом образце были удалены с диаграммы разброса. Для построения диаграммы разброса относительных содержаний белков (рис. 1b и дополнительный рис. 1b), коэффициенты корреляции между повторами были рассчитаны как log _e распространенности трансформированного белка, оцененной из суммы интенсивностей пептидных репортерных ионов для пептидов. общие для указанных белков по временным точкам.Для диаграммы разброса белковых комплексов (фиг. 1g) использовали производную среднего евклидова расстояния (Ex) и рассчитывали Ex, как указано выше. Корреляции были рассчитаны с использованием Пирсона r . Высота и ширина эллипса за корреляцией были рассчитаны как \ (\ sqrt {1 — r} \) и \ (\ sqrt {1 + r} \) соответственно. Тепловая карта была раскрашена в соответствии с ( r — 0,8) × 5.

Анализ PCA

Нормализованное содержание белка в каналах TMT на момент времени было стандартизовано с помощью StandardScaler программы scikit-learn (v0.21) Пакет Python. Полученные нормализованные каналы для каждой временной точки затем анализировались функцией PCA scikit-learn. Процент дисперсии, объясняемой каждым из выбранных компонентов, был рассчитан с помощью scikit-learn. При построении графика содержания протеома в пространстве PCA использовались содержания, рассчитанные как сумма интенсивностей всех пептидных репортерных ионов для каждого белка.

Нечеткая кластеризация c-средних и анализ обогащения GO

Для проверки сложных изменений после заражения мы использовали Ex _{c, i} (= Ex _{c, i} −Ex _{c , mock} ) , где \ ({\ mathrm {Ex}} _ {c, i} = \ frac {1} {{1 + E_ {c, i}}} \) и E _{c, i} — среднее евклидово расстояние каждого белка в комплексе ( c ) в конкретный момент времени заражения ( i ; 24, 48, 72 и 96 hpi или фиктивный).Баллы z вычисляли из нулевого распределения Ex _{c, i} , сгенерированных из случайных белков того же числа, что и в комплексе ( c ) с 10 000 итераций. Кластеризация путей выполнялась с помощью кластеризации нечетких c-средних на основе временных рядов z -скорингов из пакета Python SciKit-Fuzzy (v0.4). Параметр нечетких c-средних m и ошибка были установлены как 2 и 0,005 соответственно. Номер кластера определялся окончательным коэффициентом нечеткого разделения.Оценки членства рассчитывались как \ (\ mathop {{{\ mathrm {max}}}} \ limits_j ({\ mu _ {jl}}) \) окончательного μ _jl (0 ≤ j ≤ C , 0 ≤ l ≤ N ), где N и C представляют количество наборов данных (белковых комплексов) и кластеров (для C установлено значение 8). Окончательный коэффициент нечеткого разделения μ _jl в диапазоне от 0 до 1 вычисляется с помощью итеративной оптимизации и представляет собой среднее гармоническое относительное расстояние между комплексом l и центром кластера j с взвешиванием. параметр нечеткости мʹ ( мʹ установлен на 2).μ _jl отображает вероятность того, что белковый комплекс l будет отнесен к кластеру j . В целом, оценки членства, информирующие о наиболее вероятном кластере, которому приписан белковый комплекс -1 , и относительное расстояние этого комплекса от среднего значения (центроида) назначенного кластера. Термины GO были извлечены из базы данных CORUM и использованы для анализа обогащения. Анализ обогащения проводился с помощью точного теста Фишера. Оценка обогащения была определена как -log ₁₀ p -значение, которое рассчитывали с помощью scipy.stats.hypergeom из Scipy. Были выбраны термины с показателем обогащения> 1,5. Отображаются все расширенные термины GO без ограничения количества комплексов, назначенных термину GO.

Анализ протеиновых комплексов и представление данных

Белки, количественно определенные в наших наборах данных, искали в базе данных CORUM, которая содержит тщательно отобранные человеческие протеин-протеиновые комплексы, прошедшие предварительную экспериментальную валидацию из литературы. Информация о предполагаемых комплексах, присутствующих в нашем наборе данных, была использована для определения того, имеют ли члены комплекса сходные профили агрегации в фибробластах, предполагая их возможную ассоциацию.Для этого были рассчитаны средние евклидовы расстояния между кривыми агрегации белков членов предсказанных комплексов. Этот расчет повторяли в каждый момент времени инфицирования, чтобы определить, изменяются ли эти предполагаемые ассоциации в процессе прогрессирования инфекции. Для рис. 1f распределение Гаусса было подогнано к распределению производной среднего евклидова расстояния предполагаемых белковых комплексов среди случайно выбранных белков, а оценка z описывает достоверность различных средних значений распределений CORUM. комплексы и случайно выбранные белки. z -score описывает количество стандартных отклонений белков комплекса CORUM от среднего значения случайно выбранных белков. Высокие баллы z представляют высокое Ех и низкое среднее евклидово расстояние, что указывает на более близкие кривые плавления компонентов комплекса. Для сетевой иллюстрации интересующих белковых комплексов край определяется как взаимодействие между белковыми узлами, как задокументировано в базе данных CORUM. Ширина и цвет края представляют собой значение Ex взаимодействующих белков (узлов) и балл z , полученный из значений Ex, соответственно.Сетевые графики были построены с помощью пакета Python NetworkX (v2.3) и Cytoscape (v3.7).

Подготовка образца для иммуноаффинной очистки

Клетки MRC5 подвергали механическому лизированию с помощью Polytron в буфере для лизиса (20 мМ HEPES-KOH pH 7,4, 110 мМ ацетат калия, 2 мМ MgCl ₂ , 0,1% Твин-20, 1 мкМ ZnCl ₂ и 1 мкМ CaCl ₂ ), содержащий 0,2% Triton X-100 и смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз. Магнитные шарики с белком A / G (Pierce # 88802) промывали буфером для лизиса и конъюгировали со следующими антителами в течение 1 ч при 4 ° C; антитело против FLAG (AB_262044), антитело против IFIT1 (AB_2783869) или очищенный кроличий IgG (MP Biomedicals).Лизаты клеток инкубировали с конъюгированными шариками в течение 1 ч при 4 ° C. Гранулы трижды промывали 0,5 мл буфера для лизиса с последующей промывкой в ​​холодной воде MilliQ. Белки элюировали 50 мкл буфера TES (106 мМ Tris HCl, 141 мМ Tris Base, 2% додецилсульфат натрия (SDS), 0,5 мМ EDTA) в течение 10 мин при 70 ° C и концентрировали в 2,5 раза с помощью speedvac. Образцы восстанавливали и алкилировали 25 мМ TCEP и 25 мМ хлорацетамида в течение 20 минут при 70 ° C. Образцы были подготовлены для колонок с S-ловушкой путем добавления 2.3 мкл 12% фосфорной кислоты и 165 мкл 100 мМ TEAB (pH 7,1) в метаноле. Затем образцы наносили на колонку с S-ловушкой (Protifi, CO 2-micro) и пять раз промывали 150 мкл 100 мМ TEAB pH 7,1 в метаноле. Образцы белка расщепляли раствором трипсина (2 мкг трипсина в 25 мМ TEAB pH 8,0) на колонке в течение 1 ч при 47 ° C. Полученные пептиды элюировали последовательно 40 мкл 25 мМ TEAB pH 8,0, 0,2% муравьиной кислоты и 0,2% муравьиной кислоты в 50% ацетонитриле. Элюированные пептиды сушили и ресуспендировали в 1% муравьиной кислоте / 2% ацетонитриле и подвергали анализу PRM, как описано выше.

Анализ обогащения с использованием | ΔTm |

Значение

Tm обозначается как температура в точке перегиба подобранной логарифмической функции LL ( t ), которая была определена как параметр a , как описано выше. Абсолютные значения ΔTm в указанные моменты времени заражения были отсортированы от высокого к низкому, и значения были равномерно разделены на семь интервалов. Затем был проведен анализ обогащения на основе теории информации ⁹⁵ . Цвета интервалов тепловой карты представляют собой оценки обогащения и были нанесены на график как −log ₁₀ p -значение на основе точного критерия Фишера.Оценки z были рассчитаны на основе нулевого распределения взаимной информации указанных наборов генов и получены из 10 000 итеративных случайных выборок.

Иммунофлуоресцентный анализ

Для иммуноокрашивания ITGB1 и CD63 клетки MRC5 на покровных стеклах дважды промывали 0,5 мл PBS и фиксировали в 4% PFA при комнатной температуре в течение 15 мин. Фиксированные клетки промывали 0,5 мл PBS три раза, повышали проницаемость 0,2% Tween-20 в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и блокировали блокирующим буфером (5% козьей сыворотки, 5% человеческой сыворотки, 22.5 мг / мл глицина, 3% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,2% Tween-20 в PBS) в течение 30 минут при комнатной температуре. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5 ч с первичными антителами к ITGB1 (12G10, Santa Cruz 1: 150) или CD63 (ab118307, abcam 1: 100), разведенными в 3% BSA в 0,1% TBST, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 45 мин с вторичными козьими антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 555 или Alexa Fluor 488, к IgG мыши или кролика (AB_141780 или AB_143165, Life Technologies, 1: 1000, соответственно), разведенными в 3% BSA в 0.1% TBST. Затем образцы окрашивали Hoechst 33258 (1: 1000) в течение 15 мин при комнатной температуре. Для иммуноокрашивания IGF2R и pUL99 применялся тот же метод, за исключением того, что образцы фиксировали в 100% метаноле при -20 ° C в течение 15 мин и что первичные антитела к IGF2R (D3V8C, Cell Signaling, 1: 150) и pUL99 (подарок от Thomas Shenk, клон 10B4, 1: 150). Клетки помещали с помощью ProLong Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, P36965) на предметные стекла после окрашивания и исследовали с помощью конфокального микроскопа с инвертированной флуоресценцией (Nikon Ti-E), оснащенного вращающимся диском Yokogawa (CSU-21), цифровой CMOS-камерой ( Hamamatsu ORCA-Flash TuCam) и прецизионный столик микроскопа (Piezo).Средняя интенсивность ITGB1 или CD63 в интересующей области (ROI) была измерена Фиджи.

Вестерн-блоттинг

Образцы лизировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl pH 8,0, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ EDTA, 4% SDS) и подвергали итеративным циклам нагревания при 95 ° C и обработки ультразвуком в рожке чашки до тех пор, пока лизис был завершен. Концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA, и равные количества белков загружали в 10% трис-глицин-SDS-полиакриламидный гель, который работал при 130 В. Белки переносили в течение ночи при 4 ° C и 30 В на поливинилиденфторид (PVDF). ) мембрана.Мембраны разрезали и блокировали на 1 час в блокирующем буфере (5% молоко, 0,2% Твин-20 в PBS). Мембраны инкубировали с первичными антителами в блоке в течение 3 ч при комнатной температуре: ACAT1 (1: 1000, PA5-82154, Thermo Fisher Scientific), IE1 (1: 500, клон IB12, подарок Томаса Шенка), pUL26 (1: 200 , подарок Томаса Шенка), pUL99 (1: 200, клон 10B4, подарок Томаса Шенка) и тубулин (1: 5000, клон T6199 DM1A, Sigma). Мембраны инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами в блоке: Alexa 680 и 800 против IgG мыши или кролика (H + L) (Invitrogen, 1: 10 000).Чтобы определить эффективность «нокдауна», был проведен денситометрический анализ с использованием ImageStudioLite для Odyssey. Интенсивность ACAT1 была приведена к интенсивности тубулина.

Анализ распределения интенсивности IGF2R

Изображения были проанализированы на Фиджи. Мы вычли фоновую интенсивность с порогом 150. Для каждой ячейки мы выбрали ROI и удалили внешнюю интенсивность. Центр ROI был определен как центр ядра, и изображение было преобразовано в полярные координаты с помощью плагина Fiji, Polar Transformer.Гистограмма интенсивности преобразованного изображения была создана с помощью функции «Профиль графика» на Фиджи. Чтобы построить полярный график, максимальная интенсивность каждого изображения была выровнена по 0 °, а полярный график был построен с использованием пакета Python matplotlib.

Генерация CRISPR-нокаутных клеток

CRISPR-опосредованные нокауты IGF2R или контрольные нокауты выполняли с последовательностями направляющих РНК, указанными в разделе gRNA и siRNA. Последовательности направляющей РНК вставляли в LentiCRISPRv2 (подарок от Feng Zhang, Addgene # 52961).Сгенерированный лентивирус использовали для трансдукции клеток MRC5, которые были отобраны пуромицином (2,5 мкг / мл; Life Technologies).

Анализ титра вируса

Клетки MRC5 инфицировали HCMV при MOI 3, и супернатанты собирали при 120 hpi. Супернатанты использовали для заражения репортерного планшета с клетками MRC5 дикого типа. Через 24 часа инфицированные клетки фиксировали метанолом, блокировали блокирующим буфером (3% BSA, 0,1% Tween-20 в PBS) в течение 1 часа, инкубировали с антителом против IE1 (подарок Томаса Шенка, клон IB12, 1 : 100) в течение 1 часа и инкубировали с козьими IgG против Alexa 488 (1: 1000; Life Technologies, A-11001) в течение 1 часа.Затем образцы окрашивали Hoechst 33258 (1: 1000) в течение 15 мин. Титры вирусов рассчитывали с помощью системы визуализации Operetta (Perkin Elmer). Количество IE1-положительных клеток использовали для расчета инфекционных единиц / мл (МЕ / мл).

Обнаружение белковых комплексов с использованием алгоритма COACH

Сеть PPI была построена на основе производной евклидова расстояния (Ex = 1 / (1 + E )) каждой пары белков, а край сети был установлен как Ex с порогом 0,9. К этой сети был применен алгоритм COACH ⁶⁸ , а параметры d и t были установлены как 0.7 и 0,225 соответственно. Чтобы исследовать предполагаемые белковые комплексы в разное время заражения, мы выбрали основные комплексы в качестве сложной подмножества на основе COACH с индексом Жаккара> 0,34, и в этой подгруппе искали комплексы, содержащие pUL52.

siRNA-опосредованных нокдаунов

Knockdowns проводили путем трансфекции клеток MRC5 siRNA (последовательности см. В разделе gRNA и siRNA) для ACAT1, WASHC2C и CD63. Для анализа титра клетки MRC5 культивировали в 12-луночном планшете и трансфицировали 30 пмоль нацеливающих миРНК или контрольных миРНК с использованием Lipofectamine RNAimax (Thermo Fisher Scientific).Клетки, обработанные миРНК, инфицировали HCMV через 2 дня после трансфекции миРНК и повторно обрабатывали миРНК в тот же день инфицирования, чтобы гарантировать, что интересующие гены останутся подавленными на протяжении всего цикла репликации вируса. Супернатанты собирали при 120 hpi и использовали для анализа титра вируса, как описано выше. Для подтверждения эффективности нокдаунов WASHC2C и CD63 клетки собирали через 48 часов после трансфекции и подвергали анализу PRM, как описано выше. Для подтверждения эффективности нокдаунов ACAT1 клетки собирали через 72 часа после трансфекции и подвергали вестерн-блоттингу.Чтобы оценить влияние нокдаунов WASCHC2C или CD63 на репликацию вируса, клетки трансфицировали миРНК и инфицировали через 48 часов. Когда инфекционная среда была заменена после 2-часовой инкубации, клетки повторно обрабатывали миРНК, чтобы гарантировать, что нокдаун сохраняется на протяжении всей инфекции. Чтобы оценить влияние нокдаунов ACAT1 на репликацию вируса, трансфицированные клетки инфицировали HCMV при MOI 3 через 72 часа после трансфекции, и супернатанты при 120 hpi собирали и использовали для анализа титра вируса, как описано выше.

TUNEL assay

Для оценки гибели клеток, вызванной апоптозом после обработки siRNA или нокаута CRISPR, для количественной оценки по производителям использовали набор для определения гибели клеток in situ (Sigma Aldrich), основанный на окрашивании TUNEL (терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP для мечения никелевых концов). методические рекомендации. Вкратце, клетки в шести повторах культивировали в 96-луночном планшете и анализировали через 48 часов после обработки миРНК. Клетки промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.Фиксированные клетки пермеабилизировали 50 мкл 0,1% тритона, 0,1% цитрата натрия в PBS в течение 2 мин при 4 ° C с последующими двумя промываниями PBS. Затем образцы инкубировали с 25 мкл смеси TUNEL в течение 1 ч при 37 ° C в темноте. Для положительного контроля образцы обрабатывали 10 мкг / мл ДНКазы I в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) с 1 мг / мл БСА в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы вызвать разрывы цепи ДНК; отсутствие раствора фермента обеспечило отрицательный контроль. Образцы трижды промывали PBS в течение 5 мин, инкубировали с 0.1 мкг / мл DAPI в течение 10 мин и трижды промывали PBS в течение 5 мин. Изображения были сделаны системой визуализации Operetta (Perkin Elmer) для количественной оценки процента TUNEL-положительных клеток.

Нормализация содержания белка во время инфекции

Содержание белка во время инфекции было основано на содержании в растворимой фракции при 37 ° C из этого исследования. Чтобы нормализовать содержание белка между моментами заражения и повторениями, мы использовали метод нормализации медианы с помощью NormalizerDE.Среднее количество повторов использовалось как нормализованное содержание белка в каждый момент времени. Для расчета изменений экспрессии белка во время инфицирования в лог-пространстве определяли соотношение ложного и указанного инфекционного времени нормализованной численности.

Расчет изменения NES во время заражения

Чтобы рассчитать NES на основе распределения Ex, мы выполнили анализ обогащения на основе анализа набора генов (GSEA). Разница в эмпирических кумулятивных функциях распределения (ΔECDF) TED для всех количественно определенных белков и аннотированных белков набора фокусирующих генов использовалась для расчета оценки обогащения как \ ({\ int} {\ left | {{\ mathrm {ECDF}}} \ право |} \).п {{\ int} {\ left | {{\ mathrm {ECDF}} _ {{\ mathrm {random}} _ {\ mathrm {i}}}} \ right |}}}} \), где s представляет 1 или –1, как описано ниже, и где ECDF _random вычисляется для всех количественно определенных белков и произвольно выбранных белков, которые представляют собой такое же количество белков для набора фокусирующих генов. n представляет собой количество случайного выбора, и мы устанавливаем n = 1000. Если \ ({\ int} {{\ mathrm {ECDF}} \,> \, 0} \), s представляет 1, в противном случае -1 . Чтобы определить пути, наиболее модулируемые NES во время заражения, мы использовали значения (max (NES во время заражения) — min (NES во время заражения)) и отсортировали их от более высоких значений.Распределение гистограмм Ex всех аннотированных белков или указанного набора генов было подогнано путем оценки плотности ядра с использованием функции gaussian_kde из статистических функций Scipy.

Присвоение транслокационных белков

Транслокационные белки во время инфекции HCMV определяли на основе Jean Beltran et al. ¹² . Мы определили транслокационный белок как белок, который имеет различную предсказанную субклеточную локализацию между неинфицированными и любыми инфицированными состояниями.В наборе данных о транслокатомах ⁵⁵ высокодостоверные транслокационные белки были определены с помощью более 0,6167 баллов по шкале доказательности транслокации (TES).

Молекулярный вес, GRAVY, расчет смещения CvP

Молекулярный вес и GRAVY были рассчитаны с помощью The Sequence Manipulation Suite. Смещение CvP рассчитывалось как { D + E + K + R — ( N + Q + S + T )} / (длина белка) × 100, где D , E , K , R , N , Q , S и T — это количество указанной аминокислоты в белке.Распределения гистограмм были подогнаны оценкой плотности ядра с использованием функции gaussian_kde из статистических функций Scipy.

Создание матриц расстояний вирусных белков

Матрицы евклидовых расстояний вирусных белков были сгруппированы средним (невзвешенный метод парных групп со средним арифметическим; UPGMA) методом Scipy. Цвет тепловой карты представляет собой производную от евклидова расстояния 1 / (1 + E_virus), где E_virus представляет собой евклидово расстояние указанной пары вирусных белков.

Статистика

Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Стьюдента t , если не указано иное. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение или среднее ± стандартное отклонение, как указано. Количество биологических повторов указано как « n =».

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Как собирается большой белковый комплекс в клетке — ScienceDaily

Клетки производят большое количество различных белковых комплексов, каждый из которых состоит из множества отдельных белков.Эти белковые комплексы, такие как, например, рибосомы, регулируют почти все жизненно важные биологические функции клетки.

Биологам удалось определить структуру многих из этих комплексов, но пока мало исследований о том, как отдельные белки собираются, а затем изменяются с течением времени. Традиционных подходов до сих пор оказалось недостаточно для изучения точного хода этих реакций в клетках, особенно когда речь идет о больших комплексах.

