Липолитический эффект это: 404. Страница не найдена
Что такое липолитики? | Лазерный Доктор
У разных людей разная конституция тела: у кого-то и кусочек булочки может отразиться на объемах, а кто-то может съесть половину порося и остаться в идеальной форме. Причем набрать лишние килограммы намного проще, чем от них избавиться. Что самое обидное, ни диеты, ни активные физические нагрузки не помогают вообще. Но мы знаем, что делать даже в таких случаях. Поэтому в этой статье мы расскажем про инъекции липолитиков — новый эффективный способ избавиться от локальных жировых отложений. В частности, речь пойдет об одном из наиболее эффективных и распространенных современных липолитиков — препарате Aqualyx.
Факты:
- Согласно статистике, наиболее часто липолитики применяются, чтобы уменьшить/устранить живот или второй подбородок.
- Один из самых распространенных липолитиков — Акваликс — разработан в 2009 году пластическим хирургом из Италии.
- Инъекции липолитиков идеально совмещаются с LPG-массажем. Однако лучше сперва проконсультироваться у врача.
Что такое липолитики
Многие люди до сих пор не знают про липолитики, что это такое и как они применяются. Впрочем, в этом нет ничего удивительного, ведь липолитики появились относительно недавно.
Итак, липолитики — это вещества, которые при контакте с жировыми клетками разрушает их оболочку, вследствие чего жир расщепляется и выводится из организма лимфатической системой. Любопытно, что рядом расположенные ткани при этом никак не затрагиваются и вообще никак не реагируют на липолитики. Поэтому процедура считается эффективной, но безопасной.
Соответственно, липолитическое действие — это процесс стимуляции расщепления жира.
Как проходит процедура инъекций липолитиков
Перед самой процедурой рекомендуется посетить врача, который будет проводить процедуру инъекций липолитиками, чтобы он смог провести опрос и осмотр для определения плана лечения и выявления противопоказаний. Кроме того, на консультации у врача можно подробнее расспросить про липолитический эффект, что это и какими препаратами его можно добиться.
Суть процедуры заключается в введении препарата с липолитиками непосредственно в жировую ткань при помощи особой тонкой иглы Lipoinject. Попадая в места скопления жировых отложений, липолитик разрушает клетки жира, не причиняя никакого вреда окружающим тканям. Таким образом, с помощью процедуры можно избавиться от локальных жировых отложений. Несмотря на то, что процедура инъекционная, она не сопровождается особым дискомфортом, поэтому липолитики для похудения вводятся без применения анестезии.
Сама процедура недолгая: в зависимости от выраженности проблемы и желаемого эффекта, она может длиться от 25 до 50 минут. Зато результат будет виден уже после первого сеанса. Но максимального эффекта можно добиться только после проведения полного курса уколов липолитиками. Длительность курса рассчитывается врачом: в среднем он состоит из 2-4 сеансов.
Применение липолитиков
Что такое липолитики?Липолитическое действие наиболее эффективно оказывается на локальные жировые отложения, а не на ожирение в целом. Поэтому липолитики показаны для введения в следующие части тела:
- верхняя часть рук и плечи;
- живот;
- спина;
- бедра.
Кроме того, эффективны липолитики и в борьбе со вторым подбородком. К сожалению, препараты не подходят для устранения «апельсиновой корки» на ногах. Однако при этом сеансы эффективны в избавлении от жировых отложениях, возникших из-за:
- хронического стрессового состояния;
- генетической предрасположенности;
- сбоев гормонального фона;
- малоподвижного образа жизни;
- беременности.
Противопоказания к липолитикам
Как и большинство других косметологических процедур, имеют противопоказания и липолитики:
- Беременность и период грудного вскармливания.
- Непереносимость компонентов препарата.
- Воспаления в области, которая нуждается в инъекциях липолитиков.
- Онкологические заболевания.
- Острые хронические болезни желчного пузыря либо почек.
- Болезни кровеносной системы.
Преимущества инъекций липолитиками
Если брать во внимание пользу и вред липолитиков, то положительных моментов все же больше. Да и опасность вреда появляется только при использовании их, несмотря на имеющиеся противопоказания. Что касается преимуществ, то мы выделили из них три самых больших. А ведь есть еще с десяток поменьше.
Определяющая любого препарата — эффективность. И липолитики в этом плане выше всех похвал: результаты будут видны уже после первого сеанса. Кстати, непосредственно введением активная деятельность в разрушении жировых клеток липолитиками не ограничивается. После сеанса еще примерно 2–4 недели липолитики уничтожают жировые клетки.
Также к преимуществам можно отнести отсутствие подготовки (предварительная консультация не в счет) и восстановительного периода. По сути, пациенту можно провести процедуру в день обращения. А после сеанса можно сразу же вернуться к привычному образу жизни.
Кроме того, процедура с применением препарата Акваликс не имеет побочных действий. Сеансы проводятся с 2009 года и с тех пор не выявлено ни одного случая проявления негативных последствий после сеансов. А между тем инъекции этого препарата проводятся в большинстве стран! Особенно популярны в мире липолитики для живота. Однако и другие локальные жировые отложения корректируются не менее эффективно.
Понравилась статья? Поддержите канал лайком, подпиской, или репостом в соцсетях.
Инъекции стройности: плюсы и минусы липолитиков
Гладкая, упругая кожа и безупречно ровные контуры бедер и ягодиц — мечта многих женщин. Однако осуществить эту мечту довольно непросто — всему виной гиноидная липодистрофия или, попросту говоря, целлюлит. Что из себя представляет грозный противник и стоит ли вступать с ним, казалось бы, в неравный бой?
Инна АПОЛИХИНА, @inna_apolikhina
д. м. н., руководитель отделения эстетической гинекологии и реабилитации ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» Минздрава России, профессор кафедры акушерства
и гинекологии, перинатологии и репродуктологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ
им. И. М. Сеченова Минздрава России, президент Ассоциации специалистов
по эстетической гинекологии (АСЭГ)
Наталия ГАЙДАШ, @natagaid
к. м. н., дерматолог, косметолог, руководитель клиники «Триактив»
Часто проблема так называемого целлюлита воспринимается гинекологами и косметологами по-разному. Первые уверяют, что это явление абсолютно естественное и, как правило, не требует никакого вмешательства, вторые считают целлюлит патологией, с которой необходимо бороться всеми доступными способами. Правда кроется, как обычно, между двух кардинально различающихся мнений, к ней и обратимся.
Процесс пошел
«Наличие подкожной жировой прослойки — это физиологическая норма, — объясняет Инна Аполихина. — Однако под активным влиянием рекламы и косметических компаний женщины начинают испытывать дискомфорт от особенностей внешнего вида этих жировых отложений. Нужно понимать, что образование целлюлита происходит под действием гормонов, и процесс этот носит совершенно естественный характер. С одной стороны, женские половые гормоны (эстрогены) способствуют накоплению жировой ткани по «женскому типу», что обеспечивает готовность организма к возможности наступления беременности.«Целлюлит — вторичный половой признак у женщин, поэтому характерный рельеф на ягодицах и ногах можно наблюдать даже у стройных девушек и откровенно худых моделей, — подтверждает Наталия Гайдаш. — Телосложение здесь не играет особой роли. Как правило, проблема появляется после полового созревания и с ней сталкиваются не только половозрелые женщины, но и подростки, и мальчики, и девочки в пубертатном периоде».
По статистике, около 90% женщин в той или иной степени знакомы с проблемой целлюлита.
Под влиянием
Несмотря на, казалось бы, естественные причины появления целлюлита, он возникает все-таки не у всех женщин и может быть выражен в меньшей или большей степени. «Безусловно, на данный процесс влияет и наследственный фактор, — объясняет Инна Аполихина, — а также состояние коллагеновых волокон в женском организме. К основным механизмам развития целлюлита многие специалисты относят замедление углеводно-жирового обмена и патологическое формирование соединительнотканных волокон.«Следует также отметить, что целлюлит имеет более выраженные признаки у тех, кто ведет сидячий образ жизни, — отмечает Наталия Гайдаш. — Достоверно известно, что при целлюлите происходит нарушение микроциркуляции крови и застой в лимфатической системе. Пораженные области превращаются в своеобразное «болото», где скапливается лишняя жидкость, насыщенная продуктами жизнедеятельности и токсинами, жировые клетки оказываются в ловушке из фиброзной ткани. С этим, конечно, нужно и можно бороться».
Проблема или нет?
Целлюлит имеет разные степени выраженности. И если в одних случаях проблема может быть больше надуманной, то в других – стоит проконсультироваться со специалистами. «При целлюлите нужно направить усилия на оздоровление организма в целом и снижение факторов риска развития подобных состояний, — советует Инна Аполихина. — Сегодня рынок переполнен всевозможными косметологическими услугами, направленными на борьбу с целлюлитом, но при этом важно понимать, что в большинстве случаев проблема больше навязана извне. Ведь только у каждой 401 женщины нет характерных бугристых изменений в области бедер и ягодиц!»«До определенного момента целлюлит не представляет собой проблемы здоровья, — говорит Наталия Гайдаш. — Однако если «лунный пейзаж» стал более резким и выраженным, это может сигнализировать о наличии эндокринных нарушений. Насторожить должны следующие симптомы: отечность ног, бледность кожных покровов и изменение их температуры, онемение и болевые ощущения в областях, пораженных целлюлитом, хрупкость сосудов (когда при малейшем ударе появляются синяки), появление сосудистых звездочек и расширенных вен. В этом случае остро нужна помощь специалиста».
Через тернии
«Причин, по которым борьба с целлюлитом достаточно тяжела, множество, — констатирует Наталия Гайдаш. — Это могут быть конституционные особенности, генетические. Основным препятствием чаще всего являются гормональные нарушения, поэтому следует подключать эндокринолога к работе с такими пациентами. Неправильное пищевое поведение также может быть одним из сдерживающих факторов. И в этом случае мы также подключаем специалистов, которые помогают человеку без стресса, в комфортном режиме скорректировать пищевые привычки и научиться питаться правильно, не испытывая при этом чувства голода. Надо также отметить, что целлюлит особенно активно развивается у городских жительниц, этому способствует образ жизни: гиподинамия, неправильный режим работы и отдыха, нездоровая экологическая обстановка».«Кроме того, целлюлит — это один из вторичных половых признаков, поэтому избавиться от проблемы раз и навсегда нельзя, — утверждает Наталия Гайдаш. — Как только женщина перестает бороться с проблемой, характерный рельеф появляется снова. Лечение и коррекция целлюлита направлены на то, чтобы восстановить метаболизм и циркуляцию крови и лимфы, нормальную работу жировых клеток. Это всегда курсовое лечение».
Ручной метод
Для борьбы с целлюлитом очень популярны методы ручного массажа проблемных участков. Однако зачастую процедура получается не очень приятной. Оправданы ли подобные методики? «В основе любого ручного массажа лежит в том числе и дренажный эффект, — объясняет Наталия Гайдаш. — А, как мы знаем, целлюлит сопровождается нарушением оттока жидкости из клеток. Поэтому любой массаж оказывающий дренажный эффект помогает в решении проблемы целлюлита. Действительно, ручной антицеллюлитный массаж может быть весьма болезненным. Это зависит от техники, опыта специалиста, выполняющего процедуру, от того насколько близко расположены сосуды у пациента, от множества других индивидуальных особенностей. К счастью, сегодня необязательно терпеть боль, чтобы избавиться от целлюлита. Современные аппаратные методы делают коррекцию не просто безболезненной, но и даже приятной».Аппараты в помощь
«Для коррекции целлюлита на сегодняшний момент у нас есть большой парк аппаратных и не аппаратных методик, — говорит Наталия Гайдаш. — К аппаратным относятся: ударно-волновая терапия, радиочастотное воздействие, криолиполиз, лазерное воздействие как низкоинтенсивным лазером, так и хирургический лазерный липолиз, миостимуляция и технология HIFEM, оказывающая высокоинтенсивное фокусированное электромагнитное воздействие, а также технология HIFUS — когда работает высокоинтенсивный сфокусированный ультразвук. Рассмотрим ключевые аппаратные методы по работе с целлюлитом:Ударно-волновая терапия
Это физиотерапевтический метод лечения, при котором основное воздействие на организм человека оказывают акустические волны низких частот. Сгенерированная аппаратом волна проникает вглубь подкожно-жировой клетчатки и механически воздействует на нее. В ходе процедуры жировые клетки «разбиваются», усиливается микроциркуляция, обмен веществ. Для получения эффекта требуется от двух до восьми процедур. Результат нарастает еще два месяца после окончания курса, а поддерживающая терапия позволяет сохранить результат так долго, как это требуется.
RF-терапия
Имеется большое разнообразие радиочастотных методик. Они могут быть моно-полярными, биполярными и мультиполярными, что в свою очередь сказывается на глубине воздействия: будет ли оно поверхностным или более глубоким. Также используют сочетанные физические факторы, добавляя к радиочастотному воздействию ультразвук, вакуум, магнитотерапию и инфракрасное излучение. В этом случае результативность будет намного выше. Курс процедур – от двух до шести, рассчитывается индивидуально. Эффект сохраняется при условии проведения поддерживающей терапии.Лимфодренажные методики
Сюда относятся все виды механического воздействия, связанного с лимфодренажным эффектом. Современные методики аппаратного массажа совершенно безболезненны, очень приятны и самое главное — дают выраженный результат. Как правило все массажные процедуры выполняются курсом от 6 сеансов. Эффект сохраняется достаточно продолжительное время, а поддерживающая терапия позволяет его значительно продлить».Действовать сообща
«В целом, меры по профилактике и борьбе с «целлюлитом» должны быть направлены на оздоровление организма, — утверждает Инна Аполихина. — Это прежде всего рациональная диета с соблюдением калорийности и вида питания, дозированная физическая нагрузка, полноценный сон, прием недостающих витаминов, отказ от курения. Аппаратные процедуры должны быть направлены на улучшение микроциркуляции в сосудистом русле и улучшение лимфооттока. Конечно, здесь требуется комплексный подход».«Безусловно, комплексный подход важен, — подтверждает Наталия Гайдаш. — Более того, добиться стойких результатов можно только благодаря комплексному подходу. Нужно оценить состояние здоровья женщины, анамнез, узнать об образе жизни, выяснить есть ли еще какие-то проблемы, помимо целлюлита. Возможно, потребуется провести обследования. Для каждого человека необходимо разработать индивидуальную схему лечения, подобрать подходящие именно ему процедуры. И параллельно работать как с внешними проявлениями целлюлита, так и с внутренними. Иначе результат будет крайне недолговечным».
Подводя итог
«Нельзя забывать о том, что целлюлит является специфической проблемой для женщин, — подытоживает Наталия Гайдаш. — Если мы посмотрим на картины великих голландских мастеров, то увидим целлюлит во всей красе. Но в то время никто не считал это некрасивым. Сегодня восприятие женского тела несколько изменилось. И теперь мы знаем, что целлюлит все-таки не только эстетическая проблема и решать ее можно только комплексно, с помощью правильно подобранных алгоритмов и процедур. Хочется обратить внимание на то, что нельзя убрать целлюлит навсегда за одну процедуру. Даже после курса сеансов, если пациент хочет сохранить результат, потребуется поддерживающая терапия. Это не только повтор процедур, но и образ жизни. Стать лучшей версией себя — к этому мы призываем наших пациентов и помогаем им добиться этого и сохранить результат».Липолитическая мезотерапия — инъекционная коррекция фигуры в Николаеве
Липолитическая мезотерапия — это методика введения специальных коктейлей под кожу дозировано для стимуляции липолиза. Тончайшими и короткими иглами вводятся препараты в зоны локальных жировых отложений (живот, боковые валики живота, ягодицы, задняя поверхность бедра, внутренняя поверхность бедра, галифе).
Мезотерапия липолитическая давно стала одной из наиболее востребованных методов коррекции фигуры, улучшения качества кожи и избавления от целлюлита. При правильном подборе определенных препаратов, соблюдении правил проведения мезотерапии — можно получить быстрый и впечатляющий результат.
В клинике «Арника» врачи-косметологи с помощью процедуры липолитической мезотерапии доставляют специальные коктейли, содержащие липолитические и сосудистые компоненты в дерму (средний слой кожи), куда нет возможности проникнуть средствам, наносимым на поверхность кожи.
Показания к применению липолитических коктейлей:
- целлюлит
- растяжки, дряблость кожи
- растяжки
- «лишние сантиметры»
Мезотерапия для похудения
Если вы хотите избавиться от лишней жировой ткани и одновременно омолодить кожу, советуем обратить внимание на мезотерапию липолитиками.
Вводимые препараты в дерму подбираются индивидуально, в зависимости от устранения определенной проблемной зоны, возраста и тонуса кожи. Применяют как монопрепарат, так и сочетание лекарственных препаратов в виде так называемых мезококтейлей. Как правило, более 3 компонентов не используют. В состав коктейлей входят аминокислоты, гомеопатические средства, витамины. Их вводят на глубину до 6 мм.
Мезотерапия от целлюлита
Перед тем как лечить целлюлит, нужно понимать причины его возникновения. Причины могут разные у каждого пациента. Целлюлит прекрасно лечится мезотерапией в таких зонах как живот, бедра, талия, руки, двойной подбородок.
Косметологи вводят в подкожную жировую ткань жиросжигающие препараты, которые одновременно разрушают жировые клетки и способствуют выведению продуктов распада из организма. При помощи липолитической мезотерапии достигается не только эффект уменьшения объемов тела и избавления от целлюлита, но и улучшение эластичности и упругости кожи.
Мезотерапия живота
Мезотерапия области живота – это интрадермальное введение подобранных лекарственных препаратов, с целью устранения лишней жировой ткани, растяжек и целлюлита, а также придания потерявшим упругость кожным покровам необходимый тонус.
Для возвращения упругости и необходимого тонуса в проблемные зоны вводят вещества, которые могут “расплавлять” жир. К ним относятся липолитики, витамины, минералы, эластин, коллаген, ферменты, препараты для лимфодренажа. Таким образом, улучшить состояние фигуры можно без сложных манипуляций и оперативного вмешательства.
Мезотерапия от растяжек
Мезотерапия против растяжек – это самый эффективный способ навсегда попрощаться с этим дефектом, а профилактика появления новых стрий (растяжек) поможет избежать этой проблемы в будущем.
Свежие растяжки можно удалить с помощью инъекций специально подобранных «коктейлей красоты». Кожа насыщается витаминами и минералами и быстро разглаживается. Живот и бёдра становятся ровными и красивыми и подтянутыми, как будто никаких растяжек на них и не было.
Основные преимущества липолитической мезотерапии:
- физиологичность (вследствии нормализации на клеточном уровне)
- длительность сохранения полученных результатов
- доступность любых участков
- неограниченность возраста
- общеукрепляющий эффект
- оздоравливающий эффект
- омолаживающий эффект
- процедура занимает немного времени, она не требует реабилитационного периода
Хотите выглядеть подтянуто, молодо и привлекательно — обращайтесь в Медицинский Центр «ARNIKA»
инъекции для похудения Акваликс, Дермастабилон, липолитический коктейль Микеланджело
Интралипотерапия – методика устранения локальных жировых отложений на различных участках тела инъекциями липолитиков, позволяющих восстановить нормальных липидный обмен.
Эффект липолитических инъекций для похудения основан на расщеплении жиров под действием фермента фосфатидилхолина (лецитина). Образующиеся при этом жирные кислоты затем выводятся из организма природным способом через дренажную систему лимфатических сосудов.
Чтобы обеспечить подтягивающее действие, в состав липолитических коктейлей включены соответствующие компоненты.
Дермастабилон
В состав инъекций для похудения Дермастабилон входят 2 активных компонента:
- Дезоксихолат – соль желчной кислоты, которая разрушает оболочку жировой клетки для доступа к жирам липолитического фермента, о чем упоминалось выше.
- Фосфатидилхолин – фермент, который расщепляет жиры с образованием эмульсии.
Курс применения Дермастабилона зависит от количества жировой ткани, от которой необходимо избавиться. Инъекции нельзя делать чаще, чем 1 раз в 8-10 дней.
Уколы данного препарата противопоказаны людям с желчнокаменной болезнью (могут спровоцировать приступ желчной колики). После липолиза Дермастабилоном часто развивается воспалительная реакция – это нормально. Спустя несколько дней все пройдет само собой.
Дермастабилон выпускается в ампулах по 5 мл. Инъекции нужно делать на глубину 1 см, расстояние между уколами должно превышать 10 мм, количество препарата на 1 укол – 0,2 мл
Акваликс
Липолитик Акваликс относится к инновационным препаратам для интралипотерапии. Действующим веществом также является дезоксихолат натрия. Препарат имеет особую гелеобразную консистенцию, благодаря трехмерному полимеру галактозы. Данный носитель связывает молекулы дезоксихолата, который высвобождается после введения Акваликса в организм постепенно, на протяжении нескольких дней.
Таким образом, гелеобразная структура позволяет точно распределить препарат в подкожной клетчатке. Препарат ликвидирует жировую прослойку равномерно, что исключает появление характерных неровностей и бугорков на коже. Акваликс очень эффективен: для достижения необходимого эффекта похудения достаточно всего 2-3 инъекций Акваликса, а не десятков, как это бывает с обычными липолитиками.
Выпускается Акваликс во флаконах по 8 мл. На одну процедуру (в зависимости от площади) потребуется 15-20 мл. Нельзя вводить лекарство глубже, чем 1,5 см, иначе можно травмировать мышцы и другие ткани.
Липолитический коктейль Микеланджело. Липолитик с ревитализирующим действием
В состав липолитического коктейля входят: фосфатидилхолин 4%, диоксихолиевая кислота, карнитин, кофеин, липоидная кислота, стволовые клетки растений. Он запускает в организме целый ряд процессов:
- Расщепление локальных жировых отложений;
- Улучшение микроциркуляции крови;
- Лечение целлюлита;
- Восстановление текстуры кожи;
- Усиление дренажной функции лимфатической системы.
Показания к инъекциям липолитика Микеланджело:
- Локальные жировые отложения;
- Целлюлит.
Инъекции производятся иглой 0,4×0,6 мм (27 G) в акупунктурные точки по 0,2-0,3.
Длительность курса инъекций для похудения:
- Лечебный: 6 процедур с интервалом в 10-14 дней;
- Профилактический: 3 процедуры с интервалом в 10-14 дней.
Возможно проведение поддерживающих процедур 1 раз в месяц. Повторный курс детоксикации и омоложения организма проводится через 6 месяцев.
Цены на инъекции Дермастабилона, Акваликса и липолитического коктейля Микеланджело в отделении Косметологии и дерматологии ЗАО «Эндокринологический центр» в прайс-листе. На сайте вы можете записаться на прием или задать вопрос косметологу.
Также рекомендуем процедуры биоревитализации, мезотерапии и плазмолифтинга для лица и тела.
Мезотерапия липолитический коктейль
Мезотерапия липолитический коктейль
Мезотерапия направленно воздействует на различные структуры кожи целевыми препаратами, оказывая восстанавливающий, тонизирующий эффект, ускоряя обменные процессы. Интенсивное липолитическое действие максимально проявляется при подкожном введении. В результате жировые клетки и блокируют их появление на других участках тела.
Лимфодренаж подразумевает детоксикацию организма, снятие отёков, выравнивание цвета и структуры кожи. Состав коктейлей подбирается индивидуально после комплексного обследования.
Мезотерапия — это метод введения лечебных препаратов в виде инъекций в очень низких дозах с целью получения лечебного эффекта за счет действия вводимых медикаментов и эффекта стимуляции рефлексогенных зон кожи. Мезотерапия используется в последнее время очень широко в разных направлениях, в том числе косметологии, неврологии, терапии, травматологии, спортивной медицине.
Липолитический коктейль с ингредиентами вашей неотразимости
Инъекции красоты, стройности и молодости? Еще недавно это могло показаться невозможным, но уже сегодня, благодаря разработанным и успешно применяемым липолитическим коктейлям, инъекции действительно могут подарить женщине стройность и вернуть молодость ее кожи! Всего за несколько сеансов.
Существует множество рецептов таких коктейлей с уникальными ингредиентами. Однако все они призваны решать несколько основных задач:
— удалять локальные жировые отложения на теле, бедрах, животе;
— удалять главный симптом целлюлита – «апельсиновую корку»;
— снимать отечность;
— препятствовать образованию сосудистых «звездочек» и другое.
Липолитический коктейль: процедура
Кожа в местах инъекций обрабатывается антисептическим раствором, после чего, используя технику мезотрапии, коктейль вводят подкожно на глубину до 13 мм. Затем косметолог совершает множественные инъекции в проблемную зону.
Полный курс липолитических жиросжигающих коктейлей составляет от 5-ти до 10-ти процедур с интервалом до двух недель. Каждый курс назначается косметологом индивидуально.
Мезотерапия тела и живота — что это такое, плюсы процедуры, показания и противопоказания, побочные эффекты и препараты.
Методика проведения мезотерапии на животе находится в сильной зависимости от целей процедуры. Однако в целом из-за особенностей строения кожи на данном участке тела, инъекции практически всегда достаточно глубокие, а объемы вводимых лекарственных коктейлей относительно велики.
Наиболее часто пациенты обращаются к услугам врача косметолога для удаления жировых скоплений на животе. Важно отметить, что процедура мезотерапии не может значительно уменьшить массу тела, особенно если человек не устранит причину накопления жира – неправильное питание, малоподвижный образ жизни и др. Однако определенный эффект после введения липолитиков всегда налицо.
Косметолог визуально и пальпаторно определяет размеры и границы локального скопления жировой ткани (как правило, они расположены двумя группами симметрично относительно срединной линии тела). После этого кожа протирается ватным диском с раствором антисептика (0,25% раствором хлоргексидина биглюконата или 70% этиловым спиртом). Затем на область воздействия накладывают анестетический гель, который иногда покрывают окклюзионной повязкой на 20-30 минут. За это время врач подготавливает инструментарий для процедуры.
В данном типе мезотерапии используют иглу G30 (толщиной 0,4 мм) длиной 13 мм. Что касается объемов шприца, то он зависит от типа вводимого препарата, то есть, в конечном итоге – от количества вводимой жидкости.
После очищения кожи от остатков анестетика специалист в нескольких точках производит инъекции на всю длину иглы, держа шприц перпендикулярно, предварительно собрав кожу в складку. Количество препарата, выпускаемого за одну инъекцию, зависит от состава лекарственного коктейля. Таким образом обкалывается вся зона жирового скопления. После последней инъекции поверхность кожи протирается антисептиком. Данную методику называют инфильтрацией.
При послеоперационных шрамах и растяжках мезотерапию производят непосредственно в зоне дефекта. Обработав кожу антисептиков и приняв меры по обезболиванию, косметолог берет шприц объемом 2-5 мл с иглой G29или G30 6-13 мм и приступает к процедуре. Техника манипуляции – линейно-ретроградная, большинство специалистов предпочитает ее трассирующий вариант. Уколы производятся под малым углом к коже на расстоянии 1 см друг от друга по ходу дефекта кожи. Суть воздействия сводится к тому, что давлением лекарственной жидкости разрушаются фиброзные структуры дефекта, а лечебные компоненты коктейля стимулируют развитие более нежных коллагеновых волокон.
При целлюлите и других подобных нарушениях на коже живота практикуют введение тонизирующих коктейлей аналогичных таковым при гиноидной липодистрофии на бедрах и ягодицах.
Липолитики для похудения – что это? Можно ли похудеть при помощи укола?
Мнение
Роксана Киселева
Автор-эксперт
Выяснили, что такое липолитики, как они работают, помогают ли в борьбе за похудение – и безопасно ли вообще их применение.
Содержание:
Липолитики — это препараты с жиросжигающим эффектом. В косметологии принято разделять липолитики на прямые и непрямые, – они различаются принципом действия.
- Прямые липолитики расщепляют жиры в жировых клетках, и обработанная область быстро худеет. Их основные действующие вещества — дезоксихолат и фосфатидилхолин (производная лецитина). Первый растворяет клеточные мембраны, а второй — жировые клетки.
- Непрямые липолитики ничего не сжигают, а только улучшают микроциркуляцию в клетках и оказывают лимфодренажный эффект — вы тоже теряете объемы, но уходит уже не жир, а вода.
Препарат вводится на глубину от 1 см и больше, в зависимости от зоны коррекции. Процедура считается малоболезненной, восстановительный период — короткий, пара дней. Обычно курс составляет от 3-4 до 8-10 сеансов с перерывами между инъекциями не менее 10-15 дней, чтобы печень успела вывести весь «мусор» из организма. Сразу после процедуры рекомендуют сделать легкий массаж обработанной зоны, чтобы препарат не закапсулировался.
Значительно похудеть липолитики не помогут, их предел – это растворить 100-150 г жировой ткани. Поэтому косметологи рекомендуют инъекционную липосакцию только для незначительной коррекции фигуры: когда человек хочет избавиться от складки на животе или над коленями, сделать бока чуть меньше, талию немного уже и так далее.
Не всегда такие уколы работают. Согласно исследованию, опубликованному в журнале Aesthetic Surgery Journal, около 17% из 17 000 пациентов были разочарованы результатом, хотя статистика в целом положительная.
Тут все сложно. Фосфатидилхолин запрещен в ряде европейских стран, потому что процедуры на его основе иногда вызывают серьезные осложнения — отеки, воспаления и даже некроз тканей. Более того, FDA (Американское Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) утверждает, что фосфатидилхолин даже не был одобрен для использования в инъекционной косметологии.
Достоверных данных о том, насколько липолитики безопасны или эффективны, нет. Единственное исследование на эту тему было спонсировано компанией-производителем жиросжигающих препаратов, так что выглядит сомнительно.
В общем, пока совершенно непонятно, куда исчезает жир после расщепления. В теории, продукты распада жировых клеток выводятся из человеческого организма через печень, но точной информации об этом пока нет.
Синди Пирсон, директор Национальной женской сети здравоохранения (некоммерческой группы защиты прав потребителей в США) считает, что FDA должны вмешаться и остановить производство подобных препаратов, пока их безопасность не будет доказана. А врачам стоит убрать инъекционную липосакцию из списка процедур.
Косметологи, конечно, не согласны: сейчас это одна из самых востребованных услуг, особенно в весенне-летний период. Поэтому они предпочитают говорить клиентам, что их препараты сделаны на основе лецитина, который ассоциируется у клиентов с чем-то полезным.
Что в итоге? Наш совет — воздержаться до выяснения обстоятельств. А если хотите избавиться от пары сантиметров — попробуйте спорт, массаж и коррекцию питания, потому что быстрого и безопасного похудения, увы, не бывает.
Узнайте больше по тегам:
Роксана Киселева
Автор-эксперт
Вам будет интересноВам будет интересноВам будет интересноВам будет интересноВам будет интересно
Липолитические эффекты сыворотки и плазмы на изолированные жировые клетки крысы in vitro
Карлсон, Л.А .: Липолиз триглицеридов жировой ткани. Регуляция, физиологическое и клиническое значение. Отрывок. Med. Int. Конг. Сер. № 161 , 143–149 (1969).
Google Scholar
Froesch, E.R .: Физиология и фармакология липолиза жировой ткани: его ингибирование и значение для лечения диабета.Диабетология 3 , 475–487 (1967).
PubMed Google Scholar
Friesen, H .: Пептиды гипофиза и мобилизация жира. Метаболизм 13 , 1214–1229 (1964).
PubMed Google Scholar
Рекант, Л., Алп, Х., Кох, М.Б., Эггеман, Дж .: Неэтерифицированная активность диабетической сыворотки по высвобождению жирных кислот. Ланцет 1963 II , 614–616.
Google Scholar
Бернс, Т.В., Хейлз, К.Н., Хартри, А.С.: Наблюдения за липолитической активностью человеческой сыворотки и фракций гипофиза in vitro. J. Endocr. 39 , 213–225 (1967).
PubMed Google Scholar
Кертис-Прайор, П.Б .: Получение и чувствительность изолированных жировых клеток крысы к липолитическому агонисту сыворотки. Отчеты больницы Гая (1972) приняты к публикации.
Curtis-Prior, P.B., Hanley, T.: Фактор мобилизации жира в сыворотке (1972) в стадии подготовки.
Барретт А.М .: Влияние хлорфеноксиизомасляной кислоты на высвобождение свободных жирных кислот из изолированной жировой ткани in vitro. Брит. J. Pharmacol. 26 , 363–371 (1966).