Группа исследователей ETH во главе с Карстеном Вайсом и научным сотрудником Евгением Онищенко из Института биохимии ETH Zurich теперь представляет новый подход. Их метод позволяет отслеживать динамику сборок белковых комплексов, даже для очень больших, с высоким временным разрешением. Исследование только что было опубликовано в журнале Cell .

На основе анализа метаболизма

Исследователи ETH называют свой новый подход KARMA, который означает кинетический анализ скорости включения в макромолекулярные сборки и основан на методах исследования метаболических процессов.Ученые, изучающие метаболизм, уже давно используют радиоактивный углерод в своей работе, например, для маркировки молекул глюкозы, которые клетки затем усваивают и метаболизируют. Радиоактивная маркировка позволяет исследователям отслеживать, где и в какой момент времени появляются молекулы глюкозы или их метаболиты.

«Этот тип исследования вдохновил нас на применение аналогичного принципа при изучении реакций, которые происходят при сборке белковых комплексов», — объясняет Вайс. В своем подходе исследователи ETH работают с мечеными аминокислотами, основными строительными блоками белков, которые содержат более тяжелые изотопы углерода и азота.В культуре дрожжевых клеток команда заменяет легкие аминокислоты на их более тяжелые аналоги. Дрожжи используют эти тяжелые аминокислоты в синтезе белка, что приводит к сдвигу молекулярной массы всех вновь продуцируемых белков.

Шкала времени сборки комплекса

Чтобы выделить белковые комплексы, исследователи удаляют дрожжевые клетки из культур через регулярные промежутки времени и используют масс-спектрометрию для измерения крошечной разницы в весе между молекулами с более тяжелыми аминокислотами и молекулами без них.Это указывает на возраст белка в комплексе. В основном, чем старше белок, тем раньше он был включен в комплекс. Основываясь на этих возрастных различиях, исследователи применяют модели кинетического состояния, чтобы в конечном итоге восстановить точную последовательность сборки данного белкового комплекса.

В качестве примера для проверки своего метода Вейс и его команда выбрали комплекс ядерных пор в дрожжевых клетках. Эта структура содержит от 500 до 1000 элементов, состоящих из примерно 30 различных белков, каждый в нескольких копиях, что делает ее одним из крупнейших известных белковых комплексов.

Используя KARMA, биохимики ETH смогли получить подробную карту того, какие модули интегрированы в структуру и когда. Одним из открытий был принцип иерархии: отдельные белки за очень короткое время образуют субъединицы, которые затем собираются от центра к периферии в определенной последовательности.

Подмости прочные

«Мы впервые продемонстрировали, что некоторые белки очень быстро используются в сборке порового комплекса, в то время как другие включаются только примерно через час.«Это невероятно долгое время», — говорит Вейс. Клетка дрожжей делится каждые 90 минут, а это означает, что для завершения сборки этого жизненно важного комплекса пор потребуется почти целое поколение. Именно поэтому сборка новых пор занимает так много времени по сравнению с цикл размножения дрожжей неизвестен.

Исследователи ETH также показывают, что после завершения сборки поры части комплекса становятся очень стабильными и долговечными — например, во внутреннем каркасе почти не заменяются какие-либо компоненты в течение его срока службы.Напротив, белки на периферии комплекса ядерных пор часто заменяются.

Дефектные ядерные поры способствуют развитию болезни

Ядерные поры являются одними из наиболее важных белковых комплексов в клетках, поскольку они отвечают за обмен веществами и молекулами между ядром клетки и цитоплазмой. Например, они транспортируют РНК-мессенджер из ядра в клеточный аппарат вне ядра, которому эти молекулы нужны как чертежи для новых белков.

Более того, ядерные поры играют прямую и косвенную роль в заболеваниях человека. Соответственно, изменения ядерной поры и ее белков могут влиять на развитие таких состояний, как лейкемия, диабет или нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. «В целом, однако, причины, по которым дефекты пор вызывают эти паттерны болезней, не совсем понятны», — говорит Вайс, объясняя, что KARMA может помочь в более глубоком понимании таких проблем в будущем.

Универсальная платформа

«Хотя в этом исследовании мы применили KARMA только к одному белковому комплексу, мы с нетерпением ждем его будущих приложений.«Теперь наш метод позволит нам расшифровать последовательность целого ряда биологических процессов», — говорит Вейс. Их метод можно использовать, например, для изучения молекулярных событий, которые происходят во время цикла заражения такими вирусами, как COVID-19 и потенциально помочь найти новые лекарственные препараты, которые разорвут этот круг.

Новый метод может также применяться к другим биологическим молекулам помимо белков, таким как РНК или липиды.

Структурная классификация белковых комплексов

Образец цитирования: Леви Э.Д., Перейра-Леал Дж. Б., Чотиа С., Тейхманн С.А. (2006) 3D-комплекс: структурная классификация белковых комплексов.PLoS Comput Biol 2 (11): e155. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155

Редактор: Burkhard Rost, Колумбийский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 26 июня 2006 г .; Одобрена: 5 октября 2006 г .; Опубликовано: 17 ноября 2006 г.

Авторские права: © 2006 Levy et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Мы благодарим Совет по медицинским исследованиям и Программу молодых исследователей EMBO за поддержку этой работы.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: PDB, Банк данных белков; PQS, Четвертичная структура белка; QS, Четвертичная структура; QSF, Семейство четвертичных структур; QST, Топология четвертичной структуры

Введение

Большинство белков взаимодействуют с другими белками и образуют белковые комплексы для выполнения своих функций [1].Недавний обзор около 2000 дрожжевых белков показал, что более 80% белков взаимодействуют по крайней мере с одним партнером [2]. Это отражает важность взаимодействия белков внутри клетки. Поэтому очень важно понимать физико-химические свойства, а также эволюцию взаимодействий между белками.

Банк данных по белкам (PDB) [3] предоставляет большое количество структур, которые эффективно обеспечивают молекулярный снимок белков и их взаимодействий с гораздо большим уровнем детализации, чем другие экспериментальные методы.В этом исследовании мы сосредоточены на рентгеновских кристаллографических структурах, которые представляют подавляющее большинство всех структур. Поскольку половина кристаллографических структур представляет собой гомо- или гетеромерные белковые комплексы, кристаллографические данные представляют собой важный источник информации для изучения молекулярных основ белок-белковых взаимодействий и, в более общем плане, образования белковых комплексов.

Чтобы облегчить понимание и доступ к постоянно растущему объему доступной информации о структурах белков, необходима иерархическая классификация белковых комплексов, так же как SCOP [4] и CATH [5] обеспечивают классификацию белковых доменов.Мы подходим к этому, организуя комплексы сначала в терминах топологических классов, в которых каждая полипептидная цепь представлена ​​в виде точки, и рассматривается только образец интерфейсов между цепями. Затем мы подразделяем эти классы, рассматривая структуры, а затем последовательности отдельных субъединиц.

Насколько нам известно, все предыдущие классификации рассматривали части структур, а не целые комплексы. Например, в SCOP [4] и CATH [5] белки делятся на их структурные (CATH) и эволюционные (SCOP) домены, которые впоследствии классифицируются в соответствии с их структурной гомологией с другими доменами.Поскольку домены взаимодействуют друг с другом, как внутри, так и между полипептидными цепями, интерфейсы домен-домен классифицируются в таких базах данных, как SCOPPI [6], 3did [7], iPfam [8], PSIBASE [9] и PIBASE [10].

Белковые комплексы, однако, часто содержат более двух доменов: они могут содержать несколько полипептидных цепей, и каждая цепь может содержать более одного домена. Следовательно, свойства, которые зависят от всего белкового комплекса, нельзя изучать, рассматривая только пары взаимодействующих доменов.Такими свойствами белковых комплексов являются размер, симметрия, эволюция и путь сборки. Были проведены исследования вручную подобранных подмножеств, которые касаются таких вопросов, как эволюция олигомеров [11,12], биохимические и геометрические свойства белковых комплексов [13] или пути сборки в мультисубъединичных белках [14,15]. Самый большой набор комплексов в любой из этих ссылок, по-видимому, составляет около 455 в Бринде и Вишвешваре, поэтому ни одно из этих исследований не фокусировалось на всех известных структурах с точки зрения цельного белкового комплекса .

По историческим, медицинским или другим научным причинам PDB является избыточным, и некоторые структуры, такие как лизоцим фага T4, присутствуют в сотнях копий. Насколько нам известно, ни один метод не позволяет устранить избыточность среди белковых комплексов. Доступные методы разбивают их на неизбыточные наборы доменов (ASTRAL) [16], полипептидные последовательности (ASTRAL) или пары доменов (SCOPPI, 3did). Следовательно, ни один из этих методов не позволяет нам ответить на такой простой вопрос, как «Сколько различных белковых комплексов содержится в PDB?»

Наша структурная классификация целых белковых комплексов (рис. 1) включает новую стратегию визуализации и сравнения комплексов (рис. 2).Мы используем упрощенное графическое представление каждого комплекса, в котором каждая полипептидная цепь является узлом в графе, а цепи с интерфейсом соединены ребрами. Мы сравниваем комплексы с настраиваемой процедурой сопоставления графов, которая учитывает топологию графа, которая представляет собой образец интерфейсов цепочка-цепочка, а также сходство структуры и последовательности между составляющими цепочками. Мы используем эти свойства для создания иерархической классификации белковых комплексов.Он обеспечивает неизбыточный набор белковых комплексов, который можно использовать для получения объективной статистики. Мы проиллюстрируем это, опираясь на разные уровни классификации, чтобы ответить на вопросы, связанные с топологией, симметрией и эволюцией белковых комплексов.

Рисунок 1. Иерархия белковых комплексов известной трехмерной структуры

Иерархия имеет 12 уровней, а именно сверху вниз: топология QS, семейство QS, QS, QS20, QS30… QS100. На вершине иерархии расположено 192 топологии QS.Одна конкретная топология QS (оранжевый кружок) с четырьмя субъединицами раскрыта ниже. Он включает в себя 161 семейств QS, всего , из которых подробно описаны два: E. coli lyase и H. sapiens гемоглобин γ ₄ . Все комплексы семейства QS E. coli кодируются одним геном и, следовательно, соответствуют одному QS. Однако семейство QS для гемоглобина содержит два QS: один с одним геном, гемоглобин γ ₄ , и один с двумя генами, гемоглобин α ₂ β ₂ из H.сапиенс. Последний уровень иерархии указывает количество структур в полном наборе (PDB). Существует 30 повторяющихся комплексов, соответствующих лиазе QS, четыре — гемоглобину γ ₄ QS и 80 — гемоглобину α ₂ β ₂ QS. Мы также видим, что существует 9 978 мономеров, 6 803 димеров, 814 треугольных тримеров и т. Д. Обратите внимание, что существуют промежуточные уровни с использованием пороговых значений идентичности последовательностей (с четвертого по двенадцатый уровень) между уровнем QS и полным набором, которые здесь подробно не показаны. .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g001

Рис. 2. Представление белковых комплексов в виде графиков

(A) Каждый белковый комплекс преобразован в граф, где узлы представляют полипептидные цепи, а края — биологические интерфейсы. между цепями.

(B) Все комплексы сравниваются друг с другом с использованием настроенной процедуры сопоставления графиков. Комплексы с одинаковой топологией графа сгруппированы, чтобы сформировать верхний уровень иерархии, как показано зелеными прямоугольниками.Если, кроме того, структуры субъединиц связаны своей архитектурой домена SCOP, они группируются на втором уровне, показанном красными полями. Структуры были визуализированы с помощью VMD [51].

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g002

Результаты / Обсуждение

Набор данных белковых комплексов

Мы извлекли все биологические единицы из PDB (октябрь 2005 г.), которые, по словам кураторов PDB, представляют собой белковые комплексы в их физиологическом состоянии.Эта информация достигается комбинацией заявлений авторов структур, литературных источников и автоматических прогнозов, сделанных сервером четвертичной структуры белка (PQS) [17,18]. Биологическая единица PDB более подробно описана в Протоколе S1. Вывод биологической единицы из кристаллографической структуры — сложный и подверженный ошибкам процесс [17,19,20]. В Ponstingl et al. (2003), по оценкам, автоматический метод прогнозирования имеет частоту ошибок в 16%. Позже мы обсудим, как наша классификация белковых комплексов может облегчить этот процесс и как мы использовали ее для выявления возможных ошибок в биологических единицах.

Мы отфильтровали биологические единицы в соответствии со следующими критериями: мы рассматривали только структуры, представленные в SCOP 1.69 [4], потому что наша методология требует назначения суперсемейных областей SCOP. Мы удалили вирусные капсиды и любой комплекс, содержащий более 62 белковых цепей, поскольку файлы PDB не могут обрабатывать более 62 ссылок на отдельные цепи (a – z, A – Z, 0–9), а также из-за высокой стоимости вычислений. Мы отказались от структур, которые были разделены на два или более комплекса при удалении небиологических интерфейсов, как определено в следующем разделе.Когда две или более копии комплекса присутствуют в асимметричной единице, кураторы PDB создают множество копий одной и той же биологической единицы. В этих случаях мы сохраняем только одну копию.

После применения этих фильтров мы получили 21 037 структур, которые мы использовали в этом исследовании.

Извлечение фундаментальных структурных особенностей из белковых комплексов

Предпосылкой для создания иерархической классификации белковых комплексов является быстрый способ сравнения комплексов друг с другом.Полное атомное представление непрактично, потому что автоматическая структурная суперпозиция трудна, если не невозможна, для расходящихся пар структур [21]. Вместо этого нам нужно обобщить фундаментальные структурные особенности белковых комплексов в представление, которым легче манипулировать.

Какой набор функций мы выберем? Естественный способ разбить комплекс — на составляющие его цепи, каждая из которых является продуктом гена. Характер взаимодействия между цепями определяет QS и, следовательно, функцию комплекса.В отличие от крупномасштабных протеомных экспериментов, где комплексы состоят из списка составляющих субъединиц, структуры PDB предоставляют нам QS: точную стехиометрию субъединиц и паттерн интерфейсов между ними. QS часто играет роль в регуляции функции белков, и ее нарушение может быть связано с заболеваниями [22,23]. Например, в случае супероксиддисмутазы нарушение QS дестабилизирует белок и связано с невропатологией [23].

Для извлечения паттерна интерфейсов из структур мы вычисляем контакты между парами атомных групп.Мы определяем границу раздела белок-белок пороговым значением не менее десяти находящихся в контакте остатков, где количество остатков является суммой остатков, внесенных в границу раздела обеими цепями. Контакт остаток-остаток считается, если какая-либо пара атомных групп ближе, чем сумма их ван-дер-ваальсовых радиусов плюс 0,5 Å [24]. Мы исследовали эффект изменения порога в десять остатков на границе раздела и обнаружили, что это имеет лишь незначительное влияние на классификацию. Подробную информацию см. В Таблице S1.

Поскольку одна из наших целей состоит в том, чтобы сравнить эволюционную консервацию белковых цепей как внутри, так и между комплексами, мы должны включить информацию, которая позволяет нам связывать цепи друг с другом. Для этого мы используем структурную информацию, определенную доменами суперсемейства SCOP, а также информацию о последовательности. Порядок N- и C-конца доменов суперсемейства SCOP позволяет нам обнаруживать отдаленные отношения, в то время как сходство последовательностей позволяет проводить сравнения на более тонком уровне, например, фильтрацию идентичных цепочек.

Мы выбрали архитектуру цепного домена, последовательность и контакты цепь-цепь для представления белковых комплексов, потому что это универсальные атрибуты комплексов. Напротив, другие атрибуты, такие как присутствие каталитического сайта или временный или обязательный характер интерфейса, не являются универсальными и не всегда доступны из структуры. Однако эти атрибуты можно легко спроецировать на нашу схему классификации, чтобы увидеть, как они соотносятся между белковыми комплексами, имеющими эволюционно связанные цепи.

К этому базовому представлению мы добавляем информацию о симметрии, которая уточняет описание расположения субъединиц за пределами паттерна взаимодействия. Мы обрабатываем симметрию каждого комплекса методом исчерпывающего поиска. Вкратце, мы центрируем координаты комплекса по его центру масс; Затем мы генерируем 600 равномерно расположенных осей, проходящих через центр масс. Мы проверяем, накладывается ли комплекс, повернутый на разные углы вокруг каждой из осей, на неповращенный комплекс.Отсюда выводим тип симметрии. Более подробное описание см. В разделе «Методы» и на рисунке S1.

График прост и хорошо подходит для хранения и визуализации этой информации (рис. 2A). Сам граф обеспечивает то, что мы называем топологией комплекса, то есть количество полипептидных цепей (узлов) и их структуру интерфейсов (ребер). Метка на графике несет информацию о симметрии. Метка на каждом краю указывает количество остатков на границе раздела.С каждым узлом на графике связаны еще две части информации: аминокислотная последовательность и архитектура домена SCOP цепи. Эти два атрибута предоставляют информацию о последовательности, структурном сходстве и эволюционных отношениях между цепями. Затем мы сравниваем графические представления комплексов для построения иерархической классификации.

Обратите внимание, что мы также включаем в классификацию мономерные белки и представляем их одним узлом. Хотя мономерные белки не являются комплексами, их включение позволяет нам сравнивать их частоту и другие свойства с характеристиками белковых комплексов.

Сравнение комплексов и обзор классификации

Преимущество графического представления состоит в том, что оно позволяет быстро и легко сравнивать с использованием алгоритма сопоставления графов. Поскольку графы несут определенные атрибуты, касающиеся структуры и последовательности цепочек, а также симметрии комплекса, нам пришлось реализовать настроенную версию процедуры сопоставления графов, чтобы учесть эту информацию. Подробные сведения об алгоритмах см. В разделе «Методы».

Важно отметить, что наша процедура сопоставления графов позволяет учитывать различные атрибуты, как показано в Таблице 1 с тегами «Y» и «N». Таблица показывает, что 12 уровней иерархической классификации создаются с использованием одного или нескольких из следующих пяти критериев для сравнения комплексов друг с другом: (i) топология, представленная количеством узлов и их схемой контактов, (ii) ) структуру каждой составляющей цепи в форме архитектуры домена SCOP, (iii) количество неидентичных цепей на архитектуру домена в каждом комплексе, (iv) аминокислотную последовательность каждой составляющей цепи для сравнения между комплексами, и (v ) симметрия комплекса.

С помощью этих пяти критериев мы разрабатываем все более строгие определения сходства между комплексами, как показано в таблице 1. Первое определение, которое является наиболее мягким, основано исключительно на топологии графов. Это означает, что любые два комплекса с одинаковым количеством цепочек (узлов) и одинаковым рисунком контактов (ребер) принадлежат к одной и той же группе, даже если их цепи структурно не связаны. Мы используем это определение для создания групп, которые образуют верхний уровень классификации, и мы называем эти группы топологиями четвертичной структуры (топологиями QS или QST), и мы находим 192 из них в текущем наборе данных.

Начиная со второго уровня классификации, мы включаем информацию об эволюционных отношениях. Определение эволюционной взаимосвязи, которое мы используем на этом уровне, заключается в том, что пары совпадающих узлов (полипептидов) между двумя графами должны иметь похожие трехмерные структуры, то есть одинаковую архитектуру домена SCOP. Это означает, что две совпадающие полипептидные цепи иногда имеют небольшую идентичность последовательностей или совсем не идентичны, но имеют только структурное сходство, т.е. они отдаленно гомологичны. Группы комплексов на этом уровне классификации называются семействами QS, и мы находим 3151 из них в PDB.

На следующем уровне мы дополнительно требуем, чтобы два совпадающих комплекса имели одинаковое количество генов, кодирующих каждую архитектуру домена. Это проиллюстрировано на рисунке 1, где семейство QS гемоглобина делится на две группы: одна содержит гемоглобин γ ₄ , образованный одним геном, и одна, содержащая гемоглобин α ₂ β ₂ , образованный двумя гомологичными генами. Мы называем группы на этом уровне СМО. На протяжении всего исследования мы использовали этот уровень, состоящий из 3 236 QS , в качестве эталонного набора неизбыточных белковых комплексов .Обратите внимание, что наш выбор использования этого уровня в качестве неизбыточного набора связан с нашим интересом к событиям дупликации генов, но могут использоваться и другие уровни, в зависимости от заданного вопроса.