Google Scholar
Родбелл, М .: Метаболизм изолированных жировых клеток. J. Biol. Chem. 239 , 375–380 (1964).
PubMed Google Scholar
Фолкнер Д.Э .: Автоматическое микроопределение уровня глюкозы в крови с помощью автоанализатора. Аналитик. 90 , 736–744 (1965).
PubMed Google Scholar
Виланд, О .: В: Методы ферментативного анализа Бергмейера, Х.У., с. 211. Лондон: Academic Press, 1963.
. Google Scholar
Фолч, Дж., Лис, М., Слоан-Стэнли, Г. Х .: Простой метод выделения и очистки общих липидов из тканей животных. J. Biol. Chem. 226 , 497–509 (1957).
PubMed Google Scholar
Curtis-Prior, P.B., Trethewey, J., Stewart, G.A., Hanley, T .: Вклад различных органов и тканей крысы в ассимиляцию глюкозы. Диабетология 5 , 384–391 (1969).
PubMed Google Scholar
Curtis-Prior, P.B .: Эффекты инсулина и антиинсулина на липолитическую активность сыворотки в изолированных жировых клетках крысы. (1972). Отправлено для публикации.
Балли П.Р., Каппелер Х., Фрош Э.Р., Лабхарт А .: Влияние глюкозы на спонтанное ограничение липолиза в изолированной жировой ткани: потенциальный регуляторный механизм. Аня. N.Y. Acad. Sci. 131 , 143–156 (1965).
PubMed Google Scholar
Хо, Р.Дж., Англия, Р., Мэн, Х.К .: Влияние глюкозы на липолиз и энергетический обмен в жировых клетках. Life Sei. 9 , Часть I, 137–150 (1970).
Google Scholar
Кертис-Прайор, П.Б .: Неопубликованные наблюдения (1971).
Лопес, Э., Уайт, Дж. Э., Энгель, Ф.Л .: Требования к контрасту для липолитического действия кортикотропина и адреналина на жировую ткань in vitro. J. Biol. Chem. 234 , 2254–2258 (1959).
PubMed Google Scholar
Мосинджер, Б., Браун, Т., Куджелоа, В., Венкеова, Дж .: Метаболизм жирных кислот и мобилизация жировых запасов. CS. гастроэнтерол. а вызива 16 , 206–213 (1962).
Google Scholar
Холленберг, К.Х .: Влияние питания на активность и высвобождение липазы из жировой ткани крысы.Являюсь. J. Physiol. 197 , 667 (1959).
PubMed Google Scholar
Curtis-Prior, P.B .: Ингибирование этанолом стимулированного сывороткой липолиза в изолированных жировых клетках крысы. Принята к публикации Experientia (1972).
Регулирование липолиза в адипоцитах
Annu Rev Nutr. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 15 июня.
Опубликован в окончательной отредактированной форме как:
PMCID: PMC2885771
NIHMSID: NIHMS211108
Департамент диетологии и токсикологии Калифорнийского университета, Беркли, Калифорния, окончательная редакция 94720
Версия этой статьи доступна на Annu Rev Nutr См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.Abstract
Липолиз триацилглицериновых запасов белой жировой ткани приводит к высвобождению глицерина и неэтерифицированных жирных кислот, которые попадают в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов. В ответ на изменения состояния питания скорость липолиза точно регулируется с помощью гормональных и биохимических сигналов. Эти сигналы модулируют активность липолитических ферментов и дополнительных белков, обеспечивая максимальную чувствительность жировой ткани к изменениям потребности в энергии и ее доступности.Недавно был идентифицирован ряд новых триацилглицеридных липаз адипоцитов, включая деснутрин / ATGL, что значительно расширило наши представления о липолизе адипоцитов. Мы также начали лучше понимать роль ряда неферментативных белков, которые имеют решающее значение для распада триацилглицеридов. В этом обзоре представлен обзор основных медиаторов липолиза и регуляции этого процесса путем изменения статуса питания и потребления питательных веществ.
Ключевые слова: адипоцит, липолиз, триацилглицерид липаза, перилипин, деснутрин / ATGL, гормоночувствительная липаза
ВВЕДЕНИЕ
Триацилглицерин (ТАГ) белой жировой ткани (WAT) является основным запасом энергии в высших эукариотах.Этот пул липидов находится в постоянном движении, что является результатом в значительной степени бесполезного цикла липолиза и повторной этерификации (55). Во время дефицита энергии WAT претерпевает сдвиг в сторону более высоких чистых скоростей липолиза, который можно определить как гидролиз TAG с образованием жирных кислот (ЖК) и глицерина, которые высвобождаются в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов. Липолиз протекает упорядоченно и регулируемым образом, при этом на каждом этапе действуют разные ферменты. ТАГ гидролизуется последовательно с образованием диацилглицерина (ДАГ), затем моноацилглицерина (МАГ) с высвобождением ЖК на каждой стадии.MAG гидролизуется с высвобождением окончательной ЖК и глицерина. Хранение запасов энергии в виде ТАГ и способность быстро мобилизовать эти резервы в виде ЖК для удовлетворения потребностей в энергии представляет собой высоко адаптированный метаболический ответ. Высвобождение ЖК из ТАГ путем липолиза адипоцитов также важно для обеспечения субстратом печеночного синтеза липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Циркулирующие ЖК являются основным источником субстрата для производства печенью липопротеинов, богатых ТАГ (34, 80), а нарушение липолиза жировой ткани подавляет синтез ЛПОНП (44, 94, 134).
Изменения липолиза часто связаны с ожирением, включая увеличение базальной скорости липолиза, что может способствовать развитию инсулинорезистентности, а также нарушение реакции на стимулированный липолиз (65, 102). Ожирение характеризуется, прежде всего, избытком WAT и увеличением размера адипоцитов в результате увеличения накопления TAG. Ожирение стало распространенной проблемой для здоровья из-за его тесной связи с рядом заболеваний, включая диабет 2 типа, гипертонию и атеросклероз (133).Здесь мы рассмотрим липолиз адипоцитов и основные факторы питания, контролирующие этот процесс. дает обзор нутритивной регуляции липолиза адипоцитов.
Регуляция липолиза адипоцитов.
ГИДРОЛИЗ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
До недавнего времени считалось, что инициация гидролиза ТАГ в жировой ткани контролируется гормоночувствительной липазой (HSL) (109). Однако создание HSL-нулевых моделей мышей ясно продемонстрировало существование остаточной HSL-независимой активности ТАГ-липазы, что позволяет предположить наличие ранее не идентифицированного фермента (ов) адипоцитов с ТАГ-гидролазной активностью (44, 94, 134).В последние годы были идентифицированы и охарактеризованы новые липазы жировой ткани. Все они представляют собой сериновые эстеразы, содержащие общий структурный элемент — альфа / бета-гидролазную складку — и консервативную каталитическую диаду или триаду, состоящую из пентапептидного мотива G X S X G, а также активного аспартата или глутамата. (D / E) трипептид GG и активный гистидин (H). Исследования по определению относительного вклада каждого фермента в липолиз адипоцитов продолжаются.
Гормоночувствительная липаза
Жировая ткань HSL (E.C. 3.1.1.3) представляет собой цитоплазматический белок 84 кДа с продемонстрированной активностью против широкого спектра субстратов, включая ТАГ, ДАГ, сложные эфиры холестерина (ХЭ) и сложные эфиры ретинила (51). Относительная активность жирной ацилгидролазы HSL in vitro в одиннадцать раз выше по сравнению с DAG, чем по TAG, и в два раза выше по отношению к CE (51). HSL проявляет предпочтение в отношении активности против жирных кислот в положении sn-1 или sn-3 (99). До недавнего времени считалось, что HSL является основным ферментом, ответственным практически за всю активность гидролаз ТАГ и ДАГ в адипоцитах, а также за активность гидролазы нейтрального холестерилового эфира (NCEH).Чтобы выяснить функциональную роль HSL in vivo, несколько лабораторий создали модели мышей с нулевым HSL (44, 94, 134). Хотя между этими моделями наблюдались различия, многое было сделано в отношении относительного вклада HSL в гидролиз TAG адипоцитов. Например, исследования показали, что, хотя активность NCEH действительно отсутствовала в HSL-нулевых адипоцитах, значительная часть катехоламинов стимулировала липолиз (90, 94), и большая часть, если не весь, базальный липолиз сохранялась (30, 134).Более того, липолитический ответ на длительное голодание (> 48 ч) оказался нормальным у HSL-нулевых мышей, которые продемонстрировали адекватную или даже повышенную мобилизацию и окисление ЖК (30). Однако HSL-опосредованный липолиз действительно вносит важный вклад в высвобождение жирных ЖК. HSL-нулевые мыши демонстрировали более низкие уровни NEFA и TAG в сыворотке и сниженное накопление TAG в печени, что указывает на то, что HSL-независимый липолиз был недостаточным для поддержания выхода ЖК из жировой ткани на уровнях, которые могли бы удовлетворить нормальные потребности в энергетических субстратах и синтезе VLDL (45, 132) .
Изучение физиологии HSL-нулевых мышей предлагает дополнительное понимание относительной важности HSL в гидролизе ТАГ in vivo. На нормальной диете HSL-нулевые мыши имели массу тела, аналогичную мышам дикого типа (47), а размер адипоцитов, как сообщается, был либо аналогичным, либо немного большим (94) — открытие, которое согласуется с ролью HSL в ЖК адипоцитов. мобилизация. Однако масса WAT у этих животных либо не изменилась (94), либо уменьшилась в размерах (134). Кроме того, при диете с высоким содержанием жиров аблация HSL была связана со значительным защитным эффектом против развития ожирения (47).Этот результат был неожиданным, но его можно объяснить тем фактом, что в отсутствие HSL адипоциты претерпевают компенсаторное снижение повторной этерификации ЖК, что приводит к снижению ресинтеза ТАГ и увеличению высвобождения ЖК в сосудистой сети (144). Хотя этот компенсаторный ответ мог затруднить измерение истинного вклада HSL в мобилизацию жирных кислот жировой ткани, из ряда исследований ясно, что HSL не требуется строго для инициации гидролиза ТАГ.Этот факт становится еще более очевидным, когда обнаруживается, что DAG, но не TAG, накапливается в адипоцитах HSL-нулевых мышей (44). Относительный вклад HSL в липолиз DAG обсуждается ниже.
Деснутрин / жировая триглицерид-липаза
В 2004 году, используя микроматрицу крысиного кДНК-анализа адипоцит-специфических генов, мы идентифицировали и охарактеризовали новую адипоцитную ТАГ липазу, которую мы назвали деснутрин (130). Деснутрин представляет собой белок 54 кДа, который содержит N-концевой пататин-подобный домен, который обнаружен во многих ацилгидролазах растений и характеризуется консервативным серином в мотиве G X S X G, альфа / бета-гидролазе fold, консервативный аспартат, принадлежащий мотиву D X (G / A), и богатую глицином область (130).Этот же фермент впоследствии был идентифицирован двумя другими лабораториями в результате поиска в базе данных белков, содержащих консервативный пентапептидный мотив G X S X G и альфа / бета-гидролазную складку, и был назван липазой триглицерида жиров (ATGL) (145) или iPLA2ζ (53, 145). Мышиный деснутрин / ATGL обнаруживается преимущественно в жировой ткани, но он также обнаруживается на гораздо более низких уровнях в других тканях, особенно в сердечных и скелетных мышцах и семенниках. Когда клетки содержат жировые запасы, такие как дифференцированные клетки 3T3-L1 (145), а также клетки HeLa, выращенные в среде, богатой олеиновой кислотой (115), деснутрин / ATGL обнаруживается как в цитоплазме, так и тесно связан с липидной каплей (115). , 130, 145).Было обнаружено, что в клетках COS-7, в которых отсутствуют значительные липидные капли, деснутрин / ATGL относительно однородно распределен в цитоплазме (130). Факторы, управляющие субклеточным распределением деснутрина / ATGL, включая механизмы, с помощью которых цитоплазматический фермент получает доступ к своему субстрату и потенциальную транслокацию в липидную каплю, еще предстоит определить.
Несколько линий доказательств указывают на то, что деснутрин / ATGL является TAG-специфической липазой. Мы показали, что сверхэкспрессия деснутрина / ATGL в клетках COS-7 увеличивает высвобождение FFA в среду, уменьшая внутриклеточные запасы TAG, не влияя на внутриклеточные запасы фосфолипидов (130).О подобном влиянии на уровень ТАГ также сообщалось в клетках 293HEK (62), тогда как было показано, что экспрессия деснутрина / ATGL в адипоцитах 3T3-L1 увеличивает высвобождение как глицерина, так и ЖК (144). In vitro гидролазная активность ТАГ была продемонстрирована для фермента, очищенного путем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и клетках 293HEK, а также в клетках COS-7 (53, 130, 145). Специфичность деснутрина / ATGL в отношении ТАГ также была исследована. Циммерманн и др. (144) получали цитозольные экстракты из клеток HepG2, инфицированных аденовирусным деснутрином / ATGL, и инкубировали их с радиоактивно меченными триолеином и диолеиновыми субстратами.Они обнаружили значительно более высокую активность липазы ТАГ (примерно в шесть-десять раз выше), чем активность липазы ДАГ, что указывает на первичную роль фермента в катализе первой, лимитирующей стадии стадии липолиза. Этот вывод был подтвержден работой с клетками COS-7, демонстрирующей 21-кратное увеличение накопления DAG в клетках, трансфицированных деснутрином / ATGL, по сравнению с HSL, а также умеренное увеличение уровней MAG (144). Экстракты из клеток COS-7, временно экспрессирующих деснутрин / ATGL, обладали активностью против сложных эфиров холестерина и сложных эфиров ретинила, которая была сопоставима с контрольными значениями (144), что дополнительно демонстрирует специфическую роль деснутрина / ATGL в гидролизе TAG.
Пищевая регуляция деснутрина / ATGL дополнительно подтверждает роль этого фермента в мобилизации запасов ТАГ в ответ на повышенную потребность в энергии. Мы показали, что деснутрин / ATGL индуцируется голоданием у мышей и подавляется повторным кормлением (130). Регулирование мРНК деснутрина / ATGL глюкокортикоидами может объяснить это, поскольку было обнаружено, что дексаметазон сильно повышает регуляцию фермента в зависимости от концентрации и дозы в преадипоцитах 3T3-L1 (130). Мы также обнаружили, что дезнутрин / ATGL подавляется у мышей ob / ob и db / db, что дополнительно подтверждает роль фермента в расщеплении жира и предполагает возможную роль в развитии ожирения (130).
Относительная важность деснутрина / ATGL в липолизе проиллюстрирована исследованиями абляции гена и функциональной потери фермента. Было показано, что миРНК, направленная против деснутрина / ATGL, значительно снижает высвобождение глицерина и ЖК из адипоцитов 3T3-L1 (144), что указывает на нарушение липолиза, который не компенсируется присутствием других липаз. В подтверждение этого, обработка цитозольных экстрактов мышиных WAT и BAT антителами деснутрина / ATGL снижала высвобождение ЖК примерно на две трети (144).Это снижение было более выраженным, когда использовались адипоциты от HSL-нулевых мышей, открытие, которое предполагает наличие кооперативности между двумя ферментами, и действительно, наблюдается синергетический эффект на липолиз, когда клетки котрансфицируют как деснутрином / ATGL, так и HSL (144). ). Следовательно, для достижения оптимальных скоростей липолиза, вероятно, требуется экспрессия обеих ацилгидролаз. Глобальная потеря функции гена деснутрина / ATGL у мышей привела к увеличению веса и сдвигу в пользу углеводов вместо жира в качестве основного источника топлива во время голодания, указывая на то, что in vivo деснутрин / ATGL, вероятно, также участвует в липолизе жировой ткани (43).Однако неожиданно вес жировых подушечек WAT был увеличен только примерно в два раза, что позволяет предположить, что могут присутствовать другие липазы TAG, которые могут частично компенсировать потерю деснутрина / ATGL. Также удивительным было открытие, что потеря деснутрина / ATGL была связана с преждевременной смертью. Это произошло в результате эктопического накопления жира в сердце, где уровни ТАГ кардиомиоцитов увеличились в двадцать раз к 12-недельному возрасту. Внематочное накопление жира также было очевидным в других тканях. Этот эффект наблюдался, несмотря на более благоприятный липидный профиль плазмы и повышенную чувствительность к инсулину.Общая активность липазы была резко снижена в нескольких тканях, включая WAT и BAT, а также сердечную мышцу, скелетную мышцу, яички и печень. Это открытие подчеркивает потенциальную метаболическую важность внутриклеточного гидролиза ТАГ в тканях, отличных от жировой ткани, и указывает на то, что деснутрин / ATGL может играть решающую роль в высвобождении ЖК во многих тканях. Для проверки этой гипотезы потребуется создание моделей условного нокаута, лишенных деснутрина / ATGL в отдельных тканях.