Начиная с четвертого уровня и ниже, мы группируем белковые комплексы в соответствии с сходством последовательностей между совпадающими полипептидами двух комплексов, от 20% идентичности на четвертом уровне до 100% на двенадцатом уровне. Мы называем эти группы QS20 / 30/40 и т. Д. По мере ужесточения порога сходства последовательностей 3 236 QS-групп распадаются на более мелкие подгруппы, от 4 452 QS20 на четвертом уровне до 12 231 QS100 на двенадцатом уровне.

В дополнение к четырем критериям, описанным выше, мы можем наложить требование, чтобы два комплекса должны были иметь один и тот же тип симметрии, чтобы быть частью одной и той же группы. Поскольку этот выбор сделан для всех уровней, доступны две классификации: одна, в которой симметрия используется в процессе сравнения, и другая, где она не используется. Когда используется симметрия, мы разделяем любую группу белковых комплексов на две или несколько групп, чтобы все комплексы в группе имели одинаковую симметрию. Однако, как мы покажем позже, только несколько групп пришлось разделить по симметрии.

Иерархическая классификация проиллюстрирована на рисунке 1. Первые три уровня соответствуют определениям с 1 по 3 в таблице 1. Обратите внимание, что на рисунке 1 «QS20 — QS100» представляет подуровни QS, которые не показаны, но будут обсуждаться ниже. Последний уровень соответствует полному набору данных PDB. В следующих трех разделах мы опишем первые три уровня более подробно и проиллюстрируем их полезность для решения различных вопросов о белковых комплексах.

Топологии четвертичной структуры (уровень 1)

Топологии

QS представляют количество субъединиц (узлов) в комплексе и структуру интерфейсов (ребер) между ними и, таким образом, являются только топологическим уровнем.С математической точки зрения топология QS — это непомеченный связный граф. Количество возможных графов для данного количества узлов N может быть вычислено и резко увеличивается с N [25] . Одна топология QS существует для N = 1 или N = 2, в то время как существует 6 топологий QS для N = 4 и 261 080 для N = 9. Для сравнения мы наблюдаем небольшое число, 192 Всего топологий QS, на которые приходится 21 037 белковых комплексов.Это низкое число предполагает, что одни топологии QS предпочтительнее других во вселенной белков. Все топологии QS, содержащие до девяти цепочек, показаны на рисунке 3, а число над каждым QST указывает количество QS (неизбыточных структур), которому он соответствует. Визуальный осмотр QST предлагает три основных ограничения, ограничивающих их количество.

Рисунок 3. Примеры топологий четвертичной структуры

(A) Показаны все QST для комплексов, содержащих до девяти субъединиц, что составляет более 96% неизбыточного набора QS и более 98% всех комплексов в PDB.Топологии, совместимые с симметричным комплексом, помечаются аннотациями s, , а топологии, в которых все подблоки имеют одинаковое количество интерфейсов (ребер), отмечены звездочкой (*).

(B) Примеры больших комплексов, которые являются единственными представителями своих соответствующих топологий (QST). Приведены коды PDB. 1pf9, E. coli GroEL-GroES-ADP; 1eaf, синтетическая конструкция, пируватдегидрогеназа; 1shs, малый белок теплового шока Methanococcus jannaschii; 1b5s, дигидролипоилтрансацетилаза Bacillus stearothermophilus; 1j2q, альфа-кольцо протезом Archaeoglobus fulgidus 20S.Интересно отметить, что макеты графов напоминают пространственное расположение субъединиц.

(C) Вероятные ошибки в биологических единицах PDB: QST гомомеров с различным количеством контактов между субъединицами. Количество ошибочных QS в каждой топологии указано над каждым графиком.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g003

Во-первых, как показано на рисунке 4, большинство комплексов содержат небольшое количество цепочек и поэтому могут принимать очень ограниченное количество топологий.В наборе PDB мы наблюдаем резкое уменьшение доли комплексов по мере увеличения числа их цепей, так что 94% структур содержат четыре цепи или меньше и обнаруживаются только в десяти QST.

Рис. 4. Распределение размеров белковых комплексов в иерархии

Гистограмма количества субъединиц на белковый комплекс. Комплексы меньшего размера более многочисленны, чем более крупные комплексы, а комплексы с четным числом субъединиц имеют тенденцию быть более многочисленными, чем комплексы с нечетным числом субъединиц, на обоих уровнях иерархии.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g004

Второе ограничение, ограничивающее количество топологий QS, заключается в составе PDB, который состоит в основном из гомоолигомерных комплексов, то есть образованных комплексов несколькими копиями одного и того же белка. Поскольку интерфейсы белок-белок часто являются гидрофобными [26,27], различное количество интерфейсов в двух идентичных белках означает, что гидрофобная поверхность подвергается воздействию растворителя в одном из них, что было бы неблагоприятно для стабильности белка.Итак, в гомомерных комплексах мы ожидаем, что все цепи будут иметь одинаковое количество интерфейсов. Исключая мономеры, мы наблюдаем, что это имеет место для 96% гомомерных комплексов, которые представляют 41% всей PDB. В 4% случаев, когда этот критерий не соблюдается, мы наблюдаем большую долю ошибочных QS, как обсуждается ниже. Тогда чисто гомомерные комплексы очень ограничены по своей топологии, потому что для комплекса с N цепями ( N ≥ 3) существует только N- 2 топологий с таким же количеством интерфейсов на цепь . Например, только семь топологий удовлетворяют этому критерию для N = 9, небольшое число по сравнению с 261 080 возможными. На рисунке 3A показано, что наиболее часто используемые топологии — это те, для которых все субъединицы имеют одинаковый рисунок контактов, и они отмечены звездочкой.

Третье ограничение, ограничивающее количество QST, состоит в том, что 85% комплексов в PDB являются симметричными. Эта тенденция отражена на Рисунке 4, показывая, что предпочтение отдается комплексам с четным числом субъединиц, но становится более явным при взгляде на QST на Рисунке 3.Графическое представление отражает возможность наличия или отсутствия симметрии. Для любого количества субъединиц наиболее часто встречаются топологии QS, совместимые с симметричным комплексом (отмечены буквой «s»). Например, у тетрамеров обнаружено шесть топологий QS, причем четыре наиболее распространенных совместимы с симметрией, а две менее распространенные — нет.

Таким образом, топологии QS позволяют исследовать организацию цепей в белковых комплексах. Лучше всего это иллюстрируют большие белковые комплексы, показанные на рисунке 3B, где графическое представление намекает на трехмерную структуру.Это представление подчеркивает, что белковые комплексы в PDB обычно удовлетворяют трем критериям: они преимущественно маленькие, гомомерные и симметричные, что резко ограничивает топологии QS по сравнению со всеми возможными топологиями графов. Этот результат обладает потенциальной предсказательной силой и может использоваться в качестве ограничений для предсказания топологии больших сборок [28]. Также ниже мы оценим, в какой степени этот результат, наблюдаемый на подмножестве белков, присутствующих в PDB, может быть распространен на белки SwissProt [29].

Семьи четвертичной структуры (уровень 2)

Когда мы рассматриваем структурное сходство в форме идентичности архитектуры домена между парами совпадающих субъединиц двух комплексов, 192 QSTs распадаются на 3151 семейство четвертичных структур (QSFs) (Table 1, definition 2). Например, на рисунке 1 оранжевый кружок выделяет тетрамерный QST, который распадается на 161 QSF , , два из которых показаны: лиаза Escherichia coli и гемоглобин Homo sapiens.

На следующем уровне классификации, уровне QS (уровень 3), будет добавлено ограничение на количество генов на архитектуру домена (таблица 1, определение 3).Например, QSF гемоглобина H. sapiens распадается на два QS: (i) гемоглобины γ ₄ (образованные четырьмя копиями одного гена) и (ii) гемоглобины α ₂ β ₂ (образован двумя копиями двух гомологичных генов). Однако все структуры, присутствующие в QSF E. coli, состоят только из одного гена, и, следовательно, QSF содержит единственный QS.

Уровень QSF может использоваться для ответа на вопросы, связанные с эволюцией белковых комплексов, в частности, с ролью дупликации генов.Каждый QSF, соответствующий двум или более QS, указывает на комплексы со сходной структурой, но с разным числом генов, т.е. комплексы, подвергшиеся внутренней дупликации генов [30–33]. Этот тип события редко встречается в PDB: 83 QSF соответствуют двум QS, как для гемоглобинов, и один QSF соответствует трем QS, в то время как другие 3070 QSF соответствуют одному QS.

Четвертичные конструкции (уровень 3)

Мы видели выше, что существует несколько QSF, которые соответствуют нескольким QS, так что количество QS аналогично количеству QSF.В PDB 3 236 QS. Некоторые из них соответствуют множественным избыточным структурам в PDB. Например, на рис. 1 показано, что 30 структур соответствуют QS E. coli, четыре соответствуют гемоглобину γ ₄ QS, а 80 соответствуют гемоглобину α ₂ β ₂ QS. В таблице 2 мы перечисляем 12 QS, содержащих наибольшее количество избыточных белковых комплексов в PDB. Иммуноглобулины и протеазы ВИЧ-1 являются наиболее избыточными с 281 и 202 комплексами, соответственно, в полной PDB.Уровень QS представляет собой неизбыточную версию PDB, где случаи, подобные показанным в таблице 2, сокращены до одной записи.

В структурной классификации белков SCOP считается, что белки с одними и теми же доменами суперсемейства произошли от общего предка и, таким образом, связаны эволюционным родством. Точно так же в классификации 3D-комплексов белковые комплексы, сгруппированные в одном QS, имеют общие эволюционно связанные белки. Однако неизвестно, связаны ли целые комплексы эволюционно, т.е.е., взаимодействовали ли их предковые белки таким же образом. Поэтому важно отметить, что в пределах одной и той же QS белки двух разных комплексов, даже если они эволюционно связаны, в принципе могут взаимодействовать по-разному, то есть с интерфейсами на разных поверхностях структуры. Одним из примеров являются различные режимы димеризации лектинов, обсуждаемые в [34]. Однако, если кто-то действительно хочет минимизировать различия в геометрии интерфейсов, мы предлагаем два способа достижения этого: ограничение по схожести последовательностей или по симметрии.Для комплексов с идентичностью последовательностей от 30% до 40% недавняя работа предполагает, что различия в геометрии интерфейса будут редкими [35]. Уровни ниже уровня QS используют сходство последовательностей для сравнения комплексов и обсуждаются в следующем разделе.

Отметим также, что группирование белков с различными режимами взаимодействия не влияет на использование QS в качестве неизбыточного представления PDB. Напротив, группы, сформированные на уровне QS, можно использовать для изучения сохранения взаимодействий в белковых комплексах в зависимости от их размера, места, формы или химической природы.В этой статье мы проиллюстрируем использование QS в качестве неизбыточного набора для обзора распределения размеров белковых комплексов, а также относительной распространенности их топологий, как описано выше. Мы также будем использовать его позже для сравнения распределения размеров гомоолигомеров в PDB и в базе данных SwissProt. Могут быть проведены многие другие исследования; например, этот уровень можно использовать для изучения разнообразия олигомерных состояний на семейство доменов или архитектуру домена.

Добавление информации о сходстве последовательностей в классификацию (уровни с 4 по 12)

Чтобы добавить ограничения на сходство последовательностей, нам требуется порог идентичности последовательностей для сопоставления пар белков в наших критериях сопоставления графиков от уровня 4 до уровня 12, как указано в таблице 1.Мы начинаем с 20% порога идентичности, что дает 4 452 группы, и увеличиваем его с шагом 10%, чтобы достичь 12 231 группы при пороге 100% идентичности. Мы называем группы QS N, , где N обозначает используемый порог идентичности в процентах.

Количество групп для разных уровней классификации показано на рисунке 5A. Увеличение от 3 236 QS до 21 037 комплексов в общем наборе не является линейным; вместо этого его можно разделить на четыре фазы: (i) всплеск количества групп между QS (3236) и QS30 (5136), (ii) постепенное увеличение между QS30 и QS90 (7713), (iii) резкое увеличение между QS90 и QS100 (12 231), и (iv) резкий скачок между QS100 и всем набором PDB (21 037).

Рисунок 5. Избыточность в банке данных белков на нескольких уровнях сходства последовательностей

(A) Количество структур на каждом уровне базы данных 3D Complex, от 192 QST до общего числа структур в PDB (21 037). Отметки на линии под графиком указывают на последовательные пары уровней, которые нанесены на график (B – E).

(B) Количество QS30 на QS. Обратите внимание, что семейства QS почти идентичны QS. Первый столбец на гистограмме показывает, что около 2500 QS соответствуют одному QS30; вторая полоса представляет 250 QS, которые соответствуют двум QS30.

(C) Количество QS90 на QS30.

(D) Количество QS100 на QS90.

(E) Количество комплексов в комплекте на QS100.

Все дистрибутивы демонстрируют безмасштабное поведение в том смысле, что большая часть групп идентична на любых двух последовательных уровнях, тогда как небольшое количество очень избыточно. Добавление информации о симметрии не меняет эту тенденцию, как показано в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g005

На рис. 5B – 5E показано распределение избыточности между этими четырьмя парами уровней. Например, рисунок 5B показывает, что ~ 2500 QS соответствуют одному QS30, ~ 300 QS разделены на два QS30, ~ 150 QS разделены на три QS30, два QS разделены на пятнадцать QS30 и т. Д. Это показывает, что большинство белковых комплексов сгруппированы вместе в одни и те же QS на основе структурного сходства показывают уровни сходства последовательностей выше 30% для всех своих цепей, в то время как некоторые показывают более низкие уровни сходства последовательностей.Поразительно, но распределение избыточности между последующими парами уровней QS, такими как от QS30 до QS90 и от QS90 до QS100, отражает распределение избыточности между QS и QS30, даже несмотря на то, что источники избыточности не связаны. Например, распределение между QS30 и QS90 отражает умеренное расхождение последовательностей между родственными комплексами. Избыточность, наблюдаемая между QS90 и QS100, по существу соответствует искусственным точечным мутациям. Наконец, избыточность, наблюдаемая между QS100 и всей PDB, является максимальной: почти половина белковых комплексов в PDB соответствует по крайней мере одной другой структуре с идентичной последовательностью составляющих субъединиц.

Добавление информации о симметрии в классификацию: альтернативная иерархия

Знание симметрии комплекса дает информацию о трехмерном расположении субъединиц, которая не обеспечивается графическим представлением. Например, есть два симметричных способа расположения субъединиц гомотетрамера. Один из них имеет циклическую симметрию, в которой четыре субъединицы связаны одной 4-кратной осью, называемой симметрией C4, как показано на рисунке 6. Другой — двугранной симметрией, в которой четыре субъединицы связаны тремя двукратными связями. оси, называемые симметрией D2 (рис. 6).Априори нельзя отличить два типа симметрии только от графического представления. Чтобы оценить, достаточно ли графического представления для объяснения пространственного расположения субъединиц, мы спросили, могут ли QS содержать комплексы с разной симметрией.

Рис. 6. Циклическая и двугранная симметрии

(C2) Циклическая симметрия: две субъединицы связаны одной двойной осью, показанной пунктирной линией. Эллипс на конце оси симметрии отмечает ось 2-го порядка.Почти все гомодимеры обладают симметрией C2. Симметрия C2 обозначается термином «2» в кристаллографической номенклатуре Германа-Могена, показанной красным цветом под C2.

(C4) Циклическая симметрия: четыре субъединицы связаны одной 4-кратной осью. Квадрат на конце оси симметрии отмечает ось 4-го порядка.

(D2) Диэдральная симметрия: четыре субъединицы связаны тремя осями 2-го порядка. Симметрия D2 может быть построена из двух димеров C2. Обратите внимание на разницу между симметриями D2 и C4: два типа симметрии, каждый из которых имеет четыре субъединицы.

(D4) Двугранная симметрия: восемь субъединиц связаны друг с другом одной 4-кратной осью и двумя 2-кратными осями. Обратите внимание, что симметрия D4 может быть построена путем наложения двух тетрамеров C4, как показано, или четырех димеров C2 (не показано).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g006

Мы рассчитали симметрии и псевдосимметрии для всех структур, как кратко описано выше и подробно в разделе «Методы». Мы классифицируем комплексы на две категории, связанные с симметрией.Мы различаем комплексы, которые могут быть или не могут быть симметричными, в зависимости от состава их полипептидной цепи. Например, гомодимеры могут быть симметричными, а гетеродимеры негомологичных цепей — нет. Это более подробно объясняется в разделе «Методы». Более того, СМО с множественными комплексами могут содержать несколько разных типов симметрии, тогда как СМО с одним комплексом явно не могут.

Ниже мы увидим, что только небольшая часть СМО содержит комплексы с различной симметрией, что обеспечивает поддержку нашего использования представления двумерного графа для сравнения трехмерных комплексов.Другими словами, в большинстве случаев один QS-граф представляет собой комплексы, имеющие один и тот же тип симметрии.

Графическое представление как средство правильной идентификации биологических единиц

Во-первых, мы искали разногласия в симметрии среди комплексов внутри QS, чтобы идентифицировать ошибки или необычные комплексы. Среди 841 СМО с возможной симметрией, содержащих множественные комплексы, мы обнаружили, что 109 СМО (13%) содержали смешанные типы симметрии. Ручной осмотр показал, что 93 из этих случаев на самом деле связаны с наличием и отсутствием симметрии в комплексах каждой QS.Причина отсутствия симметрии либо биологическая, например, из-за конформационного изменения (16 случаев), либо из-за ошибки в биологической единице PDB (42 случая). Также было два случая ложноотрицательного результата в нашей процедуре поиска симметрии и 33 неоднозначных случая, которые мы не смогли разрешить. Есть еще 16 QS с двумя разными типами симметрии. Из них семь являются истинными биологическими случаями, пять — ошибками в биологической единице PDB, а три — неразрешенными. Коды PDB вероятных ошибочных биологических единиц представлены в таблицах S2A и S2B.

В дополнение к смешанным симметриям, дополнительные критерии для фильтрации ошибок могут быть получены из представления белкового комплекса в виде графика. Например, в гомомерных комплексах, в которых все субъединицы идентичны, ожидается, что все цепи будут иметь одинаковое количество интерфейсов. Графическое представление позволило выявить случаи, когда это требование не выполняется.

Различие в количестве интерфейсов субъединиц внутри гомомерного комплекса может быть биологическим и в большинстве случаев связано с конформационными изменениями.Примером является гексамерный прокариотический фактор терминации транскрипции Rho (PDB 1pv4), который образует открытое кольцо, приводящее к топологии линейного графа в его несвязанном состоянии [36]. Кольцо замыкается при связывании РНК, и поэтому предположительно в этом состоянии все субъединицы образуют два интерфейса.

Однако в некоторых случаях топология асимметричного графа гомомерных комплексов соответствует ошибке в определении биологической единицы PDB. На рисунке 3C мы показываем четыре различных топологии QS и количество неправильно определенных биологических единиц, связанных с ними.Мы предоставляем идентификаторы PDB ошибочных случаев в таблице S2C. В таблице S2D мы приводим идентификаторы 62 возможных дополнительных ошибок, обнаруженных во время описанного выше поиска, но для которых не было доступно литературных источников.

Сравнение биологических единиц PDB и PQS

PDB и серверы PQS — единственные ресурсы, которые предоставляют информацию о биологических единицах кристаллографических структур. Существенное различие между этими двумя ресурсами заключается в том, что биологические единицы PDB частично настраиваются вручную, тогда как единицы из PQS генерируются полностью автоматически.Поэтому интересно сравнить степень согласия между двумя базами данных.

Ручная проверка и отбор более 20 000 биологических единиц, присутствующих в обеих базах данных, занимает очень много времени. Однако мы можем выявить существенные различия, сравнив гораздо меньшее количество QST. Мы видели, что биологические единицы PDB соответствуют 192 QST. PQS дает немного большее количество 218 QST. При сравнении двух наборов мы находим 155 QST, общих для PDB и PQS, подразумевая 37 исключительных для PDB и 68 исключительных для PQS.Мы вручную отобрали структуры исключительно для каждой базы данных и обнаружили, что 19 из 40 QST, исключительных для PDB, и 42 из 68 QST, исключительных для PQS, являются вероятными ошибками. Коды доступа этих структур показаны в таблицах S2E и S2F. Часто ошибочная биологическая единица в одной базе данных верна в другой. Например, структура 2dhq, 3-дегидрохиназа, состоящая из 12 идентичных субъединиц [37], находится в правильном состоянии в PQS, но имеет только десять субъединиц в биологической единице PDB.Противоположный пример — фермент MenB из Mycobacterium tuberculosis (1q51), который состоит из гомогексамера [38]. Здесь биологическая единица PDB верна, в то время как в PQS фермент описывается как додекамер (12 субъединиц). Эти примеры показывают, что комбинация обоих ресурсов может быть ценным подходом для лечения биологических единиц.

Четвертичная структура гомо-олигомеров вне банка данных белков

В разделе о QST мы показали, что большинство комплексов в PDB небольшие, гомомерные и симметричные.Насколько общий результат? PDB — это ограниченный набор данных, в котором недостаточно представлены трансмембранные белки, регионы низкой сложности и неупорядоченные регионы [39,40], и в котором также наблюдаются функциональные отклонения, хотя проекты структурной геномики сокращают разрыв [39]. Поэтому теперь мы сравниваем частоту гомомеров в полной PDB, уровень QS PDB, полный SwissProt и подмножества белков человека и E. coli в SwissProt.

Интересно, что тенденция PDB полностью согласуется с нашими наблюдениями в SwissProt, как показано на рисунке 7.В PDB мы наблюдаем 46% гомоолигомеров в полном наборе, 60% в неизбыточном наборе и от 71% до 73% в SwissProt. Таким образом, наш неизбыточный набор больше похож на SwissProt, чем на весь PDB. Согласованность есть даже на более подробном уровне во всех пяти наборах данных: среди комплексов размером четыре или более предпочтение отдается четному количеству субъединиц. Гомомеры с нечетным числом субъединиц могут принимать только циклическую симметрию, тогда как гомомеры с четными номерами с четырьмя или более субъединицами могут принимать либо диэдрическую, либо циклическую симметрию [41] (Рисунок 6).Следовательно, предпочтение четного числа субъединиц предполагает, что большинство этих комплексов обладают двугранной симметрией. Действительно, комплексы PDB размера четыре или более с четным числом субъединиц принимают двугранную симметрию в 80% случаев и циклические в 20%. Предположительно это связано с тем, что эволюция и стабильность диэдральных комплексов более благоприятны, чем циклических. Тесное соглашение между PDB и SwissProt поддерживает PDB как репрезентативный набор QST.

Рисунок 7.Размер гомомерных комплексов в банке данных по белкам и в SwissProt

Гистограмма показывает относительное содержание мономеров и гомоолигомеров разных размеров в PDB и SwissProt. Показаны два набора PDB: полный набор и неизбыточный набор QS. Показаны три набора SwissProt: полный набор SwissProt, а также подмножества Human и E. coli. Тенденция во всех наборах схожа и подчеркивает важность механизма самосборки, который связан со многими функциональными возможностями, обсуждаемыми в тексте.Олигомерное состояние белков в SwissProt было извлечено из поля аннотации субъединиц, и аннотации, выведенные на основе сходства, не учитывались.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0020155.g007

Все пять наборов данных показывают, что гомоолигомеризация очень широко распространена. Это может быть связано с тем, что он обеспечивает простые способы регулирования функции белка. Он может служить датчиком концентрации белка или pH, при котором происходит самосборка и запускается функция, как в случае протеазы гибели клеток каспазы-9 [42].Он может обеспечивать кооперативность через аллостерический механизм, как в случае с гемоглобином [43]. Он также может служить шаблоном для объединения белков и запуска функции, как в случае фактора некроза опухоли [44]. Это важное сообщение, поскольку недавние достижения в крупномасштабном картировании белковых комплексов с помощью масс-спектрометрии не учитывают стехиометрию субъединиц. Это может создать изображение клетки, в которой белки взаимодействуют только с другими белками, без учета важности гомоолигомеризации.

Интересно отметить очевидное противоречие между крупномасштабными данными протеомики и структурными данными. По данным протеомики, большинство белков связаны между собой в «гигантский компонент» [45], в то время как в PDB имеется несколько гетеромерных белковых комплексов, и большинство из них гомомерные. Это кажущееся противоречие проистекает из того факта, что небольшие стабильные комплексы легче всего кристаллизовать. С другой стороны, цель протеомных проектов — максимизировать охват и убрать все взаимодействия.Многие гомомерные комплексы того типа, который наблюдается в PDB, вероятно, лежат в основе более крупных мультибелковых комплексов, наблюдаемых в наборах данных протеомики. Например, протеасома 20S в PDB состоит из гомомерных колец [46] и образует каталитическое ядро ​​комплекса 26S, которое содержит намного больше белков.

Комплексная база данных 3D и веб-сервер

Иерархическая классификация всех комплексов в PDB доступна в виде базы данных в Интернете по адресу http: // www.3Dcomplex.org. Мы предварительно рассчитали три классификации, каждая с информацией о симметрии и без нее. Обратите внимание, что даже без выбора симметрии в качестве критерия классификации информация о симметрии все равно отображается, так что можно увидеть, содержит ли группа одну или несколько симметрий. Две из предварительно вычисленных классификаций начинаются с топологии QS и различаются комбинацией уровней идентичности последовательностей. Третья предварительно рассчитанная классификация начинается на уровне QS, так что все QS могут быть просмотрены на одной странице.

Также можно выбрать любую комбинацию уровней в классификации и просмотреть результат, вычисленный на лету. Объединение различных уровней в классификации дает разные наборы комплексов, которые можно рассматривать вместе. Например, при выборе только первого и последнего уровня топологии QS связываются со всеми структурами PDB. Это можно использовать, например, для обзора всех структур PDB, состоящих из четырех белков, связанных определенным образом.

В базе данных также можно искать по коду доступа PDB, по идентификатору суперсемейства SCOP или архитектуре домена, по ключевому слову и по типу симметрии.Примером применения средства поиска является запрос всех белковых комплексов, в которых участвует одно конкретное суперсемейство доменов, чтобы узнать об эволюции взаимодействий этого суперсемейства. Можно также искать комбинацию терминов, таких как трансферазы, которые имеют симметрию D2.

Помимо возможностей автоматического поиска и загрузки, ручной осмотр комплексов облегчается новым режимом визуализации, представляющим комплексы в виде графиков.Это позволяет анализировать и сравнивать многие аспекты комплексов с первого взгляда, которые гораздо труднее извлечь из стандартных представлений трехмерных структур. Для всех, кто интересуется конкретной структурой, просмотр структуры в классификации 3D-комплекса позволяет быстро сравнить ее с другими комплексами. Например, можно быстро получить представление о размере и структуре интерфейсов в интересующем комплексе и связанных комплексах.

Выводы

Большинство белков действуют совместно с другими белками, образуя постоянные или временные комплексы.Понимание этих взаимодействий на атомарном уровне возможно только путем анализа белковых структур. Здесь мы представили новый метод описания и сравнения структур белковых комплексов, который мы использовали для построения иерархической системы классификации.

Эта иерархическая классификация позволяет нам ответить на вопрос: «Сколько различных комплексов существует в PDB?» В зависимости от уровня детализации мы находим от 192 структур на верхнем уровне до 12 231 структур на нижнем уровне иерархии.Какой из этих уровней используется в анализе, будет зависеть от типа рассматриваемого вопроса.

Рассматривая верхний уровень иерархии, QST, мы видим сильное смещение в сторону небольших, гомомерных и симметричных комплексов, и мы показываем, что этот результат может быть обобщен на белки SwissProt. Мы заметили, что в SwissProt предпочтение отдается комплексам с четным числом субъединиц, что указывает на то, что двугранные симметрии встречаются чаще, чем циклические симметрии, точно так же, как и в PDB.Семейство QS и уровни QS являются подходящими неизбыточными наборами комплексов для многих типов анализа. Здесь мы используем уровень QS для сравнения со SwissProt, и мы обнаруживаем, что он находится в более близком соответствии, чем полный набор комплексов.

Остальные уровни охватывают гомологию последовательностей между комплексами в диапазоне от порога идентичности последовательностей 20% для QS20 до 100% для QS100 с 10% -ными интервалами идентичности последовательностей. Используя эти уровни, мы исследуем, как четыре типа сходства между комплексами (структурное, расхождение последовательностей, точечная мутация и идентичные комплексы) связаны друг с другом.На всех четырех уровнях мы наблюдаем одну и ту же тенденцию: многие комплексы уникальны, а некоторые сильно избыточны. Объединив эти уровни с информацией о симметрии, можно решить такие проблемы, как порог последовательности, при котором тип симметрии сохраняется или нарушается. Путем проецирования уровней друг на друга становится очевидным обилие гомологов на разных порогах идентичности последовательностей.

Мы описываем первую глобальную платформу для анализа белковых комплексов известной трехмерной структуры.Классификация станет отправной точкой для будущей работы, направленной на понимание структуры, эволюции и сборки белковых комплексов. Мы надеемся, что это будет способствовать лучшему пониманию пространства белковых комплексов точно так же, как SCOP и CATH сыграли важную роль в нашем понимании складчатого пространства [47]. Это особенно важно в эпоху структурной геномики, движущейся к решению более крупных комплексов белков (например, , 3D-репертуар, http: //www.3drepertoire.org) и с увеличением количества протеомических данных о белковых комплексах [2].

Инструменты, используемые для изучения того, как белковые комплексы собираются в сигнальных каскадах

Bioeng Bugs. 2011 сентябрь-октябрь; 2 (5): 247–259.

Отделение наук о жизни и Институт материалов и поверхностных исследований; Лимерикский университет; Лимерик, Ирландия

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 6 августа 2011 г .; Пересмотрено 19 августа 2011 г .; Принято 24 августа 2011 г.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Большинство белков не функционируют сами по себе, а являются частью больших сигнальных комплексов, которые расположены в каждой живой клетке в ответ на определенные сигналы окружающей среды. Белки взаимодействуют друг с другом конститутивно или временно и делают это с разной аффинностью. При определении роли, которую играет белок внутри клетки, важно определить его конкретную когорту партнеров по связыванию, чтобы исследователь мог предсказать, в каких сигнальных путях участвует белок.После идентификации и подтверждения информация может позволить манипулировать взаимодействием с помощью фармакологических ингибиторов, чтобы помочь в борьбе с болезнью.

Ключевые слова: клеточная передача сигналов, белковые комплексы, белок-белковые взаимодействия, аффинное мечение, коиммунопреципитация, технология пептидного массива

В этом обзоре мы обсуждаем белок-белковые взаимодействия и их важность для распространения сигналов в передаче сигналов. пути. Мы исследуем некоторые из высокопроизводительных методов скрининга и сосредоточимся на методах, используемых для подтверждения конкретных белок-белковых взаимодействий, включая: аффинное мечение, коиммунопреципитация, технология пептидных массивов и флуоресцентная микроскопия.

Введение в белок-белковые взаимодействия

Сигнальные каскады присущи практически каждому биологическому процессу. Расшифровка этих сигнальных каскадов имеет фундаментальное значение для создания всестороннего и полного понимания биологического процесса. Эта информация важна для новых терапевтических и диагностических стратегий, направленных на болезненное состояние. Центральным элементом каждого сигнального каскада является образование белкового комплекса, основанное на способности белков взаимодействовать с другими белками, нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК), небольшими молекулами и металлами.

Геном человека кодирует более 500 000 различных белков, и, по оценкам, более 80% этих белков функционируют как часть белковых комплексов в сигнальных каскадах, а не как отдельные белки. ¹ Было показано, что у Saccharomyces cerevisiae более 70% белков в клетке имеют взаимодействующих партнеров. ^{2 , 3} Белки выполняют ферментативные, структурные и регуляторные функции, и когда они связываются с другими белками, они образуют строго регулируемые функциональные белковые комплексы.Распутывая эти белковые комплексы, важно, чтобы мы получили понимание того, как белки собираются, и применили систематические и беспристрастные подходы для определения того, как белки в комплексах регулируются. Когда белковые комплексы образуются в сигнальных каскадах, белковые взаимодействия позволяют одному белку модифицировать другой белок в комплексе и, таким образом, передавать биологическую информацию. Часто привлечение одного белка в каскад способствует привлечению следующего, тем самым выстраивая систематические линейные процессы.

Центральным элементом сигнальных каскадов является набор сигнальных концентраторов. Термин «концентратор» в настоящее время широко используется для описания белка, который участвует в нескольких различных сигнальных путях и может связывать несколько разных белков. Белки-концентраторы высоко экспрессируются, и их паттерн экспрессии обычно соответствует паттерну их связывающих партнеров. Они функционируют как каркасные / адаптерные белки и обычно не обладают ферментативной активностью. Эти белки обычно обладают способностью взаимодействовать с несколькими разными белками одновременно.Белки, которые взаимодействуют с концентраторами передачи сигналов, делятся на две широкие категории: конститутивно связанные белки и белки, которые зависят от стимула или являются временными. Конститутивные белок-белковые взаимодействия — это преимущественно сильные взаимодействия, обнаруживаемые в диапазоне M, и обычно имеют больший интерфейс взаимодействия, чем временные взаимодействия (см. Ссылку ⁴ ). Временные взаимодействия обычно слабые (диапазон мкМ) и обычно возникают в результате посттрансляционной модификации одного или обоих белков, участвующих во взаимодействии.Переходные взаимодействия имеют решающее значение для распространения сигнала. При временном межбелковом взаимодействии один или оба белка во взаимодействии претерпевают конформационные изменения, которые могут выявить сайт связывания для следующего взаимодействующего белка. Наиболее важной особенностью белок-белковых взаимодействий является то, что они динамичны. Они являются компонентами специфических сигнальных комплексов и собираются в ответ на сигналы окружающей среды. Таким образом, ячейка расшифровывает информацию об условиях вне ячейки, чтобы генерировать точный ответ.Будучи связанными друг с другом временно или конститутивно, белки имеют возможность модифицировать друг друга и передавать биологическую информацию по схеме потока, которая обычно (но не всегда) сходится в ядре клетки, в результате чего они завершаются кодированием экспрессии определенных наборов генов.

Цель здесь — обсудить несколько различных высокопроизводительных скринингов и обсудить процедуры, связанные с разработкой соответствующих методов проверки, которые могут быть применены для исследования белок-белковых взаимодействий.

Взаимодействия белок-белок в сигнальных каскадах

Взаимодействия белок-белок и пути передачи сигналов высоко консервативны. Например, несколько сотен белок-белковых взаимодействий в дрожжах также были идентифицированы для соответствующих белковых ортологов у червя, ^{5 , 6} , и сигнальные пути, которые контролируют хемотаксис у бактерий, имеют очень четкое сходство с процессами, которые контролируют миграция клеток в иммунных клетках у высших видов. ^{7 — 10} Наряду с сигнальными путями, правила, определяющие белок-белковые взаимодействия и образование комплексов, очень консервативны. За последние 15 лет было разработано большое количество методов, которые продвинули наше понимание сигнальных каскадов, помогая нам идентифицировать и характеризовать белок-белковые взаимодействия и сигнальные сети. Эти методы практикуются или используются в лабораториях по всему миру. При расшифровке сигнальных путей и при установлении когорты белков, которые взаимодействуют с конкретным белком, есть несколько подходов, которые можно использовать.Вычислительные методы могут помочь предсказать белковые взаимодействия, однако большинство исследователей начинают с использования высокопроизводительных протеомных подходов для определения наборов белок-белковых взаимодействий. Логический подход состоит в том, чтобы затем использовать анализы для подтверждения взаимодействий белок-белок несколькими различными способами, прежде чем конкретные взаимодействия белок-белок можно будет уточнить для связывания интерфейсов. Эти методы в значительной степени зависят от генетики и биологии бактерий, дрожжей (в частности, S. cerevisiae и S.pombe ), C. elegans , Drosophila, мыши и линии клеток человека. Сообщая о взаимодействиях белок-белок, важно, чтобы взаимодействия характеризовались более чем одним методом, что является важным шагом в проверке конкретного взаимодействия белок-белок. Как мы обсудим, есть несколько подводных камней и областей, в которых могут быть получены ложноположительные результаты. После определения взаимодействия необходимо провести несколько дополнительных функциональных экспериментов, таких как мутационный анализ и подавление экспрессии белка с помощью РНК-интерференции, чтобы определить иерархию конкретного взаимодействия белков, чтобы определить, в каком направлении сигнал передается в сигнальном пути.С фармакологической точки зрения важно, чтобы мы развили всестороннее понимание конкретного белок-белкового взаимодействия и выработали четкое понимание того, что такое взаимодействие означает в контексте клеточной функции. Достижение этого для конкретных белок-белковых взаимодействий может занять несколько лет, даже десятилетий.

Существует несколько различных стратегий, которые можно использовать для идентификации белок-белковых взаимодействий. Лучшие из них — это те, которые используют несколько различных методов для очистки и уточнения конкретного белок-белкового взаимодействия.В этом обзоре мы сосредоточимся на комбинации методов, наиболее подходящих для выявления белок-белковых взаимодействий, уделяя особое внимание наилучшим подходам для их проверки. Мы также сосредоточимся на технологиях пептидных массивов, мощном и относительно доступном инструменте, используемом для расшифровки конкретных интерфейсов белков, участвующих во взаимодействиях белок-белок.

На что следует обратить внимание перед планированием исследования белок-белкового взаимодействия

Предполагается, что мы можем выяснить функцию белка, если определим конкретную группу белков, которые взаимодействуют с ним в любой момент времени.В большинстве случаев это правда, потому что в литературе достаточно информации для предсказания с высокой степенью уверенности сигнальных путей, в которых участвует ваш тестируемый белок, на основе состава связывающей когорты. Однако ни один индивидуальный экспериментальный подход не может в достаточной степени выявить все критические компоненты белковых комплексов в сигнальных путях. Сначала вы должны подумать, какая система лучше всего поддерживает функцию вашего белка. Например, если предполагается, что ваш тестовый белок является ядерным белком или встроен в липидный бислой, вы должны убедиться, что выбранных вами буферов достаточно для адекватного экспонирования этих комплексов.В белковом комплексе большинство белков будут связаны посредством нековалентных белок-белковых взаимодействий, и, как упоминалось ранее, существует различная степень стабильности в этом связывании. Буферы и методы, используемые для лизиса клеток, такие как обработка ультразвуком, действие замораживания-оттаивания и т. Д., По своей природе разрушают комплексы, поэтому очень важно выбрать методы, которые наилучшим образом защищают эти комплексы, чтобы гарантировать, что скрининг является максимально полным. Можно также искать белки, которые взаимодействуют с тестируемым белком после определенного стимула, такого как стимуляция фактора роста, или исследователь может пытаться идентифицировать белки, которые взаимодействуют с тестовым белком после обработки фармакологическим соединением.При любом скрининге очень важно выбрать библиотеку, которая обеспечивает максимально широкий и наиболее полный охват экспрессируемых генов или белков. Например, при широкомасштабном поиске партнеров по связыванию с использованием дрожжевых двухгибридных тестов (Y2H) исследователи могут использовать кДНК, полученную из эмбриональных стволовых клеток мыши или мозга плода человека. Однако, если исследователь хочет более точный скрининг и имеет представление о том, что его тестовый белок функционирует как мембранный белок, можно использовать библиотеку мембранных белков.При планировании больших экранов необходимо также учитывать факторы стоимости и времени.

Существует ряд вычислительных подходов, которые могут быть использованы для помощи в прогнозировании белок-белковых взаимодействий (см. Ссылку ^{11 — 13} ) и идентификации мотивов белок-белковых взаимодействий. ¹⁴ Имеется несколько баз данных, в которых хранится информация, полученная с помощью высокопроизводительных методов, таких как Y2H и тандемная аффинная очистка с последующей масс-спектрометрией (TAP-MS), а также информация, полученная путем анализа литературы.Базы данных, такие как База данных сети биомолекулярного взаимодействия ^{15 , 16} и База данных взаимодействующих белков (DIP) ^{17 , 18} , хранят полные описания молекулярных комплексов и путей, а также очень полезны для экспериментов. определенная информация о белок-белковых взаимодействиях. Они также могут помочь предсказать временные белок-белковые взаимодействия, которые часто ускользают от биохимических методов. ^{4 , 19 , 20} Полный список и анализ баз данных по взаимодействию белков были составлены Shoemaker et al. ^{12 , 21 , 22} Базы данных теперь расширены за счет включения информации об интерфейсах взаимодействия белок-белок (см. Ссылки ^{22 — 25} ). Обращение к таким базам данных стоит затраченных усилий, а сети, которые расшифровываются с помощью этих вычислительных маршрутов, могут сэкономить драгоценное время при дальнейшем функциональном анализе.