Триацилглицерингидролазы
Soni et al. (116) были первой группой, которая сообщила об открытии новой липазы ТАГ, которая может способствовать не-HSL-опосредованному липолизу ТАГ в адипоцитах. Другие впоследствии подтвердили присутствие триацилглицерин гидролазы (TGH; карбоксилэстераза 3; EC 3.1.1.1) в жировой ткани (10). TGH представляет собой микросомальную липазу 60 кДа, которая содержит каталитическую триаду с серином активного центра, расположенным в G-мотиве G X S X (68). TGH проявляет активность против длинно-, средне- и короткоцепочечных TAG, а также, как сообщается, гидролизует нейтральные сложные эфиры холестерина (88), но ему не хватает активности фосфолипазы или ацил-CoA тиоэстеразы (69).Фермент экспрессируется преимущественно в печени, где он участвует в мобилизации внутриклеточных запасов ТАГ и, вероятно, играет решающую роль в синтезе богатых ТАГ липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) (39).
Однако недавно TGH был идентифицирован и в других тканях, включая почки, сердце, кишечник и жировую ткань (26). В клетках 3T3-L1 экспрессия TGH повышается в десять раз при дифференцировке преадипоцитов в адипоциты (25) из-за, по крайней мере частично, регуляции транскрипции адипогенным фактором транскрипции C / EBPα (136).Эти находки предполагают функциональную роль TGH в зрелой жировой клетке, и действительно, Soni с коллегами (116) идентифицировали TGH как липазу адипоцитов, используя функциональную протеомику. В этом исследовании они подвергли инфранатант и фракции жировой лепешки, полученные из интраабдоминальной WAT мыши, хроматографии на агарозе, связанной с олеиновой кислотой. Один из двух основных пиков элюированной активности эстеразы содержал значительную активность липазы, и было обнаружено, что эта фракция также содержит TGH. Следовательно, вероятно, что TGH способствует липолизу жировой ткани.Однако для определения относительного вклада этой липазы в общую мобилизацию ЖК из ТАГ в адипоцитах потребуются дополнительные молекулярные и генетические исследования.
Используя поиск в базе данных сериновых эстераз альфа / бета-гидролазной складки, которые также содержат дипептидные мотивы G X S X G и His-Gly, Okazaki et al. (90) обнаружили ранее не аннотированный ген, который индуцируется в клетках 3T3-L1 во время дифференцировки в адипоциты. Этот белок имеет высокую степень гомологии последовательности с TGH (> 70%), а также аналогичную субклеточную локализацию, и поэтому был назван TGH-2.Также подобно TGH, TGH-2 проявляет активность в отношении моно- и три-, но не диолеина, со значительным предпочтением в отношении ТАГ короткоцепочечных жирных кислот. Было обнаружено, что TGH-2 преимущественно экспрессируется в печени, но также присутствует в жировой ткани и почках, индуцируется голоданием и ингибируется повторным кормлением. Молекулярные исследования с использованием миРНК, направленной против TGH-2 в адипоцитах 3T3-L1, продемонстрировали 10% -ное снижение стимулируемого изопротеренолом высвобождения глицерина, в то время как сверхэкспрессия TGH-2, как было обнаружено, увеличивала высвобождение глицерина на 20%.Необходимы дальнейшие исследования для определения относительного вклада этой новой липазы в базальный липолиз и активность липазы in vivo в жировой ткани. Однако эти результаты предполагают роль TGH-2 в мобилизации накопленного ТАГ во время повышенного спроса на энергию.
Адипонутрин
Адипонутрин представляет собой белок, содержащий домен пататина 45 кДа, который высоко экспрессируется, прежде всего, в жировой ткани (9). Он имеет высокую степень гомологии последовательности с деснутрином, включая позиционирование G X S X G и мотивов активного сайта DGG (9).Экстракты из клеток насекомых (53, 62) и млекопитающих (53, 62), трансфицированных адипонутрином, обладают функциональной активностью ТАГ-липазы, которая требует серина в активном центре (G X S X G-мотив) при анализе in vitro (62). Однако сверхэкспрессия адипонутрина не влияет на гидролиз ТАГ в клетках 293 НЕК, в отличие от деснутрина / ATGL и других белков, содержащих домен пататина, которые усиливают гидролиз ТАГ в этих клетках (62). Кроме того, в отличие от других известных липаз, экспрессия адипонутрина резко повышается у животных, которые были восстановлены после голодания, тогда как мРНК адипонутрина почти не обнаруживается у голодных животных (9).Хотя мРНК деснутрина / ATGL подавляется у крыс с ожирением (130), мРНК адипонутрина индуцируется в 50 раз (9). Эта дифференциальная регуляция адипонутрина по сравнению с другими липазами предполагает, что in vivo этот фермент может выполнять основную функцию, отличную от липолиза. In vitro было показано, что адипонутрин, очищенный из клеток насекомых, также обладает ацилтрансферазной активностью (53), что соответствует анаболической, а не катаболической роли в метаболизме адипоцитов. Очевидно, что необходима дополнительная работа для выяснения роли этого фермента, если таковая имеется, в липолизе адипоцитов.
GS2 и GS2-Like
GS2 был идентифицирован Jenkins et al. (53) в виде липазы ТАГ с доменом гомологии пататина, который включает комбинацию мотивов G / A X G XX G и G X S X G, которые консервативны в кальций-независимой фосфолипазе A 2 члена семьи. Анализ in vitro продемонстрировал активность триолеингидролазы в отношении GS2, которая превышает активность адипонутрина или деснутрина (53). Активность липазы GS2 впоследствии была подтверждена в кератиноцитах (35) и в клетках 293 HEK, сверхэкспрессирующих этот фермент (62).Сверхэкспрессия родственного белка GS2-Like в клетках HEK 293 также приводит к снижению накопления ТАГ, что предполагает функциональную роль обоих этих белков в липолизе in vivo (62). Транскрипты GS2 были идентифицированы только у людей (62). Относительный вклад GS2 и GS2-Like в липолиз в белой жировой ткани еще предстоит определить.
ГИДРОЛИЗ ДИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
Второй этап липолиза включает гидролиз DAG с образованием MAG и неэтерифицированной жирной кислоты.Эта реакция происходит со скоростью в 10-30 раз выше, чем гидролиз ТАГ, который является инициирующей и ограничивающей скорость стадией липолиза (40). На сегодняшний день единственной липазой DAG, идентифицированной в адипоцитах, является HSL.
Максимальная скорость гидролиза DAG HSL in vitro в 11 раз выше, чем у TAG (51). Как описано выше, исследования моделей мышей с дефицитом HSL подтвердили важность HSL для разрушения DAG. В то время как мыши, лишенные жирового HSL, могут достигать почти нормальной скорости гидролиза ТАГ, эти животные демонстрируют сильно ослабленную активность липазы DAG, и в результате DAG накапливается в жировых тканях (44).Сообщалось о подавлении активности ряда CoA-зависимых ацилтрансфераз у HSL-нулевых мышей, и считается, что это способствует поддержанию нормального веса перед лицом полного удаления этого важного липолитического фермента (144). Метаболическая судьба накопленного DAG в адипоцитах HSL-нулевых мышей еще предстоит определить. Высвобождение глицерина и жирных кислот было нормальным или даже повышенным у голодных HSL-нулевых мышей, что свидетельствует о полном распаде ТАГ (94). Нарушение реэтерификации DAG ацилтрансферазами может привести к нормализованному высвобождению ЖК, образующегося при гидролизе TAG.Однако высвобождение глицерина будет нарушено. Ни TGH, ни ATGL / деснутрин не проявляют значительной активности липазы DAG (90, 145). Таким образом, результаты, полученные на мышах с нулевым HSL, предполагают, что адипоциты могут нести дополнительные, менее активные липазы DAG, а также липазы TAG.
ГИДРОЛИЗ МОНОАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
Моноглицерид липаза (MGL) представляет собой гидролазу 33 кДа, очищенную в 2500 раз из жировой ткани крысы в 1975 году Tornqvist & Belfrage (129). В 1986 г. соответствующие роли HSL и MGL в гидролизе TAG были прояснены, когда было обнаружено, что изолированный HSL гидролизует ацилглицерин с накоплением MAG in vitro, тогда как высвобождение глицерина притупляется за счет селективного удаления MGL путем иммунопреципитации (31).
MGL гидролизует 1 (3) и 2-эфирные связи MAG с равной скоростью и не проявляет каталитической активности in vitro против DAG, TAG или сложных холстериловых эфиров (57). MGL содержит складку альфа / бета-гидролазы, характерную для известных липаз (57). Предполагается, что он состоит из 302 аминокислот (57). MGL относится к ряду микробных белков, включая эстеразы, лизофосфолипазы и галопероксидазы (58). В первичной последовательности были идентифицированы два мотива липазы: сериновый мотив активного центра G X S X G и дипептид HG (57).Каталитическая триада MGL образована Ser-122, Asp-239 и His-269. Было показано, что мутация любого из этих трех остатков полностью устраняет липазную и эстеразную активности MGL (57).
РОЛЬ БЕЛКОВ, СВЯЗАННЫХ С ЛИПИДНЫМИ КАПЛЯМИ, В ЛИПОЛИЗЕ
Перилипин является основным белком, обнаруживаемым в ассоциации с липидными каплями в адипоцитах (42). Анализ липидных капель из клеток яичника китайского хомячка (СНО) с помощью масс-спектрометрии выявил, помимо перилипина, более 40 структурных и сигнальных белков, а также ферменты, участвующие в синтезе, хранении и использовании липидов, что позволяет предположить, что липидная капля следует рассматривать скорее как метаболическую органеллу, чем как инертное хранилище (70).Липолиз требует, чтобы растворимые липазы получали доступ к высокогидрофобному субстрату ТАГ и чтобы гидрофобные продукты этой реакции были удалены. Известно, что ряд цитозольных, а также связанных с липидными каплями белков регулирует скорость базального и / или стимулированного липолиза.
Perilipin
Perilipin A и B представляют собой изоформы перилипина, которые возникают в результате дифференциального сплайсинга (41). Перилипин A является преобладающей изоформой, обнаруживаемой в зрелых адипоцитах, и он был одним из первых идентифицированных белков, ассоциированных с липидными каплями.Таким образом, он был тщательно изучен. Многие данные подтверждают сложную роль перилипиновых белков в регуляции как базального, так и стимулированного липолиза адипоцитов.
В нестимулированных условиях исследования фракционирования клеток и конфокальной микроскопии показывают, что деснутрин / ATGL (145) и значительная часть HSL (до 50% клеточных уровней) локализуются в липидной капле (84). Считается, что присутствие перилипинов А и В, покрывающих липидную каплю, действует как защитный барьер, ограничивающий доступ липаз ТАГ к нейтральным липидным субстратам, чтобы предотвратить неограниченный базальный липолиз (15).Эту идею подтверждают физиологические и метаболические эффекты удаления перилипина у мышей. У мышей без перилипина постоянно повышен базальный липолиз, что приводит к заметному снижению массы WAT и меньшему размеру адипоцитов (78, 106, 127). Мыши с нулевым перилипином также демонстрируют значительную устойчивость к ожирению, вызванному диетой (78, 106, 127), что объясняется, по крайней мере частично, повышенным бета-окислением жирных кислот, продуктов липолиза (106), что следует из компенсаторная индукция генов, участвующих в липидном и энергетическом метаболизме, и подавление генов, участвующих в биосинтезе липидов (20).Эктопическая экспрессия перилипина А, как и ожидалось, увеличивает запасы ТАГ за счет ингибирования гидролиза (15, 127). Преадипоциты 3T3-L1, трансфицированные перилипином A, хранили в 6–30 раз больше ТАГ, чем контрольные клетки 3T3-L1, в результате 5-кратного снижения скорости липолиза (15). Было обнаружено, что в клетках СНО перилипин А ингибирует гидролиз ТАГ на 87% в клетках, поддерживаемых в нестимулированных условиях (127). Хотя перилипин A явно ограничивает действие липаз ТАГ в базовых условиях, этот белок играет совершенно иную роль в стимулированном липолизе адипоцитов.
Удаление перилипина связано с почти максимальной скоростью липолиза в базовых условиях (78). Однако потеря функциональных белков перилипина также вызывает резкое ослабление стимулированной липолитической активности (78, 127). В качестве мишени для фосфорилирования, опосредованного протеинкиназой A (PKA; цАМФ-зависимая протеинкиназа), до шести сайтов (Ser-81, Ser-223, Ser-277, Ser-434, Ser-492 и Ser-517) перилипин A сильно регулируется липолитическими стимулами, которые действуют через путь бета-адренергический рецептор / аденилатциклаза (117, 125, 128, 140).Исследования на клетках CHO демонстрируют, что PKA-опосредованное фосфорилирование только перилипина A достаточно для увеличения липолиза (126). Напротив, мутация сайтов фосфорилирования перилипина А снижает вклад этого белка в стимулированный липолиз (84, 117). В адипоцитах присутствие белков перилипина в липидной капле, по-видимому, необходимо для PKA-опосредованной стимуляции транслокации HSL (84, 125). Хотя недавние данные показывают, что эти перилипины не должны фосфорилироваться, чтобы опосредовать транслокацию HSL из цитозоля на поверхность липидной капли, фосфорилирование, по-видимому, необходимо для достижения максимально стимулированного липолиза после активации PKA (84).PKA-зависимое фосфорилирование перилипина A может способствовать взаимодействию с HSL на липидной капле, тем самым увеличивая активность фермента (84). Совместная экспрессия перилипина A и HSL в клетках CHO приводит к кооперативному эффекту, который вызывает более быстро ускоренный липолиз после стимуляции PKA, чем это очевидно в клетках, которые экспрессируют один из белков (125).
Перилипин A может также влиять на липолиз, регулируя распределение и архитектуру липидных капель в адипоцитах.Хроническая стимуляция липолиза в адипоцитах 3T3-L1 приводит к тому, что большие перинуклеарные липидные капли фрагментируются на множество микролипидных капель, покрытых перилипином А (76). Этому диспергированию препятствует стабильная экспрессия перилипина А, который был мутирован для предотвращения фосфорилирования серина 492 (76). Активация перилипина А посредством PKA-опосредованного фосфорилирования может, таким образом, увеличивать липолиз за счет увеличения площади поверхности нейтральных липидных капель, доступных для атаки липазами (76, 85). Взятые вместе, эти исследования показывают, что экспрессия перилипина и состояние фосфорилирования являются критическими регуляторами липолиза в адипоцитах.В неадипоцитах связанный с перилипином белок, связанный с дифференцировкой адипоцитов, белок / адипофилин заменяет перилипин на поверхности капель хранения нейтральных липидов, хотя этот белок в значительной степени отсутствует в зрелых адипоцитах (13).