Обнаружение белок-белковых взаимодействий и комплексов

Прежде чем мы обсудим некоторые из систем с высокой пропускной способностью, важно указать, что есть несколько процессов, которые можно использовать для получения информации о комплексах и сигнальных путях, в которые участвует белок. (рассмотрено в исх. ¹ и ¹² ). Например, обычно используются системы микрочипов ДНК. Эти микроматрицы отображают паттерны экспрессии в масштабе всего генома в виде пятен ДНК, иммобилизованных на твердой подложке. ²⁶ Идея микрочипов ДНК возникла из желания сравнить гены, которые активируются или подавляются («вверх или вниз») между двумя популяциями клеток, и этот метод сейчас используется в качестве системы для изучения совместной экспрессии генов. Это основано на исследованиях, которые показали, что белки, входящие в один и тот же комплекс, коэкспрессируются, и поэтому идентификация коэкспрессируемых генов является хорошим предиктором постоянных белковых взаимодействий. ^{27 — 30} В настоящее время система эволюционировала для поддержки белковых массивов ³¹ , что является значительным расширением технологии массивов. С помощью белковых массивов у нас теперь есть возможность изучать взаимодействия белков и определять интерфейсы взаимодействия, а также изучать ферментативную активность белков. Это разрушило несколько барьеров, существовавших в комплексном анализе белков, поскольку система поддается автоматизации и миниатюризации (экономия затрат), но также поддерживает исследования взаимодействий белок-ДНК, белок-липид и белок-белок.Потенциал этой системы в настоящее время используется несколькими фармацевтическими компаниями, поскольку ее можно использовать для скрининга соединений, которые связываются как с белками, так и для соединений, ингибирующих белок-белковые взаимодействия, а также для поиска биомаркеров болезни. ³² У системы есть свои недостатки, однако, например, химия иммобилизации приводит к случайной ориентации отображаемых белков, и поэтому они могут неправильно отображать границы раздела белков и фактически могут поставить под угрозу биологическую активность. ^{33 — 35} Также очень трудно реплицировать посттрансляционные модификации в системе, что приводит к пропуску многих временных межбелковых взаимодействий. Некоторые модификации системы белковых массивов, такие как подвесные массивы гранул, могут обойти эту проблему ³⁶ , и исследования по изучению посттрансляционных модификаций определенных остатков, таких как лизин, оказались успешными и используются для изучения убикютина (Ub). лигазы, лигазы SUMOylation E3 и ацетилтрансферазы. ³⁷ Достижения в синтезе пептидов на нитроцеллюлозной подложке также помогли преодолеть некоторые из этих проблем, что обсуждается далее в обзоре. Многие лаборатории по-прежнему полагаются на более классические подходы, такие как синтетическая летальность, ³⁸ анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) и гель-блоттинг белков Far. Все это отличные системы, и многие из них возвращаются в качестве инструмента первой остановки для анализа взаимодействия белков в качестве обновленных методов. Например, флуоресцентные EMSA теперь генерируют информацию о сродстве связывания во взаимодействиях белок-белок и белок-нуклеиновая кислота (см. ³⁹ и ⁴⁰ ).

Состав сигнальных комплексов можно также изучить с помощью рентгеновской кристаллографии, которая быстро помогает построить более ясную картину взаимодействия белков. Этот мощный метод оказал большое влияние на размещение определенных белков в комплексе с рибосомами, и теперь рентгеновские кристаллические структуры были получены для полных эукариотических рибосомных субъединиц. ^{41 , 42} Этот мощный метод имеет свои ограничения, прежде всего потому, что рентгеновская кристаллография не определяет уникальный интерфейс белок-белок, а различение абсолютного биологического интерфейса в структуре затруднено (обсуждается в ссылке. ⁴³ ). Однако в сочетании с вычислительными методами, предсказанием структуры белка и другими инструментами биоинформатики интерфейсы взаимодействия белок-белок можно предсказать с более высокой степенью уверенности. Недавние достижения и применения этих методов подчеркивают преимущества нестандартного мышления и применения гибридных подходов, которые объединяют множество различных инструментов для достижения большей эффективности, точности, разрешения и более полных экранов. Остальная часть этого обсуждения сосредоточена на описании некоторых «рабочих лошадок» и процедур валидации, используемых для изучения белок-белковых взаимодействий, с акцентом на преимущества и недостатки каждого метода.Сводная таблица преимуществ и недостатков, связанных с обсуждаемыми процедурами, прилагается ().

Таблица 1

Сравнение некоторых различных экспериментальных методов, используемых для изучения и проверки белок-белковых взаимодействий

Экспериментальный метод	Преимущества	Проблемы / подводные камни
912 Микрочип с высоким содержанием белка	. Поддается автоматизации. Можно уменьшить в размерах. Поддерживает исследования ДНК белков. Поддерживает исследования белковых препаратов.	Иммобилизация белков. Репликация посттрансляционных событий. Потеря временных белковых взаимодействий. Анализ in vitro.
Рентгеновская кристаллография	Высокое разрешение. Показывает информацию о конкретных атомах.	Определить интерфейс абсолютного взаимодействия сложно.
Дрожжи Двухгибридные	Прочные и относительно доступные. Недорого. Высокая пропускная способность. Отличный инструмент для проверки. Анализ in vivo.	Не может применяться ко всем взаимодействиям. Белки-приманки могут быть токсичными. Белки-приманки могут автоматически активировать гены. Взаимодействия, основанные на модификациях после перевода, пропущены. Высокий процент ложных срабатываний. Обнаружение переходных взаимодействий.
Анализы с аффинной меткой и методом pull down	Доступно несколько надежных меток Можно использовать несколько комбинаций антител. Может применяться к бактериальным, дрожжевым и млекопитающим системам. Очень прочный. Совместим с несколькими биологическими процессами, такими как MS. Может использоваться для идентификации белковых комплексов. Высокая пропускная способность.	На основе родства. Успех зависит от качества используемых антител. Потеря слабосвязанных белков. Метки могут мешать функционированию белка. Высокий процент ложных срабатываний. Дорого по сравнению с другими методами. Анализ in vitro.
Коиммунопреципитация	Отличная процедура проверки. Белки в нативном состоянии. Белки находятся в их естественной концентрации. Подходит для тестов на сверхэкспрессию. Относительно недорого. Очень воспроизводимый. Можно комбинировать с тегами сродства. Поддерживает исследования каталитической активности. Совместим с несколькими биологическими процессами, такими как MS.	Требуется несколько различных комбинаций управления. Успех во многом зависит от клеточного стимула и процедуры лизиса. Обнаружены только высокоаффинные взаимодействия. Большинство временных взаимодействий потеряно. Не делает различий между прямым и косвенным взаимодействием. Может быть дорогим при использовании в качестве системы досмотра.
Peptide Array Technology	Может использоваться для сопоставления белковых взаимодействий с конкретными задействованными аминокислотами. Пептидные поддерживающие системы надежны. Белковые поверхности могут быть точно представлены. Прямой синтез пептида методами SPOT-синтеза и фотолитографии.	По крайней мере, один белок должен быть доступен в виде рекомбинантного белка. Дорого. Требуется очень специфическое оборудование. Чистота пептидов.
Флуоресцентная микроскопия	Очень гибкий, может работать с множеством различных комбинаций флуофоров. Поддерживает исследования in vivo. Очень совместим с тегами сродства. Дает информацию о сотовом местоположении взаимодействия. Может использоваться для анализа образцов тканей.	Дорого. Требуется очень специфическое оборудование. Успех основан на наличии высокоспецифичных антител. Требуются специальные знания.

Двугибридные методы

Дрожжевые двугибридные (Y2H) методы / репортерные анализы являются одним из наиболее распространенных методов, используемых для скрининга и идентификации белок-белковых взаимодействий. ^{44 — 46} Система основана на свойствах GAL4 и других сайт-специфичных факторов транскрипции в дрожжах, ⁴⁷ и была подробно рассмотрена в ссылке ^{48 — 50} .В анализе два предполагаемых взаимодействующих белка X и Y сливаются с ДНК-связывающим доменом (BD) и доменом активации транскрипции (AD) фактора транскрипции. Затем белки совместно экспрессируются в дрожжевом штамме, который содержит специфический ДНК-связывающий сайт активатора транскрипции перед репортерным геном. Предпочтительным репортерным геном обычно является ген lacZ Escherichia coli , поскольку его активация легко обнаруживается по росту синих колоний при выращивании клеток в среде для выращивания, содержащей 5-бром-4-хлориндол-3ил β-D-галактопиранозид ( X-gal).Репортерный ген транскрибируется только тогда, когда BD и AD фактора транскрипции объединяются, чтобы восстановить активатор и транскрибировать репортерный ген. При использовании Y2H-скрининга «белок-приманка» (тестовый белок) присоединяется к BD для генерации BD-X, а «добычный» белок присоединяется к AD для генерации AD-Y. Приманка-белок BD-X клонируется в экспрессионную плазмиду, которая трансфицируется в дрожжевую клетку, содержащую «библиотеку» клонов кДНК. Эти клоны содержат химерный белок AD-Y, который был получен таким же образом.Большинство лабораторий сейчас используют коммерчески доступные наборы Y2H с предварительно преобразованными библиотеками. Существует несколько вариантов системы Y2H (см. Ссылку ⁵¹ ), такие как одногибридные скрининги, которые предназначены для исследования взаимодействий белок-ДНК, и трехгибридные скрины, которые были разработаны для идентификации белков, взаимодействующих с РНК. ^{52 — 55} Были также предприняты некоторые успешные попытки принять трехгибридную систему для исследования образования тройного белкового комплекса, в котором участвуют три белка, при этом концепция заключается в том, что можно уловить взаимодействие двух белков, которое происходит. только в присутствии третьего белка. ^{55 , 56} Во всех двухгибридных экранах можно использовать либо матричный, либо библиотечный подход (см. Ссылку ¹² ).

Y2H скрины не могут быть применены ко всем скринингам белок-белковых взаимодействий, и даже когда он может быть применен, он имеет несколько ограничений. Важным первым шагом в этом процессе является проверка того, что в приманке содержится белок; (A) нетоксичен при экспрессии в дрожжах и (B), что он не активирует автономно репортерный ген (аутоактивация).Любой из них является серьезным препятствием и может привести к разработке новых стратегий, основанных на использовании усеченной формы белка-приманки. В усеченных белках, очевидно, отсутствуют важные последовательности родительского белка, что снижает «охват» и эффективность системы. Наличие известного белка с положительным взаимодействием для приманки является преимуществом, но не всегда возможно. Другими недостатками системы являются то, что белок-приманка не будет посттрансляционно модифицироваться в дрожжах, и белок-приманка может не сворачиваться должным образом.Опять же, это непреодолимая задача, однако очень интересные разработки происходят в области двухгибридного скрининга млекопитающих, который был адаптирован для высокопроизводительного скрининга. ⁵⁷ Эти скрининги имеют особое преимущество в том, что экспрессированные белки подвергаются существенным посттрансляционным модификациям, которые очень важны для временных межбелковых взаимодействий. ^{58 , 59} Основная проблема с экранами Y2H (как и с большинством экранов с высокой пропускной способностью) — это процент ложных срабатываний, когда оценки до 80% ложных отрицательных результатов и до 60% ложных срабатываний связаны с этим высоким показателем. проверка пропускной способности. ^{60 — 65} Чтобы решить эту проблему, важно, чтобы после идентификации двух взаимодействующих белков с помощью Y2H взаимодействие проверялось несколькими другими биологическими методами. Двухгибридные системы сами по себе являются отличной системой проверки специфического белок-белкового взаимодействия, если взаимодействующий белок клонируется непосредственно в векторе AD жертвы. Кроме того, система поддерживает использование конкретных точечных мутаций для определения критических аминокислот, необходимых для взаимодействия (см. ⁴⁹ и ^{66 — 68} ).

Аффинные метки и анализы с понижением

Аффинные метки используются для очистки белков от бактерий, дрожжей и клеток млекопитающих. Система основана на трансфекции клеток плазмидами, кодирующими белок-приманку и последовательность метки, что приводит к экспрессии белка с меткой, слитой на N- или C-конце белка-приманки. Меченый белок экспрессируется в клетках, что часто контролируется системой индукции, основанной на выборе питания, ^{69 , 70} или присутствии молекулярных соединений, таких как изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), ⁷¹ Тетрациклин ⁷² или температура. ^{73 , 74} Когда белки экспрессируются, клетки лизируются, и меченый белок «вытягивается» или «вытягивается» с использованием антител против метки, антител против белка или с помощью твердых носителей, которые связываются тег.

Перед тем, как описывать анализ методом pull down, важно упомянуть некоторые системы мечения, которые можно использовать. Большинство тегов легко доступны, и даже если они недоступны, их можно получить с помощью обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и простых методов клонирования ДНК.Маркировка белка с помощью тегов необходима, если против исследуемого белка не вырабатываются антитела. Использование тегов, подобных тегам, обсуждаемым ниже, оказалось важным для расшифровки функции белков, особенно в системах экспрессии млекопитающих. Можно использовать несколько разных тегов. Тег FLAG (N-DYK DDD DK-C) представляет собой короткий тег, состоящий из 8 аминокислот, который может быть добавлен либо к N, либо к C-концу белка с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Этот конкретный тег был одним из первых функциональных тегов, которые использовались в биохимии белков ^{75 — 78} и был запатентован Hopp et al.(Патент США № 4,703,004) в 1987 г. Myc-Tag (N-EQK LIS EED LC) представляет собой метку полипептидного белка, которая может быть слита либо с N-концом, либо с C-концом белка, который был получен из белка . Ген c-myc и HA-Tag (N-YPY DVP DYA-C) происходят из гемагглютинина и снова могут быть вставлены либо на N-конце, либо на C-конце белка. Все эти теги отлично подходят для использования в системах экспрессии млекопитающих и легко наносятся на N- и C-конец генов в векторах экспрессии.Тег FLAG-Tag является гидрофобным по своей природе, что дает ему явное преимущество перед другими тегами, поскольку он с меньшей вероятностью разрушит белки, к которым он прикреплен. Тем не менее, Myc-Tags и HA-Tags являются предпочтительными для большинства лабораторий, потому что существует ряд превосходных антител, которые точно распознают их с помощью иммунофлуоресценции и блоттинга белков в геле после SDS PAGE. Метки также гарантируют, что меченые белки могут быть легко иммунопреципитированы из полных клеточных лизатов в анализах методом pull down.Существуют и другие метки, которые больше подходят для рекомбинантных белков и аффинной хроматографии. His-Tag представляет собой полигистидиновую метку, которая состоит, по крайней мере, из пяти остатков гистидина (His), которые могут быть нанесены на N- или C-конец белка. Он также известен как 6xHis-тег. В этой метке можно изменять количество остатков гистидина и вставлять подходящую аминокислотную последовательность, которая облегчает удаление полигистидиновой метки с использованием эндопептидаз после удаления белка. Другие метки, подходящие для выделения рекомбинантных белков из бактериальных систем экспрессии, включают метку мальтозо-связывающего белка (MBP-Tag) и метку глутатион-S-трансферазы (GST-Tag).Существуют и другие системы маркировки, которые часто используются для визуализации белков в клетках в реальном времени с помощью микроскопии. Эти флуоресцентные белковые метки проявляют яркую флуоресценцию при воздействии света определенной длины волны. Тег зеленого флуоресцентного белка (GFP) был впервые выделен из медузы Aequorea victoria ⁷⁹ , и в настоящее время используются несколько производных, включая голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP). Тег GFP оказал сильное влияние на визуализацию белков в клетках млекопитающих, растениях, дрозофилии, дрожжевых и прокариотических клетках (см. ^{80 — 84} ) и обсуждается более подробно позже, когда мы описываем использование флуоресцентной микроскопии в качестве инструмента проверки белок-белковых взаимодействий.

В анализах аффинности белок может быть извлечен для анализа или очистки, например, GST-белок. Однако в большинстве случаев меченый белок можно использовать в качестве инструмента для «вылова» других белков, которые могут взаимодействовать с тестируемым белком, с помощью аффинной хроматографии. Типичный эксперимент может заключаться в том, что белок экспрессируется в бактериях, бактерии лизируются, а белок очищается и связывается в колонке с твердой подложкой или лигандом, связанным с твердой подложкой (например, 6xHis-Tag связывается с никелевыми шариками, GST- Тег связывается с бусинами глутатиона).Затем через колонку можно пропустить лизат из клеток млекопитающих. Белки, которые имеют высокое сродство к иммобилизованному белку, будут связываться, в то время как неспецифические взаимодействующие белки будут вымываться. Связанные белки затем элюируются и разделяются гель-электрофорезом и идентифицируются гель-блоттингом (если в лаборатории доступны антитела, распознающие белки-кандидаты) или масс-спектрометрией (МС). MS обеспечивает количественную идентификацию белок-белковых взаимодействий и вносит значительный вклад в расшифровку белок-белковых взаимодействий и картирование сигнальных белков при соединении с соответствующей системой pull down (см. ⁸⁵ ). Экспрессия меченого белка в системах млекопитающих имеет преимущества, поскольку более вероятно возникновение посттрансляционных модификаций белка-приманки и связывание будет осуществляться непосредственно в клетке. Также весьма вероятно (хотя и не уверенно), что меченый белок будет направлен в правильное клеточное место, где он сможет взаимодействовать со своей физиологической мишенью. Если используется эта система, то улавливание аффинной метки с твердой подложкой или лигандом, связанным с твердой подложкой, выполняется, чтобы смыть неспецифические взаимодействия.Связанные белки будут элюированы и идентифицированы, как описано выше.

Аффинная маркировка имеет явное преимущество перед системой Y2H в том, что она может обнаруживать взаимодействия с участием более двух белков и может использоваться для обнаружения белковых комплексов, если за ней следует MS. ^{1 , 86} Однако и здесь есть ограничения. В зависимости от используемой процедуры лизиса нефизиологические мишени могут подвергаться воздействию и могут быть искусственно включены в комплекс и идентифицированы как позитивно взаимодействующие белки.Аффинная метка также смещена в сторону высокоаффинных взаимодействий, и всегда существует риск того, что метка будет мешать сворачиванию и функционированию белка. Ложноположительные результаты можно уменьшить, промывая иммобилизованный комплекс буферами с повышенными концентрациями детергентов и солей, но при этом должны применяться строгие методы проверки. Метод тандемной аффинной очистки (TAP) очистки белковых комплексов в настоящее время является предпочтительным методом выбора для идентификации нативных белковых комплексов.Способ включает сверхэкспрессию белка-мишени с двойной меткой в ​​клетках-хозяевах, выделение слитого белка с использованием двух этапов связывания и затем идентификацию связанных белков с помощью MS. ^{1 , 87 — 90} Поскольку два тега экспрессируются с белком, существуют более низкие уровни неспецифического связывания и повышенное восстановление комплекса. Система также выигрывает от совместимости с несколькими процессами идентификации белков, такими как нативный PAGE, 2D-электрофорез, гель-блоттинг белков и МС. ^{91 — 93} Ограничения в процессе включают потерю слабо связанных взаимодействующих белков, и всегда существует вероятность того, что метка будет мешать укладке и функции белка, нарушая его взаимодействие с другими белками.

При использовании аффинных тегов следует учитывать несколько моментов, которые могут преодолеть некоторые ограничения, связанные с исследованием, и помочь улучшить результаты. Например, создание приманок, в которых метка вставлена ​​на N-конце, а не на C-конце белка, часто решает проблему измененной стабильности слитого белка.Можно также подумать о создании различных меченых версий белка и сравнить субклеточное расположение каждой. Также можно использовать сшивающие агенты. Существует несколько типов сшивающих агентов, включая химические сшивающие агенты, термореактивные сшивающие агенты и фотореактивные сшивающие агенты. Эти агенты могут способствовать улавливанию белок-белковых взаимодействий и белковых комплексов, ковалентно связывая белки вместе, когда они взаимодействуют. Сшивающие реагенты широко используются и в сочетании с МС являются очень мощным инструментом. ^{1 , 94 — 96}

Высокопроизводительные экраны обеспечивают отличную отправную точку для определения того, какая когорта белков взаимодействует с тестируемым белком, и в сочетании с биоинформатикой и вычислительными инструментами они позволят исследователю предсказать с высокой степенью уверенности, в каких сигнальных путях участвует тестируемый белок. Затем важно перейти к серии систем проверки, чтобы подтвердить взаимодействие, а также идентифицировать интерфейс связывания между двумя белками.После подтверждения взаимодействия можно будет исследовать, как взаимодействие реагирует на сигналы окружающей среды, и определить, как конкретное белок-белковое взаимодействие изменяется в болезненном состоянии.

Проверка белок-белковых взаимодействий

Коиммунопреципитация.

Коиммунопреципитация (co-IP) — это термин, используемый для процесса, при котором белок экстрагируется из лизата цельной клетки с использованием преципитирующего антитела, которое конъюгировано с какой-либо формой смолы (обычно с белком A или белком G).Процесс основан на принципе иммунопреципитации (IP), и его можно использовать в качестве первой остановки при обнаружении белок-белковых взаимодействий, но его лучше всего использовать в качестве процедуры проверки после высокопроизводительного процесса скрининга, такого как двухгибридный анализ, аффинная хроматография. или MS. ^{86 , 97}

Этот метод используется для обогащения лизата целых клеток определенным белком и в процессе «удаления» любых других белков, связанных с этим белком.В этом методе выделяемый белок является антигеном, и очень важно иметь доступ к антителу, которое связывается с этим антигеном в его нативной форме. Если антитела против тестируемого белка недоступны, альтернативной стратегией является создание меченой формы белка (описанной выше), и белок может быть иммунопреципитирован антителами, направленными против метки. Для образования комплекса антиген-антитело готовят экстракты целых клеток, которые затем инкубируют с антителами, распознающими выделяемый белок.Через некоторое время (например, 1 час при комнатной температуре или 3 часа при 4 ° C) добавляют смолу с протеином A или протеином G для захвата комплекса антитело-антиген. Смола связывается с антителом, когда смесь инкубируют при 4 ° C при осторожном перемешивании. Центрифугирование захватит комплекс смола-антитело-антиген, и иммунопреципитат можно промыть буферами с различными концентрациями солей для уменьшения неспецифического связывания белков с иммунопреципитированным комплексом. Комплекс элюируется с гранул, и белки могут быть идентифицированы с помощью белкового гель-блоттинга после SDS PAGE, или, альтернативно, если процедура co-IP используется в качестве первого шага в исследовании взаимодействия белок-белок, элюирование может быть проанализировано. пользователя MS.

В течение всего процесса белки поддерживаются в их нативном состоянии и в их нативной концентрации (если не введена маркированная версия протеина), что позволяет максимально улавливать когорту взаимодействующих протеинов. Этот процесс является относительно недорогим и очень воспроизводимым, и этот метод можно применять для очистки белковых комплексов из лизатов цельных клеток, препаратов ткани и образцов сыворотки. Процесс можно адаптировать к анализу для оценки связывания двух рекомбинантных белков.Процесс совместной IP — отличный инструмент для проверки. Если два белка обнаруживают, что взаимодействуют с помощью высокопроизводительного скрининга, то получение антител к обоим белкам и настройка совместного IP может подтвердить взаимодействие. Затем co-IP можно использовать для картирования взаимодействия двух белков. Например, если генерируется помеченная версия одного из белков и подтверждается взаимодействие, то могут быть экспрессированы усеченные мутации и специфические точечные мутации помеченного белка, чтобы оценить, потеряно ли взаимодействие или усилено мутацией.Это также отличный подход для оценки того, зависит ли взаимодействие между двумя белками от каталитической активности одного белка в комплексе. Однако у метода co-IP есть недостатки, и, как и большинство методов, описанных в этом обзоре, основная проблема связана с загрязнителями и ложноположительными взаимодействиями. Контрольные тесты должны быть выполнены для оценки специфичности антител и сродства к антителам, а контроли должны быть включены в каждый эксперимент для выявления и характеристики событий неспецифического связывания.Также вероятно, что некоторые белки могут взаимодействовать со смолой, используемой для очистки комплекса, что можно оценить с помощью соответствующих контролей. ^{86 , 97} Во время эксперимента по совместному IP важно защитить белки от переваривания и деградации, а также защитить события фосфорилирования от распада, чтобы максимально увеличить потенциал улавливания временных взаимодействий. По этой причине очень важно провести подробное стратегическое планирование эксперимента и рассмотреть соответствующие лизисные буферы, ингибиторы протеаз и фосфатаз и концентрации антител, которые будут использоваться.

Технология массива пептидов.

Технология массива пептидов становится все более популярной в качестве процедуры проверки белок-белковых взаимодействий. Здесь мы обсудим применение массивов пептидов для проверки и картирования взаимодействий белок-белок, однако массивы пептидов можно использовать для очистки антител и картирования эпитопов, аффинной очистки белков, анализа субстратов ферментов и ингибиторов протеаз, а также для скрининга лекарств, которые взаимодействуют. с определенным белком.Концепция пептидного синтеза не нова ⁹⁸ , однако достижения в области химии и методов синтеза позволили значительно улучшить укладку пептидов, презентацию пептидов и чистоту пептидов и помогли поддержать автоматизацию метода. Взаимодействия белок-белок в значительной степени зависят от открытой поверхности, которая в конечном итоге представляет собой «интерфейс связывания» с белком-партнером. Правильное представление этого интерфейса в контексте пептида является проблемой синтеза пептида.Существует несколько твердых поддерживающих систем, используемых для иммобилизации пептидов, включая листы целлюлозы и стекло (см. Ссылки ⁹⁹ и ¹⁰⁰ ). Пептиды можно синтезировать и затем ковалентно присоединить к твердой подложке, или пептиды можно синтезировать непосредственно на твердой подложке. Синтез SPOT и фотолитография — это два основных процесса, которые используются для создания массивов пептидов непосредственно на твердой подложке, хотя синтез SPOT стал методом выбора для большинства исследователей. ¹⁰⁰ Есть несколько коммерческих компаний, которые поставляют белковые матрицы или занимаются оборудованием для их изготовления. ¹⁰⁰ Во время синтеза SPOT создается мини-реакционная камера, когда капля, содержащая модифицированную аминокислоту, помещается на носитель. Последующие аминокислоты добавляются к той же области носителя, и пептидная цепь растет с использованием твердофазного синтеза Fmoc. ⁹⁹ В результате на твердой подложке синтезируются цепочки пептидов, которые имеют высокую вероятность сворачивания, как это происходит в нативном белке.Взаимодействие с белками можно проверить путем иммобилизации одного белка в виде серии перекрывающихся пептидов, синтезированных на твердой подложке, и наложения рекомбинантной версии второго белка. Затем используются антитела ко второму белку для обнаружения присутствия белка на матрице. Таким образом, вы не только добьетесь проверки белок-белкового взаимодействия, но и сможете выявить сайт связывания перекрывающегося белка на иммобилизованном белке (пептидах) (). Еще одно очевидное преимущество пептидных массивов состоит в том, что их можно использовать для сопоставления белковых взаимодействий с конкретными аминокислотами.Как только сайт связывания белка определен с областью белка, замена аланина (иногда называемая аланиновой прогулкой) может использоваться для определения критической аминокислоты во взаимодействии. Для этого создается новый массив на основе последовательностей родительской (первого сканирования) последовательности. В этом массиве пептид 1 является родительским пептидом, пептид 2 будет почти идентичен родительскому, за исключением первой аминокислоты, которая заменена на аланин. В последующем пептиде вторая аминокислота была заменена на аланин, при этом первая аминокислота была изменена обратно, чтобы соответствовать родительскому пептиду, и так далее, пока не будет сгенерирован массив, в котором каждый пептид отличается от родительского пептида на одну аминокислоту.Наложение рекомбинантной версии второго белка вместе с антителами ко второму белку обнаруживает присутствие белка на массиве (). Таким образом, вы не только добьетесь подтверждения взаимодействия белок-белок, но и процедура позволит выявить точное место связывания перекрывающегося белка на иммобилизованном белке (пептидах). В сочетании с инфракрасным формирователем изображения Odyssey ^® (LI-COR Biosciences) можно исследовать конкуренцию между двумя белками за связывание с одним и тем же иммобилизованным белком (пептидом).Это основано на использовании вторичных антител, конъюгированных с красителями, которые обнаруживаются на разных длинах волн (определение цвета) ().

Использование пептидных массивов для изучения белок-белковых взаимодействий. (A) Когда были идентифицированы 2 взаимодействующих белка, сайт взаимодействия одного из белков с другим может быть идентифицирован, если один из белков доступен в очищенной рекомбинантной форме. Для этого белок 1 синтезируется на целлюлозной подложке с использованием SPOT-синтеза. Белок состоит из коротких перекрывающихся пептидов (на этом рисунке показана смоделированная последовательность белка, которая затем синтезируется как набор перекрывающихся 10-членных пептидов, сдвинутых вправо на 2 аминокислоты).При наложении на рекомбинантный белок 2 будет выявлен сайт связывания наложенного белка на иммобилизованном белке (пептидах). (B) Чтобы уточнить сайт связывания и идентифицировать специфические аминокислоты в протеине 1, необходимые для взаимодействия протеина 2, синтезируется массив пептидов с замещением аланина. Для этого на первом экране (A) выбирается родительский пептид (или несколько); PQRSTVWYAC из белка 1. Синтезируются новые иммобилизованные пептиды, но в этом случае каждый пептид отличается от исходного пептида на 1 аминокислоту (каждая аминокислота впоследствии заменяется на аланин, аланины заменяются на аспарагиновую кислоту).На массив накладывается белок 2, как описано выше, и выявляются критические аминокислоты, необходимые для взаимодействия (ST из показанного примера). (C) Когда предполагается, что 2 белка конкурируют за связывание с другим белком, оба конкурирующих белка могут быть наложены в равной концентрации на иммобилизованный белок (пептид). Один белок можно конъюгировать с зеленым красителем, один белок можно конъюгировать с красным красителем. В сочетании с инфракрасным формирователем изображения Odyssey ^® (LI-COR Biosciences) можно исследовать конкуренцию между двумя белками за связывание с одним и тем же иммобилизованным белком (пептидом).«Зеленые пятна» указывают на предпочтение связывания с белком 1, «красные пятна» указывают на предпочтение связывания с белком 2, а «желтые пятна» указывают на то, что два белка конкурируют за связывание с иммобилизованной пептидной последовательностью.

Существует множество аспектов процесса, которые необходимо рассмотреть перед использованием метода, и необходимо тщательно рассмотреть дизайн пептида и используемый скрининг / анализ репортера. В большинстве случаев аналитические сигналы обнаруживаются непосредственно на матрице с использованием стандартного обнаружения на основе антител или флуоресцентного сканирования.Основным недостатком процесса SPOT является вопрос о чистоте пептидов. Поскольку пептиды синтезируются на твердом носителе, они не подвергаются очистке, поэтому чистоту и выход невозможно точно предсказать. Однако отчеты показывают, что качество такое же высокое, как и у стандартных твердофазных технологий (см. Ссылку ¹⁰⁰ ).

Флуоресцентная микроскопия.

Микроскопия стала важным подтверждающим инструментом для исследования белок-белковых взаимодействий, и используются многие различные типы микроскопии, в том числе; Широкопольная, конфокальная, двухфотонная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) (обзор см. ^{100 — 104} ). Принцип работы большинства микроскопов заключается в настройке основного эпифлуоресцентного (широкопольного) микроскопа: флуоресценции отраженного света. Свет излучается источником света сверху (или снизу в инвертированных микроскопах) через линзу объектива. Свет отражается дихроичным зеркалом на образец, а энергия поглощается флуоресцентными молекулами (флуорофорами). Как только флуорофор поглощает фотон света, он заставляет электрон переходить на более высокую орбиталь, создавая молекулу в возбужденном состоянии. ¹⁰¹ Чтобы вернуться в основное состояние, электрон должен потерять избыточную энергию. Это может быть достигнуто путем передачи излучения — испускания флуоресцентного света с большей длиной волны, чем он поглощает. ¹⁰¹ Дихроичное зеркало чрезвычайно важно для принципа флуоресцентной микроскопии. Зеркало отражает свет, используемый в возбуждающем луче, вниз на образец, позволяя излучаемому свету проходить через зеркало в линзу объектива или камеру из-за его большей длины волны. ¹⁰⁵

Флуорофоры, используемые для флуоресцентной микроскопии для исследования белок-белковых взаимодействий, могут использоваться косвенно (в качестве метки на вторичном антителе) или напрямую (в качестве метки на первичном антителе или с помощью флуоресцентных белковых меток, например, GFP ). Зеленый флуоресцентный белок (GFP) представляет собой естественный флуорофор, продуцируемый медузой Aequorea victoria . ^{106 , 107} , которые оказали столь широкое влияние на мир биологических исследований, особенно в изучении белок-белковых взаимодействий.Успех GFP обусловлен природой белка: либо сам по себе, либо экспрессированный в результате генетического слияния с другим белком, наблюдается видимая флуоресценция без необходимости в кофакторе; требуется только кислород (O ₂ ). ^{108 , 109} На протяжении многих лет были созданы различные мутанты GFP для получения синего флуоресцентного белка (BFP), ¹¹⁰ голубого флуоресцентного белка (CFP) ¹¹⁰ и желтого флуоресцентного белка (YFP). ¹¹¹ Были проведены обширные исследования мутагенеза, чтобы найти «красный» GFP, но они не увенчались успехом, ¹¹² однако в 1999 году красный флуоресцентный белок (RFP) был выделен из небиолюминесцентного рифового коралла (класс Anthozoa , род. Discosoma ). ¹¹³ Использование этих флуоресцентных белков в качестве метки для интересующего белка является большим преимуществом. После трансфекции меченых белков в клетки клеточную локализацию белка можно отслеживать с помощью флуоресцентной микроскопии без необходимости проведения дальнейшей обработки образца. ¹⁰⁸ Это делает их одинаково полезными как для фиксированных, так и для живых образцов ¹⁰⁹ и очень полезными для исследований колокализации, флуоресцентного (или Фёрстеровского) резонансного переноса энергии (FRET) и биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET).

Совместная локализация белков в образце обозначается перекрытием двух цветов в одном пикселе (или одном трехмерном вокселе) (например, красный и зеленый сигналы перекрываются, образуя желтый цвет). Следует проявлять осторожность при выборе нескольких флуорофоров, чтобы гарантировать, что выбранные из них возбуждаются лазерами с разной длиной волны, чтобы уменьшить перекрестные помехи или «просачивание» между цветами. ¹¹⁴ Разрешение захваченного изображения чрезвычайно важно для исследований колокализации: разрешение уменьшается по мере увеличения размера вокселя, в результате чего отдельные структуры сливаются в одну. ¹¹⁵ Это может сильно повлиять на исследования колокализации и привести к переоценке уровня происходящих белок-белковых взаимодействий или к ложной локализации сообщаемых взаимодействий. Базовая технология эпифлуоресценции (широкопольная) позволяет получать изображения с высоким фоном и низким разрешением, что приводит к ошибочным сообщениям о колокализации в образцах. По этой причине конфокальная микроскопия используется для изучения белок-белковых взаимодействий. Существует три типа конфокальной микроскопии: лазерное сканирование (LSM), ¹⁰⁵ диск Нипкова ¹¹⁶ и щелевое сканирование ¹¹⁴ , а практические рекомендации по флуоресцентной микроскопии подробно рассмотрены в ссылках ^{101 , 105 , 117} и ¹¹⁸ .Хотя использование LSM дало преимущества в области флуоресцентной микроскопии, такие как повышенное разрешение и снижение фоновой флуоресценции по сравнению с широкопольным, есть также несколько недостатков, включая фотообесцвечивание и фототоксичность из-за продолжительности времени, необходимого для сканирования образцов. ¹¹⁹

Конфокальная микроскопия может использоваться для подтверждения взаимодействия двух или более белков в комплексе. Специфические первичные антитела могут использоваться для нацеливания на представляющие интерес белки и вторичные антитела, меченные флуоресцентной меткой (например,g., Alexa 405, Cy3, DyLight 488) можно использовать для обнаружения локализации интересующего белка в образце. Локализация двух или более белков может быть определена, если первичные антитела относятся к разным видам, а вторичные антитела имеют разные спектры излучения. Наложение испускаемого сигнала флуоресценции в одном пикселе изображения предполагает совместную локализацию белков. Важно, чтобы количественная оценка колокализации проводилась для подтверждения взаимодействий с помощью соответствующего статистического анализа. ¹²⁰ Для анализа доступно несколько коэффициентов колокализации, наиболее популярными из которых являются коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия Мандерса. Коэффициент корреляции Пирсона является стандартной мерой распознавания образов и может использоваться для измерения силы линейной связи между двумя флуоресцентными изображениями. ^{120 , 121} Он сравнивает сходство форм и игнорирует интенсивность сигнала, давая значение от -1 до 1, где -1 предполагает полностью отрицательную корреляцию. ¹²¹ Коэффициент перекрытия Мандерса выводится из коэффициента корреляции Пирсона и указывает на перекрытие двух сигналов и, следовательно, истинную степень совместной локализации. ¹²¹ Этот коэффициент дает значение от 0 до 1, при этом значение 1 означает полную совместную локализацию и очень полезно, когда один антиген демонстрирует более сильную флуоресценцию, чем другой. ¹²¹ Adler et al. предпринял критический обзор методов, используемых для количественной оценки колокализации, сравнивая четыре различных коэффициента для количественной оценки колокализации в выбранных изображениях.Эта группа обнаружила, что исследование Пирсона лучше, чем исследование Мандерса, и предположила, что исследование Мандерса не подходит для исследований колокализации. Для количественной оценки степени колокализации доступно множество различных типов программного обеспечения, и перед выполнением количественного анализа необходимо рассмотреть многие аспекты получения изображения (см. Ссылку ¹²¹ ). Конфокальную микроскопию можно использовать для подтверждения белок-белковых взаимодействий как в тканях, так и в клетках, и она использовалась в качестве системы проверки белок-белковых взаимодействий между неструктурными белками вируса гепатита С, которые были идентифицированы с помощью анализов GST-pulldown и Y2H. ¹²³ Использование конфокального микроскопа для просмотра трехмерной реконструкции образца возможно за счет сбора Z-стеков во время получения изображения. Можно установить верх и низ образца клетки или ткани, и микроскоп будет делать оптические срезы с заданным интервалом. Затем эти срезы преобразуются в трехмерное изображение с помощью программного обеспечения микроскопа. ¹⁰⁵ Анализ колокализации может выполняться на трехмерном изображении или на отдельных срезах для определения уровня белок-белковых взаимодействий в различных областях клетки.

2-фотонная микроскопия обычно используется для визуализации образцов тканей ^{124 , 125} и используется для изучения микробной экологии биопленочных систем. ¹²⁶ Он решает проблему, связанную с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом: возбуждение образца как выше, так и ниже фокальной плоскости. ¹⁰⁵ Принцип включает использование двух фотонов низкой энергии для возбуждения флуорофора вместо одного фотона высокой энергии, используемого в конфокальной микроскопии. ¹²⁷ Двухфотонная микроскопия имеет много преимуществ, таких как меньшее фотообесцвечивание, пониженная автофлуоресценция и высокое 3D-разрешение. ^{128 , 129} Основным преимуществом является возможность более глубокого изображения образца ткани, чем при конфокальной (с глубиной ∼400 мкм против ∼100 мкм). ^{105 , 130}

Оптическое разрешение микроскопа может ограничивать ученых, пытающихся определить совместную локализацию в образце, с пределами ∼200 нм в плоскости xy и 600 нм по оси z. ¹¹⁴ Конфокальный микроскоп можно использовать для изучения белок-белковых взаимодействий в системах, которые стремятся преодолеть это ограничение, таких как FRET и BRET. FRET ^{131 , 132} включает использование двух флуорофоров с перекрывающимися спектрами излучения / поглощения, которые при расстоянии менее 10 нм передают энергию от донора к молекуле акцептора и флуоресцируют. Этот метод можно использовать для исследования связывающих взаимодействий между двумя наборами молекул путем маркировки белков флуорофором.Обычно используемой парой являются оба мутанта GFP (упомянутые ранее): CFP (как донор) и YFP (как акцептор). RFP также можно использовать вместе с GFP в приложениях FRET. ¹³³ FRET оказался полезным при исследовании взаимодействий хозяин-патоген (см. Ссылку ¹³⁴ ). Также было описано использование FRET с тремя хромофорами для анализа взаимодействий между несколькими белками. ¹³⁵ BRET похож на FRET, но вместо двух флуоресцентных меток одна из меток представляет собой биолюминесцентный донорный фермент, люциферазу. ¹³⁶ Люцифераза генерирует синий свет, катализируя взаимодействие окислительного разложения, и впоследствии может действовать как донор для флуорофора, такого как GFP или YFP. ¹³⁷ Как и в случае с FRET, сигнал возникает только в том случае, если белки находятся в непосредственной близости, и широко используется в качестве системы проверки для обнаружения взаимодействий белок-белок. ^{138 , 139} BRET использовался Xu et al. показать взаимодействие белка циркадных часов цианобактерий kaiB с самим собой.Использование меченного YFP kaiB и меченного люциферазой kaiB позволило этой группе продемонстрировать образование гомодимера kaiB. ¹⁴⁰

Все типы микроскопии, упомянутые в этом обзоре, все еще не обладают разрешающей способностью электронного микроскопа, который способен разрешать до уровня <1 нм, а недавний отчет показывает разрешение <50 мкм. ¹⁴¹ Появились сообщения о флуоресцентных технологиях с разрешением ~ 10 нм, которые описываются как процедуры микроскопии сверхвысокого разрешения (см. ^{142 — 145} ). Есть захватывающие возможности для использования этих технологий в изучении белок-белковых взаимодействий в будущем.