Белок, связывающий жирные кислоты жиров
Белок, связывающий жирные кислоты жиров (aFABP / ALBP / aP2), является членом цитозольных липидсвязывающих белков, которые несут как жирные кислоты, так и ретиноевую кислоту в адипоцитах (79). Максимальные скорости липолиза требуют удаления жирных кислот из адипоцита, чтобы предотвратить накопление продуктов реакции и ингибирование липаз с помощью обратной связи.Постулируется, что aFABP / ALBP / aP2 действует как молекулярный шаперон, облегчая перемещение жирных кислот из адипоцитов после их освобождения из клеточных запасов ТАГ липазами (22). Исследования абляции гена aFABP / ALBP / aP2 на мышах дают представление об относительной роли aFABP / ALBP / aP2 в липолизе. Сообщалось о снижении базального липолиза у мышей с aFABP / ALBP / aP2-нулевым по сравнению с однопометными мышами дикого типа (22, 49), а также было показано, что стимулированный липолиз в адипоцитах, выделенных от этих мышей, ослаблен (22, 110) .В соответствии со снижением скорости оттока жирных кислот, было обнаружено, что внутриклеточные уровни жирных кислот в три раза выше в адипоцитах из нулевых aFABP / ALBP / aP2 по сравнению с дикими типами (22). Однако другие не наблюдали разницы в базальной или стимулированной скорости липолиза в адипоцитах, выделенных из мышей, не обладающих aFABP / ALBP / aP2, по сравнению с однопометными мышами дикого типа (110). В этом исследовании наблюдалась компенсаторная индукция липид-связывающего белка кератиноцитов, которая, как сообщается, преодолевает функциональные эффекты потери адипоцит-специфичного aFABP / ALBP / aP2 (110).Внутриклеточные липид-связывающие белки могут быть важными регуляторами липолиза. Дальнейшие исследования необходимы для определения относительной роли этих белков в липолизе адипоцитов.
Caveolin-1
Кавеолы и кавеолярные белки участвуют в регуляции множества функций внутри клеток (23, 93, 103). Кавеолин-1 обнаруживается в особенно больших количествах в жировой ткани и сильно индуцируется во время дифференцировки фибробластов 3T3-L1 в зрелые адипоциты (107).Хотя кавеолин-1 обычно обнаруживается в кавеолах плазматических мембран, протеомный анализ показал, что в адипоцитах кавеолин-1 также локализуется в липидной капле (14, 23, 93, 103). Роль кавеолина-1 в липолизе была предложена в исследованиях мышей, не содержащих кавеолин-1. Эти животные заметно ослабили липолитическую активность в белой жировой ткани (23) и не смогли показать нормальное увеличение неэтерифицированных ЖК в сыворотке, которое ожидается при голодании, что позволяет предположить, что кавеолин-1 играет роль в активации липолиза (24).Мыши с нокаутом кавеолина-1 также не могут должным образом высвобождать жирные кислоты из запасов ТАГ в коричневой жировой ткани в ответ на голодание, что приводит к нарушению термогенеза (24). Регуляция передачи сигнала, опосредованной циклическим АМФ (цАМФ), может способствовать влиянию кавеолина-1 на липолиз (101). Было показано, что кавеолин-1 напрямую взаимодействует с каталитической субъединицей PKA для ингибирования цАМФ-зависимой передачи сигналов in vivo (101). Однако у мышей с нокаутом было показано, что, в то время как активность PKA значительно увеличивалась в отсутствие кавеолина-1, фосфорилирование перилипина резко снижалось (23).Активация β3-адренорецептора приводит к образованию лиганд-индуцированного комплекса между перилипином, кавеолином-1 и каталитической субъединицей PKA в адипоцитах (23). Следовательно, кавеолин-1 может способствовать PKA-опосредованному фосфорилированию перилипина, тем самым способствуя усилению стимуляции липолиза.
CGI-58
Мутации в CGI-58 (сравнительная идентификация гена 58), также известном как ABHD5 (белок 5, содержащий альфа / бета-гидролазный домен), оказались причиной редкого аутосомно-рецессивного заболевания, называемого чанарин. -Синдром Дорфмана (CDS) (67).CDS характеризуется чрезмерным накоплением ТАГ в клетках многих органов, а клинические проявления включают ихтиоз, катаракту, атаксию, нейросенсорную тугоухость и умственную отсталость (67). CGI-58 по структуре напоминает липазы; однако в нем отсутствует консервативный серин активного сайта, который был заменен аспарагином (66). В адипоцитах 3T3-L1 CGI-58 локализуется в липидной капле и, как было показано, напрямую взаимодействует (139) и колокализируется с перилипином A (121). Однако, когда клетки обрабатывают агентами, способствующими липолизу, они рассеиваются из липидной капли (121).Недавно Lass et al. (66) продемонстрировали, что CGI-58 стимулирует липолиз in vitro и является активатором ATGL, но не HSL. При добавлении к цитозольным экстрактам жировой ткани мыши CGI-58 стимулировал липолиз, тогда как очищенный CGI-58 не проявлял липазной активности in vitro. Кроме того, они показали, что мутантные формы CGI-58 не могут активировать ATGL. Хотя CGI-58, по-видимому, играет роль в липолизе, необходимы дополнительные исследования для выяснения молекулярного механизма его активации ATGL, а также его физиологической роли в живых организмах.
Другие белки, участвующие в гидролизе ТАГ
Аквапорин 7 — это белок, переносящий воду и глицерин, экспрессирующийся в плазматической мембране адипоцитов (46, 50, 75). У мышей с дефицитом аквапорина 7 нарушено высвобождение глицерина в ответ на голодание и лечение бета-адренергическими агонистами, хотя высвобождение ЖК из адипоцитов и уровни FFA в плазме сопоставимы с таковыми, наблюдаемыми у однопометников дикого типа (75). У этих животных развивается возрастное ожирение, вызванное индукцией глицеринкиназы и повышенным накоплением ТАГ (53).
Липотранзин был идентифицирован дрожжевым двугибридным скринингом библиотеки кДНК адипоцитов 3T3-L1 как белок, взаимодействующий с HSL (123). Считается, что он действует как стыковочный белок, который опосредует гормонально индуцированную транслокацию HSL из цитоплазмы в липидную каплю (123).
TIP47 — ассоциированный с липидными каплями белок семейства PAT с неизвестной функцией (36). TIP47 ингибирует гидролиз ретиниловых эфиров GS2 и HSL в кератиноцитах человека, предполагая, что в адипоцитах он может иметь аналогичную антилиполитическую функцию с другими белками семейства PAT, такими как перилипин или белок / адипофилин, связанный с дифференцировкой жировой ткани (36).
ПИТАТЕЛЬНАЯ РЕГУЛИРОВКА ЛИПОЛИЗА
Пищевая регуляция липолиза происходит на нескольких уровнях в ответ на изменение метаболических условий и потребления питательных веществ. Острая и быстрая регуляция липолиза жировой ткани происходит для поддержания поставок энергетических субстратов во время постабсорбционного состояния и для эффективного хранения избыточного топлива после еды. Хроническое воздействие экстремальных состояний питания, таких как ожирение или голодание, также вызывает метаболические адаптации, включая изменения липолиза.И, наконец, все больше данных указывает на то, что воздействие определенных метаболически активных питательных веществ в рационе также может регулировать липолиз.
СТИМУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИЗА ВО ВРЕМЯ ГОДА
Голодание резко стимулирует липолиз, повышая концентрацию в сыворотке крови жирных кислот и глицерина, которые действуют как окислительные субстраты для поддержания энергетических потребностей других метаболических тканей. Катехоламины являются основными активаторами липолиза, индуцированного натощак. Метаболические пути, посредством которых эти молекулы действуют, чтобы стимулировать гидролиз ТАГ и высвобождение ЖК, были тщательно изучены и подробно рассмотрены (6, 17, 18, 29, 63, 64 и ссылки, содержащиеся в них).Катехоламин норэпинефрин связывает бета-адренорецепторы на плазматической мембране адипоцитов. Эти рецепторы связаны с Gs-белками, которые передают стимулирующий сигнал аденилатциклазе для образования циклического АМФ (цАМФ). цАМФ связывает PKA, заставляя регуляторные субъединицы диссоциировать от каталитически активных субъединиц, что приводит к повышению активности фермента (60).
PKA катализирует полифосфорилирование HSL по нескольким сайтам, включая неактивирующий сайт (Ser-563), а также два дополнительных сайта (Ser-659 и Ser-660), которые вызывают активацию и последующую транслокацию этой липазы из цитозоля в липидная капля (4, 51, 120).Как обсуждалось выше, PKA также фосфорилирует перилипин на липидной капле, что приводит к изменениям, которые усиливают стимулированный липолиз, включая перемещение перилипина от липидной капли (21), перилипин-опосредованное ремоделирование липидных капель, что увеличивает площадь поверхности, доступную для липолитической атаки. (75) и перилипин-опосредованная активация активности HSL на поверхности липидной капли (84, 125). Результаты исследований на HSL-нулевых мышах предполагают, что липолиз, стимулированный катехоламинами, может также включать другие липазы ТАГ.Обработка адипоцитов, выделенных от HSL-нулевых мышей, бета-адренергическим агонистом изопротеренолом вызывает усиленный липолиз, хотя и на более низком уровне по сравнению с адипоцитами от животных дикого типа (91). Это предполагает, что некоторые или все недавно открытые ТАГ-липазы адипоцитов могут быть прямыми мишенями для PKA-опосредованного фосфорилирования и активации, и действительно, Zimmerman et al. (145) ранее показали, что деснутрин / ATGL фосфорилируется, хотя он не является мишенью для PKA. Это также предполагает, что PKA может косвенно активировать не-HSL-опосредованный липолиз TAG.Было показано, что одной экспрессии перилипина достаточно для обеспечения PKA-опосредованного липолиза в клетках CHO, в которых отсутствует HSL (126). Фосфорилирование перилипина с помощью PKA может приводить к изменениям, которые увеличивают активность липаз, связанных с множественными липидными каплями. Возможные механизмы включают содействие доступу растворимых липаз к гидрофобным субстратам, облегчение образования комплексов между липазами и белками, связанными с липолизом, и стабилизацию липаз на поверхности липидной капли.Необходимы дальнейшие исследования для выяснения природы PKA-опосредованного липолиза в отсутствие HSL.
Глюкагон стимулирует липолиз в изолированных адипоцитах мыши (48, 114) и человека (96), независимо от антагонистических эффектов на действие инсулина. Лечение глюкагоном вызывает повышение активности аденилатциклазы, что приводит к увеличению уровня цАМФ внутриклеточных адипоцитов (95, 96). Ингибирующий желудочный полипептид конкурирует с глюкагоном за связывание с рецептором глюкагона и может ингибировать стимулированный глюкагоном липолиз в адипоцитах, что указывает на то, что глюкагон опосредует липолиз, по крайней мере частично, через прямую активацию его рецептора (27).Хотя действие глюкагона в первую очередь специфично для печени, сообщалось, что рецепторы глюкагона присутствуют в мембранах жировой ткани человека (83), что позволяет предположить, что прямое действие глюкагона, вероятно, играет важную роль в регулировании липолиза человека, а также грызунов.
ИНГИБИРОВАНИЕ ЛИПОЛИЗА ВО ВРЕМЯ ПРАВИЛЫ
Повторное кормление ослабляет липолиз адипоцитов, в первую очередь за счет мощного антилиполитического действия инсулина. Этот регуляторный путь также был тщательно изучен и проанализирован (6, 17, 18, 29, 63 и ссылки, содержащиеся в них).Быстрая и острая регуляция липолиза инсулином включает как цАМФ-зависимые, так и цАМФ-независимые механизмы. ЦАМФ-зависимое подавление липолиза инсулином включает активацию фосфодиэстеразы 3B (63). Связывание инсулина вызывает аутофосфорилирование его рецептора, что приводит к активации и последующему фосфорилированию тирозина субстратов рецептора инсулина и связыванию регуляторной субъединицы p85 фосфатидилинозитолкиназы-3 (PI3K). Активированный PI3K аутофосфорилирует свое инозитоловое кольцо, регуляторную субъединицу p85 и каталитические субъединицы p110, за чем следует фосфорилирование и активация протеинкиназы B / Akt (PKB / Akt).PKB / Akt фосфорилирует и активирует фосфодиэстеразу 3B, которая расщепляет цАМФ в адипоцитах, высвобождая PKA из активации и уменьшая липолиз за счет снижения опосредованной фосфорилированием активации HSL и перилипина. ЦАМФ-независимая регуляция липолиза инсулином включает стимуляцию протеинфосфатазы-1 посредством фосфорилирования ее регуляторной субъединицы (100). Активированная протеинфосфатаза-1 быстро дефосфорилирует и деактивирует HSL, вызывая снижение скорости липолиза (73, 92, 100, 119, 143).
Инсулин также может подавлять липолиз в адипоцитах 3T3-L1 за счет подавления мРНК деснутрина / ATGL (59). Напротив, экспрессия мРНК HSL не регулируется краткосрочными изменениями нутритивного статуса (124). Помимо ингибирующего действия на ферменты при гидролизе ТАГ, инсулин также снижает измеримую скорость липолиза (на что указывает высвобождение свободных жирных кислот и глицерина из интактных клеток), способствуя повторной этерификации жирных кислот (16). Это служит для усиления очевидного подавления гидролиза ТАГ инсулином и физиологического эффекта гормона.
AMP-активированная протеинкиназа (AMPK) в качестве главного сенсора внутриклеточной энергии участвует в регуляции метаболизма глюкозы и липидов (33, 86). Активация AMPK в адипоцитах 5-аминоимидазол-4-карбоксиамид-1-бета-D-рибофуранозидом (AICAR) ингибирует липолиз (32, 33, 112). Инфузия AICAR тучным крысам Zucker, а также худым однопометникам снижает концентрацию ТАГ и ЖК в плазме, а также обмен глицерина (37), тогда как у мышей, лишенных субъединицы AMPK-alpha2, наблюдается повышенное ожирение и увеличение веса (98, 131 ).Однако другие обнаружили, что активация AMPK также может играть роль в стимуляции максимальной скорости липолиза с помощью цАМФ (86). Молекулярные события и мишени, лежащие в основе регуляции липолиза с помощью AMPK, еще предстоит понять.
ЛИПОЛИЗ ПРИ ОЖИРЕНИИ
Ожирение связано с увеличением базального липолиза (102), но снижением липолиза, стимулированного катехоламинами (65). Нарушение чувствительности адипоцитов к передаче сигналов инсулина, включая антилиполитические эффекты этого гормона, может способствовать усилению базального липолиза при ожирении.Сообщалось о снижении опосредованного инсулином подавления липолиза адипоцитов у крыс с ожирением (118), а также у женщин с висцеральным ожирением (3, 54), хотя в нескольких других исследованиях на людях сообщается, что антилиполитические эффекты инсулина хорошо сохраняются даже у субъекты с сильно нарушенной инсулино-опосредованной регуляцией глюкозы (7, 8, 11, 52). Как у страдающих ожирением, так и у пациентов, не страдающих ожирением, голодание и снижение веса вызывают значительное повышение чувствительности к антилиполитическим эффектам инсулина (7, 28, 71).
Избыточная экспрессия гена лептина в адипоцитах и повышенные уровни лептина в кровотоке также могут способствовать усилению базального липолиза при ожирении (74). Обработка адипоцитов, выделенных от худых мышей, лептином, стимулирует липолитическую активность (33). Обработка адипоцитов, выделенных от мышей ob / ob с ожирением и дефицитом лептина, приводит к еще большей стимуляции липолиза (33). Более того, хроническое (112) или острое (32) периферическое введение лептина также стимулирует гидролиз ТАГ жировой ткани у крыс, что приводит к увеличению скорости липолиза в 9–16 раз.Липолитическое действие лептина зависит от рецептора лептина, поскольку тучные крысы fa / fa Zucker (112) и мыши db / db (32), у которых есть инактивирующая мутация длинной формы рецептора лептина, устойчивы к лептину. -индуцированный липолиз. Повышенный уровень циркулирующего лептина может также усиливать липолиз, противодействуя антилиполитическим эффектам инсулина (86). Лептин ухудшает несколько метаболических эффектов инсулина, включая способность гормона ингибировать липолиз, опосредованный бета-адренорецепторами, и активацию PKA (86).