Перспективы на будущее

Для исследователей, начинающих скрининг взаимодействия белков, первым шагом должно быть обращение к большим ресурсам информации, доступной в открытом доступе. Однако исследователь должен внимательно изучать эти данные, потому что, к сожалению, когда сообщается о многих новых взаимодействиях, лишь немногие из них фактически подтверждаются.Методы, которые подтверждают и характеризуют специфические белок-белковые взаимодействия, предоставляют ключевую информацию о том, как взаимодействуют белки. Важно, чтобы эта информация лучше интегрировалась с данными, полученными с помощью крупномасштабных методов скрининга на уровне всего генома.

Мы обсудили, как рентгеновская кристаллография играет очень важную роль в расшифровке взаимодействия белков, и мы будем очень приветствовать прогресс в скорости, с которой может выполняться рентгеновская кристаллография. Достижения в структурно-биологических подходах, таких как методы электронной криомикроскопии ¹⁴⁶ и высокоскоростные эксперименты по дифракции рентгеновских лучей ¹⁴⁷ , предоставляют очень подробную информацию о границах связывания белков.Исследования твердо сосредоточены на визуализации конкретного местоположения белка внутри интактных клеток. Например, криоэлектронная микроскопия, выполняемая в бактериальных клетках, помогает идентифицировать структуры и локализовать определенные белки внутри клетки. ¹⁴⁸ Постоянно появляются новые инструменты для улучшения того, как исследователи изучают, как собираются мультибелковые комплексы. Большинство этих техник основано на новых модификациях и комбинациях старых техник. Пеллетье и др. разработали метод анализа белок-белковых взаимодействий у грамотрицательных бактерий, основанный на экспрессии аффинно-меченных белков-приманок из плазмиды со средним числом копий. ¹⁴⁹ Этот метод может включать в себя широкий спектр аффинных, флуоресцентных или других тегов и основан на успехе аффинного тегирования, который подробно обсуждается в этом обзоре. Треххромофорный FRET также появился как метод, используемый для изучения временной организации и регуляции сигнальных событий в живых клетках. Эта система использовала потенциал аффинной метки и флуоресцентной микроскопии и основана на взаимозависимом переносе энергии между тремя разными флуоресцентными метками на трех разных белках. ¹³⁵ Эти метки могут быть размещены на различных белках или могут быть включены в химерные белки. Другая комбинация аффинного мечения и флуоресцентной микроскопии привела к появлению биомолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в качестве инструмента, используемого для исследования и проверки белок-белковых взаимодействий. ¹⁵⁰ В этой системе две половины флуоресцентной метки размещены на двух отдельных белках, которые, как предполагается, будут взаимодействовать. Эти белки не флуоресцируют, если они не находятся в непосредственной близости (предполагая взаимодействие), что способствует объединению двух половин флуоресцентного белка для восстановления флуоресценции.

Ключевой задачей сейчас является определение пространственной и временной регуляции сборки белкового комплекса, потому что многие методы скрининга только фиксируют «момент времени» внутри клетки и не раскрывают информацию о том, как различные сигналы окружающей среды интегрируются во время сигнального события. Очень ценными будут высокопроизводительные экраны, которые отражают динамическую сборку белковых комплексов и обращаются к иерархии связывания во время сборки комплекса, при этом улавливая больше временных межбелковых взаимодействий.

Благодарности

Мы с благодарностью выражаем признательность за финансовую поддержку Ирландскому совету по исследованиям в области здравоохранения (номер гранта HRA / 2009/188) и Ирландскому онкологическому обществу.

Аббревиатуры

910 917 910 917 910 917 917 910 917 917 917 910 912 917 910 917 917 917 аффинная очистка

M	молярный
мкМ	микромолярный
Y2H	дрожжевой двугибридный MS
GST	глутатион-S-трансфераза
GFP	зеленый флуоресцентный белок

Ссылки

1.Берггард Т., Линсе С., Джеймс П. Методы обнаружения и анализа белок-белковых взаимодействий. Протеомика. 2007; 7: 2833–2842. DOI: 10.1002 / pmic.200700131. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Гэвин А.С., Алой П., Гранди П., Краузе Р., Боеше М., Марциох М. и др. Протеомное исследование показывает модульность механизма дрожжевых клеток. Природа. 2006; 440: 631–636. DOI: 10,1038 / природа04532. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Кроган Н.Дж., Кэгни Дж., Ю Х, Чжун Дж., Го Х, Игнатченко А. и др. Глобальный ландшафт белковых комплексов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae .Природа. 2006; 440: 637–643. DOI: 10,1038 / природа04670. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Перкинс Дж. Р., Дибун И., Дессайли Б. Х., Лис Дж. Г., Оренго С. Переходные белок-белковые взаимодействия: структурные, функциональные и сетевые свойства. Состав. 2010; 18: 1233–1243. DOI: 10.1016 / j.str.2010.08.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Li X, Keskin O, Ma B, Nussinov R, Liang J. Белковые взаимодействия: горячие точки и структурно консервативные остатки часто располагаются в дополненных карманах, которые предварительно организованы в несвязанных состояниях: последствия для стыковки.J Mol Biol. 2004; 344: 781–795. DOI: 10.1016 / j.jmb.2004.09.051. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Мэтьюз Л. Р., Вальо П., Ребул Дж., Дж. Х., Дэвис Б. П., Гаррелс Дж. И др. Идентификация потенциальных сетей взаимодействия с помощью поиска на основе последовательностей консервативных белок-белковых взаимодействий или «интерологов» Genome Res. 2001; 11: 2120–2126. DOI: 10.1101 / gr.205301. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Хамаде А., Робертс М.А., Август Э., Макшарри П.Е., Майни П.К., Армитаж Дж. П. и др. Архитектура управления с обратной связью и сеть бактериального хемотаксиса.PLOS Comput Biol. 2011; 7: 1001130. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1001130. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Neumann S, Hansen CH, Wingreen NS, Sourjik V. Различия в передаче сигналов путем прямого и косвенного связывания лигандов при бактериальном хемотаксисе. EMBO J. 2010; 29: 3484–3495. DOI: 10.1038 / emboj.2010.224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Кентнер Д., Сурджик В. Пространственная организация системы бактериального хемотаксиса. Curr Opin Microbiol. 2006; 9: 619–624. DOI: 10.1016 / j.mib.2006.10.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Гальперин М.Ю., Кунин Э.В. Кто твой сосед? Новые вычислительные подходы для функциональной геномики. Nat Biotechnol. 2000. 18: 609–613. DOI: 10,1038 / 76443. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Сапожник Б.А., Панченко А.Р. Расшифровка белок-белковых взаимодействий. Часть I. Экспериментальная техника и базы данных. PLOS Comput Biol. 2007; 3: 42. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.0030042. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Валенсия А, Пасос Ф.Вычислительные методы прогнозирования белковых взаимодействий. Curr Opin Struct Biol. 2002; 12: 368–373. DOI: 10.1016 / S0959-440X (02) 00333-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Раджашекаран С. Вычислительные методы поиска мотивов. Front Biosci. 2009. 14: 5052–5065. DOI: 10,2741 / 3586. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Бадер Г.Д., Дональдсон И., Уолтинг К., Уэллетт Б.Ф., Поусон Т., Хог CW. BIND — База данных сети биомолекулярного взаимодействия. Nucleic Acids Res. 2001; 29: 242–245. DOI: 10,1093 / нар / 29.1.242. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Бадер GD, Hogue CW. BIND — спецификация данных для хранения и описания биомолекулярных взаимодействий, молекулярных комплексов и путей. Биоинформатика. 2000. 16: 465–477. DOI: 10.1093 / биоинформатика / 16.5.465. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Салвински Л., Миллер С.С., Смит А.Дж., Петтит Ф.К., Боуи Ю.Ю., Айзенберг Д. База данных взаимодействующих белков: обновление 2004 года. Nucleic Acids Res. 2004. 32: 449–451. DOI: 10.1093 / нар / gkh086. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18.Xenarios I, Rice DW, Salwinski L, Baron MK, Marcotte EM, Eisenberg D. DIP: база данных взаимодействующих белков. Nucleic Acids Res. 2000. 28: 289–291. DOI: 10.1093 / nar / 28.1.289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Нурен И.М., Торнтон Дж. М.. Структурная характеристика и функциональное значение транзиторных белок-белковых взаимодействий. J Mol Biol. 2003. 325: 991–1018. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (02) 01281-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Сапожник Б.А., Панченко А.Р. Расшифровка белок-белковых взаимодействий.Часть II. Вычислительные методы для прогнозирования партнеров по взаимодействию белков и доменов. PLOS Comput Biol. 2007; 3: 43. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.0030043. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Tuncbag N, Kar G, Keskin O, Gursoy A, Nussinov R. Обзор доступных инструментов и веб-серверов для анализа белок-белковых взаимодействий и интерфейсов. Краткий биоинформ. 2009; 10: 217–232. DOI: 10.1093 / bib / bbp001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Тункбаг Н., Гурсой А., Кескин О.Прогнозирование белок-белковых взаимодействий: объединение эволюции и структуры на стыке белков. Phys Biol. 2011; 8: 35006. DOI: 10,1088 / 1478-3975 / 8/3/035006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Tuncbag N, Gursoy A, Keskin O. Идентификация вычислительных горячих точек в интерфейсах белков: сочетание доступности растворителя и потенциалов между остатками повышает точность. Биоинформатика. 2009; 25: 1513–1520. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp240. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Эйзен МБ, Спеллман П.Т., Браун П.О., Ботштейн Д.Кластерный анализ и отображение паттернов экспрессии в масштабе всего генома. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 14863–14868. DOI: 10.1073 / pnas.95.25.14863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Бхардвадж Н., Лу Х. Корреляция между профилями экспрессии генов и межбелковыми взаимодействиями внутри и между геномами. Биоинформатика. 2005; 21: 2730–2738. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bti398. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Ге Х., Лю З., Черч Г.М., Видаль М. Корреляция между данными картирования транскриптома и интерактома из Saccharomyces cerevisiae .Нат Жене. 2001. 29: 482–486. DOI: 10,1038 / нг776. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Янсен Р., Гринбаум Д., Герштейн М. Связь данных об экспрессии всего генома с белок-белковыми взаимодействиями. Genome Res. 2002; 12: 37–46. DOI: 10.1101 / gr.205602. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Стюарт Дж. М., Сигал Э, Коллер Д., Ким СК. Сеть коэкспрессии генов для глобального открытия консервативных генетических модулей. Наука. 2003. 302: 249–255. DOI: 10.1126 / science.1087447. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33.Аренков П., Кухтин А., Геммелл А., Волощук С., Чупеева В., Мирзабеков А. Белковые микрочипы: использование для иммуноферментных и ферментативных реакций. Анальная биохимия. 2000. 278: 123–131. DOI: 10.1006 / abio.1999.4363. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Ли К.Б., Парк С.Дж., Миркин К.А., Смит Дж. К., Мрксич М. Белковые наномассивы, созданные с помощью нанолитографии с погружным пером. Наука. 2002; 295: 1702–1705. DOI: 10.1126 / science.1067172. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. MacBeath G, Schreiber SL. Печать белков в виде микрочипов для высокопроизводительного определения функций.Наука. 2000; 289: 1760–1763. [PubMed] [Google Scholar] 36. Luckert K, Gotschel F, Sorger PK, Hecht A, Joos TO, Potz O. Снимки динамики белка и посттрансляционных модификаций в одном эксперименте — бета-катенин и его функции. Протеомика клеток Mol. 2011; 10: 110–7377. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Jeong JS, Rho HS, Zhu H. Подход с функциональным микрочипом белка для характеристики посттрансляционных модификаций остатков лизина. Методы Мол биол. 2011; 723: 213–223. DOI: 10.1007 / 978-1-61779-043-0_14. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Пагано Дж. М., Клингман С. С., Райдер С. П.. Количественные подходы к мониторингу взаимодействий белок-нуклеиновая кислота с использованием флуоресцентных зондов. РНК. 2011; 17: 14–20. DOI: 10.1261 / rna.2428111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Парк Ш., Рейнс РТ. Анализ задержки флуоресценции в геле для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Методы Мол биол. 2004. 261: 155–160. [PubMed] [Google Scholar] 41. Бен-Шем А., Дженнер Л., Юсупова Г., Юсупов М.Кристаллическая структура эукариотической рибосомы. Наука. 2010; 330: 1203–1209. DOI: 10.1126 / science.1194294. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Rabl J, Leibundgut M, Ataide SF, Haag A, Ban N. Кристаллическая структура эукариотической 40S рибосомной субъединицы в комплексе с фактором инициации 1. Наука. 2011; 331: 730–736. DOI: 10.1126 / science.1198308. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Кобе Б., Гункар Г., Бухгольц Р., Хубер Т., Мако Б., Коуисон Н. и др. Кристаллография и белок-белковые взаимодействия: биологические интерфейсы и контакты кристаллов.Biochem Soc Trans. 2008; 36: 1438–1441. DOI: 10.1042 / BST0361438. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Филдс С., Сонг О. Новая генетическая система для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Природа. 1989; 340: 245–246. DOI: 10.1038 / 340245a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45. Филдс С., Стернланц Р. Двухгибридная система: анализ белок-белковых взаимодействий. Тенденции Genet. 1994; 10: 286–292. DOI: 10.1016 / 0168-9525 (90)

-U. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Компания Warbrick E. Two, тройка — это толпа: дрожжевая двухгибридная система для картирования молекулярных взаимодействий.Состав. 1997; 5: 13–17. DOI: 10.1016 / S0969-2126 (97) 00162-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 47. Садовски И., Ма Дж., Тризенберг С., Пташне М. GAL4-VP16 — необычайно мощный активатор транскрипции. Природа. 1988. 335: 563–564. DOI: 10.1038 / 335563a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Брюкнер А., Польге С., Ленце Н., Ауэрбах Д., Шлаттнер У. Двугибридные дрожжи, мощный инструмент для системной биологии. Int J Mol Sci. 2009. 10: 2763–2788. DOI: 10.3390 / ijms10062763. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 49.Ратушный В., Големис Э. Разрешение сети сигнальных путей клеток с использованием развивающейся двугибридной системы дрожжей. Биотехники. 2008. 44: 655–662. DOI: 10,2144 / 000112797. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Koegl M, Uetz P. Улучшение двухгибридных систем скрининга дрожжей. Краткая функция геномной протеомики. 2007. 6: 302–312. DOI: 10.1093 / bfgp / elm035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Drees BL. Прогресс и варианты двухгибридных и трехгибридных технологий. Curr Opin Chem Biol.1999; 3: 64–70. DOI: 10.1016 / S1367-5931 (99) 80012-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 52. Бак Джи, Хван СВ, Ко Й, Ли Дж, Ким Й, Ким К. и др. Вкл / выкл вектор экспрессии гибрида контролируемой РНК для дрожжевой трехгибридной системы. BMB Rep. 2010; 43: 110–114. DOI: 10.5483 / BMBRep.2010.43.2.110. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 54. Wurster SE, Bida JP, Her YF, Maher LJ., 3-я характеристика специфичности связывания аптамера анти-NFkappaB РНК in vitro и в дрожжевой трехгибридной системе. Nucleic Acids Res. 2009. 37: 6214–6224.DOI: 10.1093 / nar / gkp670. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 55. Jaeger S, Eriani G, Martin F. Результаты и перспективы дрожжевой трехгибридной системы. FEBS Lett. 2004; 556: 7–12. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (03) 01434-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 56. Alcaide-German ML, Vara-Vega A, Garcia-Fernandez LF, Landazuri MO, del Peso L. Дрожжевая трехгибридная система, воссоздающая механизм регуляции фактора, индуцируемого гипоксией млекопитающих. BMC Cell Biol. 2008; 9:18. DOI: 10.1186 / 1471-2121-9-18.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 57. Fiebitz A, Nyarsik L, Haendler B, Hu YH, Wagner F, Thamm S и др. Высокопроизводительный двухгибридный скрининг млекопитающих на белок-белковые взаимодействия с использованием массивов трансфицированных клеток. BMC Genomics. 2008; 9: 68. DOI: 10.1186 / 1471-2164-9-68. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 58. Го М., Ся З., Ма Х. Функциональный скрининг фосфозита на предмет целевых белок-белковых взаимодействий путем комбинирования стратегий фосфопротеомики и двухгибридных анализов на млекопитающих.Мол Биосист. 2011; 7: 1838–1841. DOI: 10.1039 / c1mb05053b. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 59. Fiebitz A, Vanhecke D. Высокопроизводительный двухгибридный скрининг млекопитающих на предмет белок-белковых взаимодействий с использованием трансфицированных клеточных массивов (CAPPIA). Методы Mol Biol. 2011; 723: 165–183. DOI: 10.1007 / 978-1-61779-043-0_11. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 60. Aloy P, Bottcher B, Ceulemans H, Leutwein C, Mellwig C, Fischer S и др. Сборка белковых комплексов дрожжей на основе структуры. Наука. 2004; 303: 2026–2029.DOI: 10.1126 / science.1092645. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 61. Алой П., Рассел РБ. Десять тысяч взаимодействий для молекулярного биолога. Nat Biotechnol. 2004; 22: 1317–1321. DOI: 10,1038 / NBT1018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 63. Лу Л., Аракаки А.К., Лу Х., Сколник Дж. Прогнозирование белок-белковых взаимодействий на основе многомерных потоков в геномном масштабе: приложение к протеому Saccharomyces cerevisiae . Genome Res. 2003. 13: 1146–1154. DOI: 10.1101 / gr.1145203. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 64.Рассел Р. Б., Альбер Ф., Алой П., Дэвис Ф. П., Коркин Д., Пишо М. и др. Структурная перспектива белок-белковых взаимодействий. Curr Opin Struct Biol. 2004. 14: 313–324. DOI: 10.1016 / j.sbi.2004.04.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 65. фон Меринг С., Краузе Р., Снел Б., Корнелл М., Оливер С.Г., Филдс С. и др. Сравнительная оценка крупномасштабных наборов данных белок-белковых взаимодействий. Природа. 2002; 417: 399–403. DOI: 10,1038 / природа750. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 66. Бикл М.Б., Дуссер Э, Монкорж О, Боттин Н, Колас П.Отбор и характеристика больших коллекций пептидных аптамеров с помощью оптимизированных двухгибридных процедур дрожжей. Nat Protoc. 2006; 1: 1066–1091. DOI: 10.1038 / nprot.2006.32. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 67. Bolger GB, Baillie GS, Li X, Lynch MJ, Herzyk P, Mohamed A, et al. Анализ сканирующего массива пептидов выявляет перекрывающиеся сайты связывания для белков сигнального каркаса, бета-аррестина и RACK1, в цАМФ-специфической фосфодиэстеразе PDE4D5. Биохим Дж. 2006; 398: 23–36. DOI: 10,1042 / BJ20060423.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 68. Киттанаком С., Чук М., Вонг В., Снайдер Дж., Эдмондс Д., Лидакис А. и др. Анализ мембранных белковых комплексов с использованием двугибридной системы с расщепленной убиквитиновой мембраной дрожжей (MYTH). Методы Мол биол. 2009; 548: 247–271. DOI: 10.1007 / 978-1-59745-540-4_14. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 69. Адамс С.С., Гросс Д.С. Реакция дрожжей на тепловой шок вызывается преобразованием клеток в сферопласты и сильными ингибиторами транскрипции. J Bacteriol.1991; 173: 7429–7435. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Бакли Д.А., Ченг А., Кили П.А., Тремблей М.Л., О’Коннор Р. Регулирование активности киназы рецептора инсулиноподобного фактора роста типа I (IGF-I) с помощью протеинтирозинфосфатазы 1B (PTP-1B) и повышенного IGF-I- опосредованное подавление апоптоза и подвижности фибробластов с дефицитом PTP-1B. Mol Cell Biol. 2002; 22: 1998–2010. DOI: 10.1128 / MCB.22.7.1998-2010.2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 71. Hansen LH, Knudsen S, Sorensen SJ.Влияние гена lacY на индукцию индуцибельных промоторов IPTG изучено на Escherichia coli и Pseudomonas fluorescens. Curr Microbiol. 1998. 36: 341–347. DOI: 10.1007 / s0028490. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 72. Госсен М., Бухард Х. Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью тетрациклин-чувствительных промоторов. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 5547–5551. DOI: 10.1073 / pnas.89.12.5547. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 73. Кумар Р., Сингх Дж.Укороченное производное промотора nmt 1 демонстрирует температурно-зависимую индукцию экспрессии гена в Schizosaccharomyces pombe . Дрожжи. 2006; 23: 55–65. DOI: 10.1002 / yea.1343. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 74. Ву С. Факторы транскрипции теплового шока: структура и регуляция. Annu Rev Cell Dev Biol. 1995; 11: 441–469. DOI: 10.1146 / annurev.cb.11.110195.002301. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 75. Эйнхауэр А., Юнгбауэр А. Пептид FLAG, универсальная гибридная метка для очистки рекомбинантных белков.J Biochem Biophys Methods. 2001; 49: 455–465. DOI: 10.1016 / S0165-022X (01) 00213-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 76. Эйнхауэр А., Юнгбауэр А. Аффинность моноклонального антитела M1, направленного против пептида FLAG. J Chromatogr A. 2001; 921: 25–30. DOI: 10.1016 / S0021-9673 (01) 00831-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 77. Бриззард БЛ, Чубет Р.Г., Визард ДЛ. Иммуноаффинная очистка бактериальной щелочной фосфатазы, меченной эпитопом FLAG, с использованием нового моноклонального антитела и пептидной элюции. Биотехники.1994; 16: 730–735. [PubMed] [Google Scholar] 78. Чан КМ, Рёдер Р.Г. Экспрессия и очистка общих факторов транскрипции с помощью метки эпитопа FLAG и пептидной элюции. Pept Res. 1993; 6: 62–64. [PubMed] [Google Scholar] 79. Прендергаст Ф.Г., Манн К.Г. Химические и физические свойства экворина и зеленого флуоресцентного белка, выделенного из Aequorea forskalea . Биохимия. 1978; 17: 3448–3453. DOI: 10.1021 / bi00610a004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 80. Уорд TH, Липпинкотт-Шварц Дж.Использование зеленого флуоресцентного белка в клетках млекопитающих. Методы Biochem Anal. 2006. 47: 305–337. [PubMed] [Google Scholar] 81. Haseloff J, Siemering KR. Использование зеленого флуоресцентного белка в растениях. Методы Biochem Anal. 2006. 47: 259–284. [PubMed] [Google Scholar] 82. Хейзелригг Т., Мэнсфилд Дж. Х. Применение зеленого флуоресцентного белка у дрозофилы. Методы Biochem Anal. 2006; 47: 227–257. [PubMed] [Google Scholar] 83. Хичкок А. Л., Кахана Дж. А., Сильвер ПА. Использование зеленого флуоресцентного белка в дрожжах.Методы Biochem Anal. 2006; 47: 179–201. [PubMed] [Google Scholar] 84. Вальдивия Р. Х., Кормак Б. П., Фалькоу С. Использование зеленого флуоресцентного белка у прокариот. Методы Biochem Anal. 2006. 47: 163–178. [PubMed] [Google Scholar] 85. Чоудхари Ч., Манн М. Расшифровка сигнальных сетей с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11: 427–439. DOI: 10,1038 / nrm2900. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 86. ten Have S, Boulon S, Ahmad Y, Lamond AI. Протеомика иммуноосаждения на основе масс-спектрометрии — руководство пользователя.Протеомика. 2011; 11: 1153–1159. DOI: 10.1002 / pmic.201000548. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 87. Li Y. Обычно используемые комбинации тегов для тандемной аффинной очистки. Biotechnol Appl Biochem. 2010; 55: 73–83. DOI: 10.1042 / BA200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 88. Пуиг О, Каспари Ф, Ригут Дж, Руц Б., Бувере Э, Брагадо-Нильссон Э и др. Метод тандемной аффинной очистки (TAP): общая процедура очистки белковых комплексов. Методы. 2001; 24: 218–229. DOI: 10.1006 / мет.2001.1183. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 89. Völkel P, Le Faou P, Angrand PO. Протеомика взаимодействия: характеристика белковых комплексов с использованием тандемной аффинной очистки масс-спектрометрии. Biochem Soc Trans. 2010. 38: 883–887. DOI: 10.1042 / BST0380883. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 90. Xu X, Song Y, Li Y, Chang J, Zhang H, An L. Метод тандемной аффинной очистки: эффективная система для очистки белковых комплексов и идентификации взаимодействия белков. Protein Expr Purif.2010. 72: 149–156. DOI: 10.1016 / j.pep.2010.04.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 91. Бауместер Т., Баух А., Раффнер Х., Ангранд П.О., Бергамини Г., Кротон К. и др. Физическая и функциональная карта пути передачи сигнала TNFalpha / NFkappaB человека. Nat Cell Biol. 2004. 6: 97–105. DOI: 10,1038 / ncb1086. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 92. Мацумото М., Оямада К., Такахаши Х., Сато Т., Хатакеяма С., Накаяма К. Широкомасштабный протеомный анализ фосфорилирования тирозина, индуцированного активацией Т-клеточного рецептора или В-клеточного рецептора, обнаруживает новые пути передачи сигналов.Протеомика. 2009. 9: 3549–3563. DOI: 10.1002 / pmic.2001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 93. Nittis T, Guittat L, LeDuc RD, Dao B, Duxin JP, Rohrs H и др. Выявление новых теломерных белков с использованием перекрестного связывания in vivo, тандемной аффинной очистки и безметки количественной ЖХ-FTICR-MS. Протеомика клеток Mol. 2010; 9: 1144–1156. DOI: 10.1074 / mcp.M_{0-MCP200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 94. Мельчер К. Новые методы химического сшивания для идентификации временных межбелковых взаимодействий с мультибелковыми комплексами.Curr Protein Pept Sci. 2004. 5: 287–296. DOI: 10,2174 / 1389203043379701. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 95. Робинетт Д., Нямати Н., Томер КБ, Борхерс С.Х. Фотоаффинное мечение в сочетании с масс-спектрометрическими подходами как инструмент структурной протеомики. Эксперт Rev Proteomics. 2006; 3: 399–408. DOI: 10.1586 / 14789450.3.4.399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 96. Синц А. Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках методами химического сшивания и масс-спектрометрии.Anal Bioanal Chem. 2010; 397: 3433–3440. DOI: 10.1007 / s00216-009-3405-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 97. Элион EA. Обнаружение белок-белковых взаимодействий методом соосаждения. Curr Protoc Neurosci. 2006; 5: 25. [PubMed] [Google Scholar] 98. Франк Р., Хайкенс В., Хейстерберг-Мутсис Г., Блоккер Х. Новый общий подход к одновременному химическому синтезу большого количества олигонуклеотидов: сегментарные твердые носители. Nucleic Acids Res. 1983; 11: 4365–4377. DOI: 10.1093 / nar / 11.13.4365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 99.Франк Р. Техника SPOT-синтеза. Синтетические пептидные массивы на мембранных носителях — принципы и применение. J Immunol Methods. 2002; 267: 13–26. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (02) 00137-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 100. Кац С., Леви-Беладев Л., Ротем-Бамбергер С., Рито Т., Рудигер С.Г., Фридлер А. Изучение белок-белковых взаимодействий с использованием пептидных массивов. Chem Soc Rev.2011; 40: 2131–2145. DOI: 10.1039 / c0cs00029a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 101. Lichtman JW, Conchello JA. Флуоресцентная микроскопия.Нат методы. 2005; 2: 910–919. DOI: 10,1038 / nmeth817. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 102. Paddock SW. Принципы и практика лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Mol Biotechnol. 2000. 16: 127–149. DOI: 10.1385 / MB: 16: 2: 127. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 103. Так PT, Dong CY, Masters BR, Berland KM. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением. Annu Rev Biomed Eng. 2000; 2: 399–429. DOI: 10.1146 / annurev.bioeng.2.1.399. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 104. Маттейсес А.Л., Саймон С.М., Раппопорт Дж.З.Получение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения для клеточных биологов. J Cell Sci. 2010; 123: 3621–3628. DOI: 10.1242 / jcs.056218. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 105. Semwogerere D, Weeks ER. Конфокальная микроскопия. В: Гэри Э., Wnek GLB, редакторы. Энциклопедия биоматериалов и биомедицинской инженерии. Informa Healthcare; 2008. С. 705–714. [Google Scholar] 106. Коди CW, Прашер, округ Колумбия, Вестлер WM, Прендергаст Ф.Г., Уорд WW. Химическая структура гексапептидного хромофора зеленого флуоресцентного белка Aequorea.Биохимия. 1993; 32: 1212–1218. DOI: 10.1021 / bi00056a003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 107. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria . Ген. 1992; 111: 229–233. DOI: 10.1016 / 0378-1119 (92)}

-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 108. Кьеза А., Рапицци Е., Тозелло В., Пинтон П., де Вирджилио М., Фогарти К. Е. и др. Рекомбинантный эккорин и зеленый флуоресцентный белок как ценные инструменты в изучении передачи сигналов клетками.Биохим Дж. 2001; 355: 1–12. DOI: 10.1042 / 0264-6021: 3550001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 109. Гипманс Б.Н., Адамс С.Р., Эллисман М.Х., Цзянь Р.Ю. Флуоресцентный набор инструментов для оценки местоположения и функции белков. Наука. 2006; 312: 217–224. DOI: 10.1126 / science.1124618. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 110. Heim R, Tsien RY. Разработка зеленого флуоресцентного белка для повышения яркости, увеличения длины волны и резонансной передачи энергии флуоресценции. Curr Biol. 1996. 6: 178–182.DOI: 10.1016 / S0960-9822 (02) 00450-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 111. Ормо М., Кубитт А.Б., Каллио К., Гросс Л.А., Цзянь Р.Ю., Ремингтон С.Дж. Кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria . Наука. 1996; 273: 1392–1395. DOI: 10.1126 / science.273.5280.1392. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 112. Делагрейв С., Хотин Р.Э., Сильва С.М., Ян М.М., Юван, округ Колумбия. Мутанты зеленого флуоресцентного белка со смещенным красным смещением возбуждения. Биотехнология (Нью-Йорк), 1995; 13: 151–154. DOI: 10.1038 / nbt0295-151.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 113. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г., Маркелов М.Л. и др. Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Nat Biotechnol. 1999; 17: 969–973. DOI: 10,1038 / 13657. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 114. Смит CL. Базовая конфокальная микроскопия. Curr Protoc Mol Biol. 2008; 14: 1. [PubMed] [Google Scholar] 115. Scriven DR, Lynch RM, Moore ED. Получение изображений для колокализации с использованием оптической микроскопии. Am J Physiol Cell Physiol. 2008. 294: 1119–1122.DOI: 10.1152 / ajpcell.00133.2008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 116. Сяо GQ, Corle TR, Kino GS. Конфокальный сканирующий оптический микроскоп в реальном времени. Appl Phys Lett. 1988; 53: 716–718. DOI: 10,1063 / 1,99814. [CrossRef] [Google Scholar] 117. Хенторн, округ Колумбия, Джакса-Чамиц, AA, Мелдрам, EA. Дрожжевая трехгибридная система на основе GAL4 для идентификации взаимодействий малых молекул с белками-мишенями. Biochem Pharmacol. 2002; 63: 1619–1628. DOI: 10.1016 / S0006-2952 (02) 00884-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 119.Холмс Т.Дж., Ченг ПК. Основные принципы визуализации. В: Yu HCPCLPCKFJ, редактор. Мультимодальная микроскопия. Сингапур: World Scientific Publishing Co., Pte., Ltd .; 2006. С. 1–74. [Google Scholar] 120. Барлоу А.Л., Маклеод А., Ноппен С., Сандерсон Дж., Герин С.Дж. Анализ колокализации на флуоресцентных микрофотографиях: проверка более точного расчета коэффициента корреляции Пирсона. Microsc Microanal. 2010; 16: 710–724. DOI: 10.1017 / S143192761009389X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 121. Зинчук В., Зинчук О., Окада Т.Количественный анализ колокализации многоцветных конфокальных изображений, полученных с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии: использование пикселей для исследования биологических явлений. Acta Histochem Cytochem. 2007. 40: 101–111. DOI: 10.1267 / ahc.07002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 122. Адлер Дж., Пармрид И. Количественная оценка колокализации по корреляции: коэффициент корреляции Пирсона превосходит коэффициент перекрытия Мандера. Цитометрия А. 2010; 77: 733–742. DOI: 10.1002 / cyto.a.20896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 123.Димитрова М., Имберт И., Киени М.П., ​​Шустер С. Белковые взаимодействия между неструктурными белками вируса гепатита С. J Virol. 2003. 77: 5401–5414. DOI: 10.1128 / JVI.77.9.5401-14.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 124. Helmchen F, Denk W. Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Нат методы. 2005; 2: 932–940. DOI: 10,1038 / nmeth818. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 125. Konjufca V, Миллер MJ. Двухфотонная микроскопия взаимодействий хозяин-патоген: получение динамической картины инфекции in vivo.Cell Microbiol. 2009; 11: 551–559. DOI: 10.1111 / j.1462-5822.2009.01289.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 126. Neu TR, Woelfl S, Lawrence JR. Трехмерная дифференциация компонентов фотоавтотрофной биопленки с помощью многоканальной лазерной сканирующей микроскопии (однофотонное и двухфотонное возбуждение) J Microbiol Methods. 2004. 56: 161–172. DOI: 10.1016 / j.mimet.2003.10.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 127. Денк В., Стриклер Дж. Х., Уэбб WW. Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия. Наука.1990; 248: 73–76. DOI: 10.1126 / science.2321027. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 128. Сюй Ц., Зипфель В., Шир Дж. Б., Уильямс Р. М., Уэбб WW. Возбуждение многофотонной флуоресценции: новые спектральные окна для биологической нелинейной микроскопии. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 10763–10768. DOI: 10.1073 / pnas.93.20.10763. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 129. Зипфель WR, Уильямс RM, Уэбб WW. Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в бионауках. Nat Biotechnol. 2003. 21: 1369–1377. DOI: 10.1038 / nbt899. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 130. Диаспро А., Шеппард С. Двухфотонная микроскопия: основные принципы и архитектура. В: Диаспро А, редактор. Основы конфокальной и двухфотонной микроскопии, применения и достижения. Нью-Йорк: Wiley-Liss Inc .; 2002. С. 39–73. [Google Scholar] 131. Поршень DW, Kremers GJ. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое. Trends Biochem Sci. 2007. 32: 407–414. DOI: 10.1016 / j.tibs.2007.08.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 132. Саху Х, Швилле П.FRET и FCS — друзья или враги? ХимФисХим. 2011; 12: 532–541. DOI: 10.1002 / cphc.201000776. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 133. Мизуно Х., Савано А., Эли П., Хама Х., Мияваки А. Красный флуоресцентный белок из Discosoma в качестве тега слияния и партнера для передачи энергии резонанса флуоресценции. Биохимия. 2001; 40: 2502–2510. DOI: 10.1021 / bi002263b. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 135. Гальперин Э., Верхуша В. В., Соркин А. Треххромофорная FRET-микроскопия для анализа мультипротеиновых взаимодействий в живых клетках.Нат методы. 2004; 1: 209–217. DOI: 10,1038 / nmeth720. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 136. Буте Н., Джокерс Р., Иссад Т. Использование резонансной передачи энергии в высокопроизводительном скрининге: BRET против FRET. Trends Pharmacol Sci. 2002; 23: 351–354. DOI: 10.1016 / S0165-6147 (02) 02062-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 137. Беван Н., Рис С. Фармацевтическое применение GFP и RCFP. В: Мартин Чалфи С.К., редактор. Зеленый флуоресцентный белок: свойства, применение и протоколы. Джон Уайли и сыновья; 2006 г.С. 361–390. [Google Scholar] 138. Пфлегер К.Д., Эйдне К.А. Освещение межбелковых взаимодействий с использованием методов биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) Nat. 2006. 3: 165–174. DOI: 10,1038 / nmeth841. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 139. Пфлегер К.Д., Сибер Р.М., Эйдне К.А. Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) для обнаружения белок-белковых взаимодействий в реальном времени. Nat Protoc. 2006; 1: 337–345. DOI: 10.1038 / nprot.2006.52. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 140. Сюй Ю, Поршневой DW, Johnson CH.Система биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET): приложение к взаимодействующим белкам циркадных часов. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 151–156. DOI: 10.1073 / pnas.96.1.151. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 141. Эрни Р., Росселл М.Д., Киселёвски С., Дахмен У. Получение изображений с атомным разрешением с помощью электронного зонда с размером менее 50 мкм. Phys Rev Lett. 2009; 102: 096101. DOI: 10.1103 / PhysRevLett.102.096101. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 142. Ад SW. Оптическая наноскопия в дальней зоне. Наука.2007; 316: 1153–1158. DOI: 10.1126 / science.1137395. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 143. Паттерсон Г., Дэвидсон М., Мэнли С., Липпинкотт-Шварц Дж. Визуализация сверхвысокого разрешения с использованием локализации одной молекулы. Annu Rev Phys Chem. 2010. 61: 345–367. DOI: 10.1146 / annurev.physchem.012809.103444. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 146. Фуджи Т., Иване А.Х., Янагида Т., Намба К. Прямая визуализация вторичных структур F-актина с помощью электронной криомикроскопии. Природа. 2010; 467: 724–728.DOI: 10,1038 / природа09372. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 147. Люгер П. Методы быстрой электронной плотности в науках о жизни — рутинное применение в будущем? Org Biomol Chem. 2007. 5: 2529–2540. DOI: 10.1039 / b706235d. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 148. Pilhofer M, Ladinsky MS, McDowall AW, Jensen GJ. Бактериальный ПЭМ: новые открытия криомикроскопии. Методы Cell Biol. 2010; 96: 21–45. DOI: 10.1016 / S0091-679X (10) 96002-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 149. Пеллетье Д.А., Херст Г.Б., Фут Л.Дж., Ланкфорд П.К., МакКаун С.К., Лу Т.Й. и др.Общая система для изучения белок-белковых взаимодействий у грамотрицательных бактерий. J Proteome Res. 2008. 7: 3319–3328. DOI: 10.1021 / pr8001832. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 150. Kerppola TK. Разработка и реализация анализов бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для визуализации белковых взаимодействий в живых клетках. Nat Protoc. 2006; 1: 1278–1286. DOI: 10.1038 / nprot.2006.201. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] Сборка белкового комплекса

| Протокол

Большинство белков не функционируют как полностью вытянутые полипептидные цепи, а собираются в компактные многокомпонентные комплексы.Во время сборки растущий комплекс должен отличать свои специфические компоненты от смеси сотен различных белковых и небелковых видов, присутствующих в клетке.

Белковые комплексы могут быть либо гомомерными, состоящими из нескольких копий одной и той же полипептидной цепи, либо гетеромерными, состоящими из нескольких отдельных полипептидных цепей или небелковых компонентов.

Обычно белки обладают всей необходимой информацией для быстрой и точной самосборки в функциональные комплексы из своих составляющих.

Многие вирусы могут самособираться, чтобы сформировать полностью функциональную единицу, используя инфицированную клетку-хозяин для производства всех необходимых компонентов.

Например, в вирусе табачной мозаики субъединицы белка оболочки самоорганизуются в отдельные кольца, in vitro . Молекула РНК связывается в центре растущей спирали, чтобы сделать вирус активным.

Однако в некоторых белковых комплексах самосборка происходит только в результате мутации или болезни.

Гемоглобин, белок, переносящий кислород, обнаруженный в красных кровяных тельцах, представляет собой тетрамер из двух альфа-субъединиц и двух аналогичных бета-субъединиц.Однако при серповидно-клеточной анемии у мутантного гемоглобина есть гидрофобный участок, который увеличивает сродство между тетрамерами гемоглобина, заставляя их агрегировать в ненормальную сборку волокон гемоглобина.

Эти волокна изменяют форму клеток крови от сфероида до серповидной формы, закупоривая тем самым кровеносные сосуды.

Хотя многие белки самоорганизуются без внешней помощи, факторы сборки, такие как молекулярные шапероны, помогают компонентам белка собираться в стабильный и функциональный комплекс.

Протеасома 26S, молекулярный механизм, который помогает в регулируемой деградации белка, состоит из двух отдельных субкомплексов: бочкообразной ядерной частицы 20S и двух крышек регуляторных частиц 19S. Каждый субкомплекс дополнительно состоит из нескольких белковых субъединиц.

Множественные шапероны, предназначенные для протеасом, интегрируют эти субъединицы в свои соответствующие субкомплексы. Наконец, шапероны собирают субкомплексы в полный протеасомный комплекс.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

.

No related posts.