Липолиз, стимулируемый бета-адренорецепторами, нарушается при ожирении (65). Адипоциты субъектов с ожирением имеют более низкие уровни активности аденилатциклазы в условиях, стимулируемых гормонами, по сравнению с адипоцитами из контрольной группы, не страдающей ожирением (77). Этому эффекту могут способствовать изменения адренергических сигнальных путей. Ожирение связано со снижением липолитического эффекта катехоламинов в жировой ткани (65). Адипоциты крыс Zucker с ожирением имеют более высокий уровень антилиполитических α2-адренорецепторов по сравнению с адипоцитами тощих однопометников (19).Напротив, адипоциты мышей с ожирением экспрессируют в два раза более низкие уровни Gsα, субъединицы GTP-связывающего белка, через который бета-адренорецепторы стимулируют аденилатциклазу (38). Пострецепторные дефекты также могут способствовать нарушению гормонально-стимулированного липолиза. Было показано, что максимальная липолитическая способность снижается в адипоцитах, выделенных от субъектов с ожирением, по сравнению с адипоцитами от субъектов без ожирения после стимуляции устойчивым к фосфодиэстеразе аналогом цАМФ дибутирил цАМФ (65).Это открытие указывает на нарушение действия цАМФ ниже воздействия ожирения на передачу сигналов адренергических рецепторов, активацию аденилатциклазы, связанную с G-белком, или уровни цАМФ. HSL и перилипин A являются основными мишенями для цАМФ-зависимой активации PKA. Снижение уровней HSL (65) и перилипина (135) в жировой ткани у субъектов с ожирением может способствовать нарушению катехоламинового липолиза через пострецепторный дефект. Снижение веса у лиц с ожирением вызывает существенное повышение и нормализацию чувствительности к катехоламиновой стимуляции липолиза (77) без изменения количества β-адренорецепторов (102).
Продукция фактора некроза опухоли альфа (TNFα) увеличивается в адипоцитах у людей с ожирением и может способствовать усилению базального липолиза при ожирении (97, 104, 105). Этот цитокин сигнализирует аутокринным / паракринным образом через рецептор TNFα, чтобы активировать митоген-активируемые протеинкиназы p44 / 42 и JNK, которые, в свою очередь, подавляют мРНК перилипина и экспрессию белка (104, 105). Исследования специфических ингибиторов p44 / 42 и JNK подтверждают, что TNFα-опосредованное увеличение липолиза в значительной степени связано со снижением уровней перилипина в адипоцитах (104, 105), а более низкие уровни перилипина были обнаружены в жировой ткани у субъектов с ожирением. (135).
РЕГУЛИРОВАНИЕ ЛИПОЛИЗА АДИПОЦИТОВ ПИЩЕВЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
Кальций
Более высокое потребление кальция связано с уменьшением ожирения и снижением риска ожирения в различных эпидемиологических исследованиях (108 и ссылки в них). Кроме того, было показано, что добавление кальция способствует снижению веса у людей с ожирением, потребляющих калорийную диету (142), и у мышей с ожирением с ограничением калорий (111), а также, как сообщается, ингибирует восстановление веса во время возобновления кормления мышей (122 ).Считается, что усиленный липолиз способствует этим открытиям, и действительно, сообщалось, что острое потребление кальция значительно коррелирует с окислением жиров у людей (82). В нескольких исследованиях изучались молекулярные механизмы, лежащие в основе потенцирования липолиза адипоцитов пищевым кальцием. Увеличение пищевой кальциевой обратной связи подавляет секрецию паратироидного гормона (ПТГ) и, следовательно, активацию 25-гидроксихолекальциферола до 1,25-дигидроксикальциферола (витамин D 3 ; VD 3 ) (87).Адипоциты являются мишенями для действия этих гормонов (141). ПТГ стимулирует дозозависимое повышение уровня внутриклеточного кальция в адипоцитах, что связано как с увеличением притока, так и с мобилизацией внутриклеточных запасов (89). Также было показано, что VD 3 вызывает повышение уровня внутриклеточного кальция (111). Повышенный уровень внутриклеточного кальция в адипоцитах человека подавляет липолиз, стимулируемый путём β-адренорецепторов (111, 138), что приводит к снижению уровней цАМФ и снижению фосфорилирования HSL (138).Эти эффекты, по-видимому, опосредуются в первую очередь активацией фосфодиэстеразы 3B (138). Низкое потребление кальция с пищей и повышенный циркулирующий VD 3 также могут оказывать косвенное ингибирующее действие на липолиз адипоцитов, регулируя использование липолитических субстратов для энергетического метаболизма (111, 122). Обратное регулирование уровней внутриклеточного кальция в адипоцитах кальцитропными гормонами может способствовать влиянию пищевого кальция на ожирение.
Кофеин
Липолитические эффекты кофеина и других метилксантинов, полученных из чая и кофе, хорошо известны и хорошо изучены.Эти соединения стимулируют липолиз за счет увеличения клеточных уровней цАМФ посредством двух основных механизмов. Первый — антагонизм А1-аденозиновых рецепторов (72). Эти рецепторы преобладают на дифференцированных зрелых адипоцитах, где они ингибируют активность аденилатциклазы и подавляют липолиз (12). Антагонизм A1-рецепторов приводит к снижению активности аденилатциклазы и усилению липолиза (72). Метилксантины также подавляют активность фосфодиэстеразы, предотвращая распад цАМФ и стимулируя липолиз в жировых клетках (2, 95).Прием кофеина увеличивает обмен липидов (2) и концентрацию свободных жирных кислот в сыворотке крови (5, 61). Таким образом, высокое потребление метилксантинов может также способствовать снижению веса и поддержанию веса за счет усиленного окисления жиров и термогенеза (137).
Этанол
Острое употребление этанола оказывает антилиполитическое действие, которое вызывает значительное снижение содержания свободных жирных кислот в сыворотке (1) и снижение окисления липидов всего тела (113). Повышенный уровень ацетата в плазме может способствовать этому эффекту (1, 113).Сообщалось, что хроническое употребление этанола у крыс подавляет липолиз адипоцитов, опосредованный бета-адренорецепторами, вероятно, за счет повышенной активации фосфодиэстеразы 4 (56). Это привело к снижению активации PKA, стимулированной бета-адренорецепторами, и снижению активирующего фосфорилирования перилипина A и HSL (56). Сообщалось также, что хроническое потребление этанола связано со снижением секреции ПТГ, что также может способствовать усилению липолиза за счет снижения уровней внутриклеточного кальция в адипоцитах (81).
ОБЗОР И БУДУЩИЕ НАПРАВЛЕНИЯ
Липолиз адипоцитов — сложный процесс, который точно контролируется путем интеграции множества разнообразных гормональных и биохимических сигналов. Нарушение этой регуляции может способствовать развитию ожирения и связанных с ним патологий. В последнее время было сделано много захватывающих достижений, включая открытие основных липаз ТАГ, которые способствуют липолизу адипоцитов in vivo. Однако многое еще предстоит выяснить в отношении функционирования in vivo и относительного вклада этих липаз в общий липолиз адипоцитов.По мере создания генетических мышейных моделей этих ферментов наше понимание липолиза адипоцитов, вероятно, в ближайшем будущем резко улучшится.
КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ
Липолиз точно регулируется множеством гормональных и биохимических сигналов, которые сходятся на адипоцитах, чтобы регулировать функцию липаз и неферментативных дополнительных белков.
Гидролиз ТАГ ограничивает скорость липолиза и катализируется одной или несколькими новыми липазами, которые включают деснутрин / ATGL и TGH.
Основные регуляторы липолиза включают липолитические активаторы глюкагон и катехоламины, а также антилиполитический агент инсулин.
Диетические компоненты также могут регулировать липолиз. К ним относятся диетический кальций, этанол и кофеин.
БУДУЩИЕ ВОПРОСЫ
Создание мышей с дефицитом деснутрина / ATGL, особенно в жировой ткани, поможет выяснить роль этой липазы in vivo в липолизе жировой ткани.
Генетические мышиные модели, дефицитные по другим липазам ТАГ, также будут необходимы для определения их относительного вклада в липолиз.
Роль датчика энергии AMPK в обеспечении липолиза остается неясной. Для решения этой проблемы требуется дополнительная работа.
Было обнаружено, что некоторые диетические питательные вещества регулируют липолиз. Учитывая бремя хронических заболеваний, связанных с ожирением, открытие пищевых веществ, стимулирующих липолиз, будет представлять большой интерес.
Глоссарий
| WAT | белой жировой ткани |
| TAG | триацилглицерида |
| FA | жирных кислот |
| ДАГ | diacylglyceride |
| МАГ | моноацилглицерид |
| Липолиз | гидролиз ТАГ с образованием неэтерифицированных жирных кислот (ЖК) и глицерина, которые высвобождаются в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов |
| HSL | гормоночувствительная липаза |
| ATG | липаза триглицеридов жировой ткани |
| TGH | триацилглицеридгидролаза |
| MGL | моноглицерид липаза |
| PKA 9012P 154 904 904 904 904 904 протеин 904 CAMP теин киназа B | |
| PTH | паратироидный гормон |
| VD 3 | 1,25 (OH) 2 витамин D 3 |
Регулирование липолиза в адипоцитах
Annu Rev Nutr. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 15 июня.
Опубликован в окончательной отредактированной форме как:
PMCID: PMC2885771
NIHMSID: NIHMS211108
Департамент диетологии и токсикологии Калифорнийского университета, Беркли, Калифорния, окончательная редакция 94720
Версия этой статьи доступна на Annu Rev Nutr См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.Abstract
Липолиз триацилглицериновых запасов белой жировой ткани приводит к высвобождению глицерина и неэтерифицированных жирных кислот, которые попадают в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов. В ответ на изменения состояния питания скорость липолиза точно регулируется с помощью гормональных и биохимических сигналов. Эти сигналы модулируют активность липолитических ферментов и дополнительных белков, обеспечивая максимальную чувствительность жировой ткани к изменениям потребности в энергии и ее доступности.Недавно был идентифицирован ряд новых триацилглицеридных липаз адипоцитов, включая деснутрин / ATGL, что значительно расширило наши представления о липолизе адипоцитов. Мы также начали лучше понимать роль ряда неферментативных белков, которые имеют решающее значение для распада триацилглицеридов. В этом обзоре представлен обзор основных медиаторов липолиза и регуляции этого процесса путем изменения статуса питания и потребления питательных веществ.
Ключевые слова: адипоцит, липолиз, триацилглицерид липаза, перилипин, деснутрин / ATGL, гормоночувствительная липаза
ВВЕДЕНИЕ
Триацилглицерин (ТАГ) белой жировой ткани (WAT) является основным запасом энергии в высших эукариотах.Этот пул липидов находится в постоянном движении, что является результатом в значительной степени бесполезного цикла липолиза и повторной этерификации (55). Во время дефицита энергии WAT претерпевает сдвиг в сторону более высоких чистых скоростей липолиза, который можно определить как гидролиз TAG с образованием жирных кислот (ЖК) и глицерина, которые высвобождаются в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов. Липолиз протекает упорядоченно и регулируемым образом, при этом на каждом этапе действуют разные ферменты. ТАГ гидролизуется последовательно с образованием диацилглицерина (ДАГ), затем моноацилглицерина (МАГ) с высвобождением ЖК на каждой стадии.MAG гидролизуется с высвобождением окончательной ЖК и глицерина. Хранение запасов энергии в виде ТАГ и способность быстро мобилизовать эти резервы в виде ЖК для удовлетворения потребностей в энергии представляет собой высоко адаптированный метаболический ответ. Высвобождение ЖК из ТАГ путем липолиза адипоцитов также важно для обеспечения субстратом печеночного синтеза липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Циркулирующие ЖК являются основным источником субстрата для производства печенью липопротеинов, богатых ТАГ (34, 80), а нарушение липолиза жировой ткани подавляет синтез ЛПОНП (44, 94, 134).
Изменения липолиза часто связаны с ожирением, включая увеличение базальной скорости липолиза, что может способствовать развитию инсулинорезистентности, а также нарушение реакции на стимулированный липолиз (65, 102). Ожирение характеризуется, прежде всего, избытком WAT и увеличением размера адипоцитов в результате увеличения накопления TAG. Ожирение стало распространенной проблемой для здоровья из-за его тесной связи с рядом заболеваний, включая диабет 2 типа, гипертонию и атеросклероз (133).Здесь мы рассмотрим липолиз адипоцитов и основные факторы питания, контролирующие этот процесс. дает обзор нутритивной регуляции липолиза адипоцитов.
Регуляция липолиза адипоцитов.
ГИДРОЛИЗ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
До недавнего времени считалось, что инициация гидролиза ТАГ в жировой ткани контролируется гормоночувствительной липазой (HSL) (109). Однако создание HSL-нулевых моделей мышей ясно продемонстрировало существование остаточной HSL-независимой активности ТАГ-липазы, что позволяет предположить наличие ранее не идентифицированного фермента (ов) адипоцитов с ТАГ-гидролазной активностью (44, 94, 134).В последние годы были идентифицированы и охарактеризованы новые липазы жировой ткани. Все они представляют собой сериновые эстеразы, содержащие общий структурный элемент — альфа / бета-гидролазную складку — и консервативную каталитическую диаду или триаду, состоящую из пентапептидного мотива G X S X G, а также активного аспартата или глутамата. (D / E) трипептид GG и активный гистидин (H). Исследования по определению относительного вклада каждого фермента в липолиз адипоцитов продолжаются.
Гормоночувствительная липаза
Жировая ткань HSL (E.C. 3.1.1.3) представляет собой цитоплазматический белок 84 кДа с продемонстрированной активностью против широкого спектра субстратов, включая ТАГ, ДАГ, сложные эфиры холестерина (ХЭ) и сложные эфиры ретинила (51). Относительная активность жирной ацилгидролазы HSL in vitro в одиннадцать раз выше по сравнению с DAG, чем по TAG, и в два раза выше по отношению к CE (51). HSL проявляет предпочтение в отношении активности против жирных кислот в положении sn-1 или sn-3 (99). До недавнего времени считалось, что HSL является основным ферментом, ответственным практически за всю активность гидролаз ТАГ и ДАГ в адипоцитах, а также за активность гидролазы нейтрального холестерилового эфира (NCEH).Чтобы выяснить функциональную роль HSL in vivo, несколько лабораторий создали модели мышей с нулевым HSL (44, 94, 134). Хотя между этими моделями наблюдались различия, многое было сделано в отношении относительного вклада HSL в гидролиз TAG адипоцитов. Например, исследования показали, что, хотя активность NCEH действительно отсутствовала в HSL-нулевых адипоцитах, значительная часть катехоламинов стимулировала липолиз (90, 94), и большая часть, если не весь, базальный липолиз сохранялась (30, 134).Более того, липолитический ответ на длительное голодание (> 48 ч) оказался нормальным у HSL-нулевых мышей, которые продемонстрировали адекватную или даже повышенную мобилизацию и окисление ЖК (30). Однако HSL-опосредованный липолиз действительно вносит важный вклад в высвобождение жирных ЖК. HSL-нулевые мыши демонстрировали более низкие уровни NEFA и TAG в сыворотке и сниженное накопление TAG в печени, что указывает на то, что HSL-независимый липолиз был недостаточным для поддержания выхода ЖК из жировой ткани на уровнях, которые могли бы удовлетворить нормальные потребности в энергетических субстратах и синтезе VLDL (45, 132) .
Изучение физиологии HSL-нулевых мышей предлагает дополнительное понимание относительной важности HSL в гидролизе ТАГ in vivo. На нормальной диете HSL-нулевые мыши имели массу тела, аналогичную мышам дикого типа (47), а размер адипоцитов, как сообщается, был либо аналогичным, либо немного большим (94) — открытие, которое согласуется с ролью HSL в ЖК адипоцитов. мобилизация. Однако масса WAT у этих животных либо не изменилась (94), либо уменьшилась в размерах (134). Кроме того, при диете с высоким содержанием жиров аблация HSL была связана со значительным защитным эффектом против развития ожирения (47).Этот результат был неожиданным, но его можно объяснить тем фактом, что в отсутствие HSL адипоциты претерпевают компенсаторное снижение повторной этерификации ЖК, что приводит к снижению ресинтеза ТАГ и увеличению высвобождения ЖК в сосудистой сети (144). Хотя этот компенсаторный ответ мог затруднить измерение истинного вклада HSL в мобилизацию жирных кислот жировой ткани, из ряда исследований ясно, что HSL не требуется строго для инициации гидролиза ТАГ.Этот факт становится еще более очевидным, когда обнаруживается, что DAG, но не TAG, накапливается в адипоцитах HSL-нулевых мышей (44). Относительный вклад HSL в липолиз DAG обсуждается ниже.
Деснутрин / жировая триглицерид-липаза
В 2004 году, используя микроматрицу крысиного кДНК-анализа адипоцит-специфических генов, мы идентифицировали и охарактеризовали новую адипоцитную ТАГ липазу, которую мы назвали деснутрин (130). Деснутрин представляет собой белок 54 кДа, который содержит N-концевой пататин-подобный домен, который обнаружен во многих ацилгидролазах растений и характеризуется консервативным серином в мотиве G X S X G, альфа / бета-гидролазе fold, консервативный аспартат, принадлежащий мотиву D X (G / A), и богатую глицином область (130).Этот же фермент впоследствии был идентифицирован двумя другими лабораториями в результате поиска в базе данных белков, содержащих консервативный пентапептидный мотив G X S X G и альфа / бета-гидролазную складку, и был назван липазой триглицерида жиров (ATGL) (145) или iPLA2ζ (53, 145). Мышиный деснутрин / ATGL обнаруживается преимущественно в жировой ткани, но он также обнаруживается на гораздо более низких уровнях в других тканях, особенно в сердечных и скелетных мышцах и семенниках. Когда клетки содержат жировые запасы, такие как дифференцированные клетки 3T3-L1 (145), а также клетки HeLa, выращенные в среде, богатой олеиновой кислотой (115), деснутрин / ATGL обнаруживается как в цитоплазме, так и тесно связан с липидной каплей (115). , 130, 145).Было обнаружено, что в клетках COS-7, в которых отсутствуют значительные липидные капли, деснутрин / ATGL относительно однородно распределен в цитоплазме (130). Факторы, управляющие субклеточным распределением деснутрина / ATGL, включая механизмы, с помощью которых цитоплазматический фермент получает доступ к своему субстрату и потенциальную транслокацию в липидную каплю, еще предстоит определить.
Несколько линий доказательств указывают на то, что деснутрин / ATGL является TAG-специфической липазой. Мы показали, что сверхэкспрессия деснутрина / ATGL в клетках COS-7 увеличивает высвобождение FFA в среду, уменьшая внутриклеточные запасы TAG, не влияя на внутриклеточные запасы фосфолипидов (130).О подобном влиянии на уровень ТАГ также сообщалось в клетках 293HEK (62), тогда как было показано, что экспрессия деснутрина / ATGL в адипоцитах 3T3-L1 увеличивает высвобождение как глицерина, так и ЖК (144). In vitro гидролазная активность ТАГ была продемонстрирована для фермента, очищенного путем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и клетках 293HEK, а также в клетках COS-7 (53, 130, 145). Специфичность деснутрина / ATGL в отношении ТАГ также была исследована. Циммерманн и др. (144) получали цитозольные экстракты из клеток HepG2, инфицированных аденовирусным деснутрином / ATGL, и инкубировали их с радиоактивно меченными триолеином и диолеиновыми субстратами.Они обнаружили значительно более высокую активность липазы ТАГ (примерно в шесть-десять раз выше), чем активность липазы ДАГ, что указывает на первичную роль фермента в катализе первой, лимитирующей стадии стадии липолиза. Этот вывод был подтвержден работой с клетками COS-7, демонстрирующей 21-кратное увеличение накопления DAG в клетках, трансфицированных деснутрином / ATGL, по сравнению с HSL, а также умеренное увеличение уровней MAG (144). Экстракты из клеток COS-7, временно экспрессирующих деснутрин / ATGL, обладали активностью против сложных эфиров холестерина и сложных эфиров ретинила, которая была сопоставима с контрольными значениями (144), что дополнительно демонстрирует специфическую роль деснутрина / ATGL в гидролизе TAG.
Пищевая регуляция деснутрина / ATGL дополнительно подтверждает роль этого фермента в мобилизации запасов ТАГ в ответ на повышенную потребность в энергии. Мы показали, что деснутрин / ATGL индуцируется голоданием у мышей и подавляется повторным кормлением (130). Регулирование мРНК деснутрина / ATGL глюкокортикоидами может объяснить это, поскольку было обнаружено, что дексаметазон сильно повышает регуляцию фермента в зависимости от концентрации и дозы в преадипоцитах 3T3-L1 (130). Мы также обнаружили, что дезнутрин / ATGL подавляется у мышей ob / ob и db / db, что дополнительно подтверждает роль фермента в расщеплении жира и предполагает возможную роль в развитии ожирения (130).
Относительная важность деснутрина / ATGL в липолизе проиллюстрирована исследованиями абляции гена и функциональной потери фермента. Было показано, что миРНК, направленная против деснутрина / ATGL, значительно снижает высвобождение глицерина и ЖК из адипоцитов 3T3-L1 (144), что указывает на нарушение липолиза, который не компенсируется присутствием других липаз. В подтверждение этого, обработка цитозольных экстрактов мышиных WAT и BAT антителами деснутрина / ATGL снижала высвобождение ЖК примерно на две трети (144).Это снижение было более выраженным, когда использовались адипоциты от HSL-нулевых мышей, открытие, которое предполагает наличие кооперативности между двумя ферментами, и действительно, наблюдается синергетический эффект на липолиз, когда клетки котрансфицируют как деснутрином / ATGL, так и HSL (144). ). Следовательно, для достижения оптимальных скоростей липолиза, вероятно, требуется экспрессия обеих ацилгидролаз. Глобальная потеря функции гена деснутрина / ATGL у мышей привела к увеличению веса и сдвигу в пользу углеводов вместо жира в качестве основного источника топлива во время голодания, указывая на то, что in vivo деснутрин / ATGL, вероятно, также участвует в липолизе жировой ткани (43).Однако неожиданно вес жировых подушечек WAT был увеличен только примерно в два раза, что позволяет предположить, что могут присутствовать другие липазы TAG, которые могут частично компенсировать потерю деснутрина / ATGL. Также удивительным было открытие, что потеря деснутрина / ATGL была связана с преждевременной смертью. Это произошло в результате эктопического накопления жира в сердце, где уровни ТАГ кардиомиоцитов увеличились в двадцать раз к 12-недельному возрасту. Внематочное накопление жира также было очевидным в других тканях. Этот эффект наблюдался, несмотря на более благоприятный липидный профиль плазмы и повышенную чувствительность к инсулину.Общая активность липазы была резко снижена в нескольких тканях, включая WAT и BAT, а также сердечную мышцу, скелетную мышцу, яички и печень. Это открытие подчеркивает потенциальную метаболическую важность внутриклеточного гидролиза ТАГ в тканях, отличных от жировой ткани, и указывает на то, что деснутрин / ATGL может играть решающую роль в высвобождении ЖК во многих тканях. Для проверки этой гипотезы потребуется создание моделей условного нокаута, лишенных деснутрина / ATGL в отдельных тканях.
Триацилглицерингидролазы
Soni et al. (116) были первой группой, которая сообщила об открытии новой липазы ТАГ, которая может способствовать не-HSL-опосредованному липолизу ТАГ в адипоцитах. Другие впоследствии подтвердили присутствие триацилглицерин гидролазы (TGH; карбоксилэстераза 3; EC 3.1.1.1) в жировой ткани (10). TGH представляет собой микросомальную липазу 60 кДа, которая содержит каталитическую триаду с серином активного центра, расположенным в G-мотиве G X S X (68). TGH проявляет активность против длинно-, средне- и короткоцепочечных TAG, а также, как сообщается, гидролизует нейтральные сложные эфиры холестерина (88), но ему не хватает активности фосфолипазы или ацил-CoA тиоэстеразы (69).Фермент экспрессируется преимущественно в печени, где он участвует в мобилизации внутриклеточных запасов ТАГ и, вероятно, играет решающую роль в синтезе богатых ТАГ липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) (39).
Однако недавно TGH был идентифицирован и в других тканях, включая почки, сердце, кишечник и жировую ткань (26). В клетках 3T3-L1 экспрессия TGH повышается в десять раз при дифференцировке преадипоцитов в адипоциты (25) из-за, по крайней мере частично, регуляции транскрипции адипогенным фактором транскрипции C / EBPα (136).Эти находки предполагают функциональную роль TGH в зрелой жировой клетке, и действительно, Soni с коллегами (116) идентифицировали TGH как липазу адипоцитов, используя функциональную протеомику. В этом исследовании они подвергли инфранатант и фракции жировой лепешки, полученные из интраабдоминальной WAT мыши, хроматографии на агарозе, связанной с олеиновой кислотой. Один из двух основных пиков элюированной активности эстеразы содержал значительную активность липазы, и было обнаружено, что эта фракция также содержит TGH. Следовательно, вероятно, что TGH способствует липолизу жировой ткани.Однако для определения относительного вклада этой липазы в общую мобилизацию ЖК из ТАГ в адипоцитах потребуются дополнительные молекулярные и генетические исследования.
Используя поиск в базе данных сериновых эстераз альфа / бета-гидролазной складки, которые также содержат дипептидные мотивы G X S X G и His-Gly, Okazaki et al. (90) обнаружили ранее не аннотированный ген, который индуцируется в клетках 3T3-L1 во время дифференцировки в адипоциты. Этот белок имеет высокую степень гомологии последовательности с TGH (> 70%), а также аналогичную субклеточную локализацию, и поэтому был назван TGH-2.Также подобно TGH, TGH-2 проявляет активность в отношении моно- и три-, но не диолеина, со значительным предпочтением в отношении ТАГ короткоцепочечных жирных кислот. Было обнаружено, что TGH-2 преимущественно экспрессируется в печени, но также присутствует в жировой ткани и почках, индуцируется голоданием и ингибируется повторным кормлением. Молекулярные исследования с использованием миРНК, направленной против TGH-2 в адипоцитах 3T3-L1, продемонстрировали 10% -ное снижение стимулируемого изопротеренолом высвобождения глицерина, в то время как сверхэкспрессия TGH-2, как было обнаружено, увеличивала высвобождение глицерина на 20%.Необходимы дальнейшие исследования для определения относительного вклада этой новой липазы в базальный липолиз и активность липазы in vivo в жировой ткани. Однако эти результаты предполагают роль TGH-2 в мобилизации накопленного ТАГ во время повышенного спроса на энергию.
Адипонутрин
Адипонутрин представляет собой белок, содержащий домен пататина 45 кДа, который высоко экспрессируется, прежде всего, в жировой ткани (9). Он имеет высокую степень гомологии последовательности с деснутрином, включая позиционирование G X S X G и мотивов активного сайта DGG (9).Экстракты из клеток насекомых (53, 62) и млекопитающих (53, 62), трансфицированных адипонутрином, обладают функциональной активностью ТАГ-липазы, которая требует серина в активном центре (G X S X G-мотив) при анализе in vitro (62). Однако сверхэкспрессия адипонутрина не влияет на гидролиз ТАГ в клетках 293 НЕК, в отличие от деснутрина / ATGL и других белков, содержащих домен пататина, которые усиливают гидролиз ТАГ в этих клетках (62). Кроме того, в отличие от других известных липаз, экспрессия адипонутрина резко повышается у животных, которые были восстановлены после голодания, тогда как мРНК адипонутрина почти не обнаруживается у голодных животных (9).Хотя мРНК деснутрина / ATGL подавляется у крыс с ожирением (130), мРНК адипонутрина индуцируется в 50 раз (9). Эта дифференциальная регуляция адипонутрина по сравнению с другими липазами предполагает, что in vivo этот фермент может выполнять основную функцию, отличную от липолиза. In vitro было показано, что адипонутрин, очищенный из клеток насекомых, также обладает ацилтрансферазной активностью (53), что соответствует анаболической, а не катаболической роли в метаболизме адипоцитов. Очевидно, что необходима дополнительная работа для выяснения роли этого фермента, если таковая имеется, в липолизе адипоцитов.
GS2 и GS2-Like
GS2 был идентифицирован Jenkins et al. (53) в виде липазы ТАГ с доменом гомологии пататина, который включает комбинацию мотивов G / A X G XX G и G X S X G, которые консервативны в кальций-независимой фосфолипазе A 2 члена семьи. Анализ in vitro продемонстрировал активность триолеингидролазы в отношении GS2, которая превышает активность адипонутрина или деснутрина (53). Активность липазы GS2 впоследствии была подтверждена в кератиноцитах (35) и в клетках 293 HEK, сверхэкспрессирующих этот фермент (62).Сверхэкспрессия родственного белка GS2-Like в клетках HEK 293 также приводит к снижению накопления ТАГ, что предполагает функциональную роль обоих этих белков в липолизе in vivo (62). Транскрипты GS2 были идентифицированы только у людей (62). Относительный вклад GS2 и GS2-Like в липолиз в белой жировой ткани еще предстоит определить.
ГИДРОЛИЗ ДИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
Второй этап липолиза включает гидролиз DAG с образованием MAG и неэтерифицированной жирной кислоты.Эта реакция происходит со скоростью в 10-30 раз выше, чем гидролиз ТАГ, который является инициирующей и ограничивающей скорость стадией липолиза (40). На сегодняшний день единственной липазой DAG, идентифицированной в адипоцитах, является HSL.
Максимальная скорость гидролиза DAG HSL in vitro в 11 раз выше, чем у TAG (51). Как описано выше, исследования моделей мышей с дефицитом HSL подтвердили важность HSL для разрушения DAG. В то время как мыши, лишенные жирового HSL, могут достигать почти нормальной скорости гидролиза ТАГ, эти животные демонстрируют сильно ослабленную активность липазы DAG, и в результате DAG накапливается в жировых тканях (44).Сообщалось о подавлении активности ряда CoA-зависимых ацилтрансфераз у HSL-нулевых мышей, и считается, что это способствует поддержанию нормального веса перед лицом полного удаления этого важного липолитического фермента (144). Метаболическая судьба накопленного DAG в адипоцитах HSL-нулевых мышей еще предстоит определить. Высвобождение глицерина и жирных кислот было нормальным или даже повышенным у голодных HSL-нулевых мышей, что свидетельствует о полном распаде ТАГ (94). Нарушение реэтерификации DAG ацилтрансферазами может привести к нормализованному высвобождению ЖК, образующегося при гидролизе TAG.Однако высвобождение глицерина будет нарушено. Ни TGH, ни ATGL / деснутрин не проявляют значительной активности липазы DAG (90, 145). Таким образом, результаты, полученные на мышах с нулевым HSL, предполагают, что адипоциты могут нести дополнительные, менее активные липазы DAG, а также липазы TAG.
ГИДРОЛИЗ МОНОАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
Моноглицерид липаза (MGL) представляет собой гидролазу 33 кДа, очищенную в 2500 раз из жировой ткани крысы в 1975 году Tornqvist & Belfrage (129). В 1986 г. соответствующие роли HSL и MGL в гидролизе TAG были прояснены, когда было обнаружено, что изолированный HSL гидролизует ацилглицерин с накоплением MAG in vitro, тогда как высвобождение глицерина притупляется за счет селективного удаления MGL путем иммунопреципитации (31).
MGL гидролизует 1 (3) и 2-эфирные связи MAG с равной скоростью и не проявляет каталитической активности in vitro против DAG, TAG или сложных холстериловых эфиров (57). MGL содержит складку альфа / бета-гидролазы, характерную для известных липаз (57). Предполагается, что он состоит из 302 аминокислот (57). MGL относится к ряду микробных белков, включая эстеразы, лизофосфолипазы и галопероксидазы (58). В первичной последовательности были идентифицированы два мотива липазы: сериновый мотив активного центра G X S X G и дипептид HG (57).Каталитическая триада MGL образована Ser-122, Asp-239 и His-269. Было показано, что мутация любого из этих трех остатков полностью устраняет липазную и эстеразную активности MGL (57).
РОЛЬ БЕЛКОВ, СВЯЗАННЫХ С ЛИПИДНЫМИ КАПЛЯМИ, В ЛИПОЛИЗЕ
Перилипин является основным белком, обнаруживаемым в ассоциации с липидными каплями в адипоцитах (42). Анализ липидных капель из клеток яичника китайского хомячка (СНО) с помощью масс-спектрометрии выявил, помимо перилипина, более 40 структурных и сигнальных белков, а также ферменты, участвующие в синтезе, хранении и использовании липидов, что позволяет предположить, что липидная капля следует рассматривать скорее как метаболическую органеллу, чем как инертное хранилище (70).Липолиз требует, чтобы растворимые липазы получали доступ к высокогидрофобному субстрату ТАГ и чтобы гидрофобные продукты этой реакции были удалены. Известно, что ряд цитозольных, а также связанных с липидными каплями белков регулирует скорость базального и / или стимулированного липолиза.
Perilipin
Perilipin A и B представляют собой изоформы перилипина, которые возникают в результате дифференциального сплайсинга (41). Перилипин A является преобладающей изоформой, обнаруживаемой в зрелых адипоцитах, и он был одним из первых идентифицированных белков, ассоциированных с липидными каплями.Таким образом, он был тщательно изучен. Многие данные подтверждают сложную роль перилипиновых белков в регуляции как базального, так и стимулированного липолиза адипоцитов.
В нестимулированных условиях исследования фракционирования клеток и конфокальной микроскопии показывают, что деснутрин / ATGL (145) и значительная часть HSL (до 50% клеточных уровней) локализуются в липидной капле (84). Считается, что присутствие перилипинов А и В, покрывающих липидную каплю, действует как защитный барьер, ограничивающий доступ липаз ТАГ к нейтральным липидным субстратам, чтобы предотвратить неограниченный базальный липолиз (15).Эту идею подтверждают физиологические и метаболические эффекты удаления перилипина у мышей. У мышей без перилипина постоянно повышен базальный липолиз, что приводит к заметному снижению массы WAT и меньшему размеру адипоцитов (78, 106, 127). Мыши с нулевым перилипином также демонстрируют значительную устойчивость к ожирению, вызванному диетой (78, 106, 127), что объясняется, по крайней мере частично, повышенным бета-окислением жирных кислот, продуктов липолиза (106), что следует из компенсаторная индукция генов, участвующих в липидном и энергетическом метаболизме, и подавление генов, участвующих в биосинтезе липидов (20).Эктопическая экспрессия перилипина А, как и ожидалось, увеличивает запасы ТАГ за счет ингибирования гидролиза (15, 127). Преадипоциты 3T3-L1, трансфицированные перилипином A, хранили в 6–30 раз больше ТАГ, чем контрольные клетки 3T3-L1, в результате 5-кратного снижения скорости липолиза (15). Было обнаружено, что в клетках СНО перилипин А ингибирует гидролиз ТАГ на 87% в клетках, поддерживаемых в нестимулированных условиях (127). Хотя перилипин A явно ограничивает действие липаз ТАГ в базовых условиях, этот белок играет совершенно иную роль в стимулированном липолизе адипоцитов.
Удаление перилипина связано с почти максимальной скоростью липолиза в базовых условиях (78). Однако потеря функциональных белков перилипина также вызывает резкое ослабление стимулированной липолитической активности (78, 127). В качестве мишени для фосфорилирования, опосредованного протеинкиназой A (PKA; цАМФ-зависимая протеинкиназа), до шести сайтов (Ser-81, Ser-223, Ser-277, Ser-434, Ser-492 и Ser-517) перилипин A сильно регулируется липолитическими стимулами, которые действуют через путь бета-адренергический рецептор / аденилатциклаза (117, 125, 128, 140).Исследования на клетках CHO демонстрируют, что PKA-опосредованное фосфорилирование только перилипина A достаточно для увеличения липолиза (126). Напротив, мутация сайтов фосфорилирования перилипина А снижает вклад этого белка в стимулированный липолиз (84, 117). В адипоцитах присутствие белков перилипина в липидной капле, по-видимому, необходимо для PKA-опосредованной стимуляции транслокации HSL (84, 125). Хотя недавние данные показывают, что эти перилипины не должны фосфорилироваться, чтобы опосредовать транслокацию HSL из цитозоля на поверхность липидной капли, фосфорилирование, по-видимому, необходимо для достижения максимально стимулированного липолиза после активации PKA (84).PKA-зависимое фосфорилирование перилипина A может способствовать взаимодействию с HSL на липидной капле, тем самым увеличивая активность фермента (84). Совместная экспрессия перилипина A и HSL в клетках CHO приводит к кооперативному эффекту, который вызывает более быстро ускоренный липолиз после стимуляции PKA, чем это очевидно в клетках, которые экспрессируют один из белков (125).
Перилипин A может также влиять на липолиз, регулируя распределение и архитектуру липидных капель в адипоцитах.Хроническая стимуляция липолиза в адипоцитах 3T3-L1 приводит к тому, что большие перинуклеарные липидные капли фрагментируются на множество микролипидных капель, покрытых перилипином А (76). Этому диспергированию препятствует стабильная экспрессия перилипина А, который был мутирован для предотвращения фосфорилирования серина 492 (76). Активация перилипина А посредством PKA-опосредованного фосфорилирования может, таким образом, увеличивать липолиз за счет увеличения площади поверхности нейтральных липидных капель, доступных для атаки липазами (76, 85). Взятые вместе, эти исследования показывают, что экспрессия перилипина и состояние фосфорилирования являются критическими регуляторами липолиза в адипоцитах.В неадипоцитах связанный с перилипином белок, связанный с дифференцировкой адипоцитов, белок / адипофилин заменяет перилипин на поверхности капель хранения нейтральных липидов, хотя этот белок в значительной степени отсутствует в зрелых адипоцитах (13).
Белок, связывающий жирные кислоты жиров
Белок, связывающий жирные кислоты жиров (aFABP / ALBP / aP2), является членом цитозольных липидсвязывающих белков, которые несут как жирные кислоты, так и ретиноевую кислоту в адипоцитах (79). Максимальные скорости липолиза требуют удаления жирных кислот из адипоцита, чтобы предотвратить накопление продуктов реакции и ингибирование липаз с помощью обратной связи.Постулируется, что aFABP / ALBP / aP2 действует как молекулярный шаперон, облегчая перемещение жирных кислот из адипоцитов после их освобождения из клеточных запасов ТАГ липазами (22). Исследования абляции гена aFABP / ALBP / aP2 на мышах дают представление об относительной роли aFABP / ALBP / aP2 в липолизе. Сообщалось о снижении базального липолиза у мышей с aFABP / ALBP / aP2-нулевым по сравнению с однопометными мышами дикого типа (22, 49), а также было показано, что стимулированный липолиз в адипоцитах, выделенных от этих мышей, ослаблен (22, 110) .В соответствии со снижением скорости оттока жирных кислот, было обнаружено, что внутриклеточные уровни жирных кислот в три раза выше в адипоцитах из нулевых aFABP / ALBP / aP2 по сравнению с дикими типами (22). Однако другие не наблюдали разницы в базальной или стимулированной скорости липолиза в адипоцитах, выделенных из мышей, не обладающих aFABP / ALBP / aP2, по сравнению с однопометными мышами дикого типа (110). В этом исследовании наблюдалась компенсаторная индукция липид-связывающего белка кератиноцитов, которая, как сообщается, преодолевает функциональные эффекты потери адипоцит-специфичного aFABP / ALBP / aP2 (110).Внутриклеточные липид-связывающие белки могут быть важными регуляторами липолиза. Дальнейшие исследования необходимы для определения относительной роли этих белков в липолизе адипоцитов.
Caveolin-1
Кавеолы и кавеолярные белки участвуют в регуляции множества функций внутри клеток (23, 93, 103). Кавеолин-1 обнаруживается в особенно больших количествах в жировой ткани и сильно индуцируется во время дифференцировки фибробластов 3T3-L1 в зрелые адипоциты (107).Хотя кавеолин-1 обычно обнаруживается в кавеолах плазматических мембран, протеомный анализ показал, что в адипоцитах кавеолин-1 также локализуется в липидной капле (14, 23, 93, 103). Роль кавеолина-1 в липолизе была предложена в исследованиях мышей, не содержащих кавеолин-1. Эти животные заметно ослабили липолитическую активность в белой жировой ткани (23) и не смогли показать нормальное увеличение неэтерифицированных ЖК в сыворотке, которое ожидается при голодании, что позволяет предположить, что кавеолин-1 играет роль в активации липолиза (24).Мыши с нокаутом кавеолина-1 также не могут должным образом высвобождать жирные кислоты из запасов ТАГ в коричневой жировой ткани в ответ на голодание, что приводит к нарушению термогенеза (24). Регуляция передачи сигнала, опосредованной циклическим АМФ (цАМФ), может способствовать влиянию кавеолина-1 на липолиз (101). Было показано, что кавеолин-1 напрямую взаимодействует с каталитической субъединицей PKA для ингибирования цАМФ-зависимой передачи сигналов in vivo (101). Однако у мышей с нокаутом было показано, что, в то время как активность PKA значительно увеличивалась в отсутствие кавеолина-1, фосфорилирование перилипина резко снижалось (23).Активация β3-адренорецептора приводит к образованию лиганд-индуцированного комплекса между перилипином, кавеолином-1 и каталитической субъединицей PKA в адипоцитах (23). Следовательно, кавеолин-1 может способствовать PKA-опосредованному фосфорилированию перилипина, тем самым способствуя усилению стимуляции липолиза.
CGI-58
Мутации в CGI-58 (сравнительная идентификация гена 58), также известном как ABHD5 (белок 5, содержащий альфа / бета-гидролазный домен), оказались причиной редкого аутосомно-рецессивного заболевания, называемого чанарин. -Синдром Дорфмана (CDS) (67).CDS характеризуется чрезмерным накоплением ТАГ в клетках многих органов, а клинические проявления включают ихтиоз, катаракту, атаксию, нейросенсорную тугоухость и умственную отсталость (67). CGI-58 по структуре напоминает липазы; однако в нем отсутствует консервативный серин активного сайта, который был заменен аспарагином (66). В адипоцитах 3T3-L1 CGI-58 локализуется в липидной капле и, как было показано, напрямую взаимодействует (139) и колокализируется с перилипином A (121). Однако, когда клетки обрабатывают агентами, способствующими липолизу, они рассеиваются из липидной капли (121).Недавно Lass et al. (66) продемонстрировали, что CGI-58 стимулирует липолиз in vitro и является активатором ATGL, но не HSL. При добавлении к цитозольным экстрактам жировой ткани мыши CGI-58 стимулировал липолиз, тогда как очищенный CGI-58 не проявлял липазной активности in vitro. Кроме того, они показали, что мутантные формы CGI-58 не могут активировать ATGL. Хотя CGI-58, по-видимому, играет роль в липолизе, необходимы дополнительные исследования для выяснения молекулярного механизма его активации ATGL, а также его физиологической роли в живых организмах.
Другие белки, участвующие в гидролизе ТАГ
Аквапорин 7 — это белок, переносящий воду и глицерин, экспрессирующийся в плазматической мембране адипоцитов (46, 50, 75). У мышей с дефицитом аквапорина 7 нарушено высвобождение глицерина в ответ на голодание и лечение бета-адренергическими агонистами, хотя высвобождение ЖК из адипоцитов и уровни FFA в плазме сопоставимы с таковыми, наблюдаемыми у однопометников дикого типа (75). У этих животных развивается возрастное ожирение, вызванное индукцией глицеринкиназы и повышенным накоплением ТАГ (53).
Липотранзин был идентифицирован дрожжевым двугибридным скринингом библиотеки кДНК адипоцитов 3T3-L1 как белок, взаимодействующий с HSL (123). Считается, что он действует как стыковочный белок, который опосредует гормонально индуцированную транслокацию HSL из цитоплазмы в липидную каплю (123).
TIP47 — ассоциированный с липидными каплями белок семейства PAT с неизвестной функцией (36). TIP47 ингибирует гидролиз ретиниловых эфиров GS2 и HSL в кератиноцитах человека, предполагая, что в адипоцитах он может иметь аналогичную антилиполитическую функцию с другими белками семейства PAT, такими как перилипин или белок / адипофилин, связанный с дифференцировкой жировой ткани (36).
ПИТАТЕЛЬНАЯ РЕГУЛИРОВКА ЛИПОЛИЗА
Пищевая регуляция липолиза происходит на нескольких уровнях в ответ на изменение метаболических условий и потребления питательных веществ. Острая и быстрая регуляция липолиза жировой ткани происходит для поддержания поставок энергетических субстратов во время постабсорбционного состояния и для эффективного хранения избыточного топлива после еды. Хроническое воздействие экстремальных состояний питания, таких как ожирение или голодание, также вызывает метаболические адаптации, включая изменения липолиза.И, наконец, все больше данных указывает на то, что воздействие определенных метаболически активных питательных веществ в рационе также может регулировать липолиз.
СТИМУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИЗА ВО ВРЕМЯ ГОДА
Голодание резко стимулирует липолиз, повышая концентрацию в сыворотке крови жирных кислот и глицерина, которые действуют как окислительные субстраты для поддержания энергетических потребностей других метаболических тканей. Катехоламины являются основными активаторами липолиза, индуцированного натощак. Метаболические пути, посредством которых эти молекулы действуют, чтобы стимулировать гидролиз ТАГ и высвобождение ЖК, были тщательно изучены и подробно рассмотрены (6, 17, 18, 29, 63, 64 и ссылки, содержащиеся в них).Катехоламин норэпинефрин связывает бета-адренорецепторы на плазматической мембране адипоцитов. Эти рецепторы связаны с Gs-белками, которые передают стимулирующий сигнал аденилатциклазе для образования циклического АМФ (цАМФ). цАМФ связывает PKA, заставляя регуляторные субъединицы диссоциировать от каталитически активных субъединиц, что приводит к повышению активности фермента (60).
PKA катализирует полифосфорилирование HSL по нескольким сайтам, включая неактивирующий сайт (Ser-563), а также два дополнительных сайта (Ser-659 и Ser-660), которые вызывают активацию и последующую транслокацию этой липазы из цитозоля в липидная капля (4, 51, 120).Как обсуждалось выше, PKA также фосфорилирует перилипин на липидной капле, что приводит к изменениям, которые усиливают стимулированный липолиз, включая перемещение перилипина от липидной капли (21), перилипин-опосредованное ремоделирование липидных капель, что увеличивает площадь поверхности, доступную для липолитической атаки. (75) и перилипин-опосредованная активация активности HSL на поверхности липидной капли (84, 125). Результаты исследований на HSL-нулевых мышах предполагают, что липолиз, стимулированный катехоламинами, может также включать другие липазы ТАГ.Обработка адипоцитов, выделенных от HSL-нулевых мышей, бета-адренергическим агонистом изопротеренолом вызывает усиленный липолиз, хотя и на более низком уровне по сравнению с адипоцитами от животных дикого типа (91). Это предполагает, что некоторые или все недавно открытые ТАГ-липазы адипоцитов могут быть прямыми мишенями для PKA-опосредованного фосфорилирования и активации, и действительно, Zimmerman et al. (145) ранее показали, что деснутрин / ATGL фосфорилируется, хотя он не является мишенью для PKA. Это также предполагает, что PKA может косвенно активировать не-HSL-опосредованный липолиз TAG.Было показано, что одной экспрессии перилипина достаточно для обеспечения PKA-опосредованного липолиза в клетках CHO, в которых отсутствует HSL (126). Фосфорилирование перилипина с помощью PKA может приводить к изменениям, которые увеличивают активность липаз, связанных с множественными липидными каплями. Возможные механизмы включают содействие доступу растворимых липаз к гидрофобным субстратам, облегчение образования комплексов между липазами и белками, связанными с липолизом, и стабилизацию липаз на поверхности липидной капли.Необходимы дальнейшие исследования для выяснения природы PKA-опосредованного липолиза в отсутствие HSL.
Глюкагон стимулирует липолиз в изолированных адипоцитах мыши (48, 114) и человека (96), независимо от антагонистических эффектов на действие инсулина. Лечение глюкагоном вызывает повышение активности аденилатциклазы, что приводит к увеличению уровня цАМФ внутриклеточных адипоцитов (95, 96). Ингибирующий желудочный полипептид конкурирует с глюкагоном за связывание с рецептором глюкагона и может ингибировать стимулированный глюкагоном липолиз в адипоцитах, что указывает на то, что глюкагон опосредует липолиз, по крайней мере частично, через прямую активацию его рецептора (27).Хотя действие глюкагона в первую очередь специфично для печени, сообщалось, что рецепторы глюкагона присутствуют в мембранах жировой ткани человека (83), что позволяет предположить, что прямое действие глюкагона, вероятно, играет важную роль в регулировании липолиза человека, а также грызунов.
ИНГИБИРОВАНИЕ ЛИПОЛИЗА ВО ВРЕМЯ ПРАВИЛЫ
Повторное кормление ослабляет липолиз адипоцитов, в первую очередь за счет мощного антилиполитического действия инсулина. Этот регуляторный путь также был тщательно изучен и проанализирован (6, 17, 18, 29, 63 и ссылки, содержащиеся в них).Быстрая и острая регуляция липолиза инсулином включает как цАМФ-зависимые, так и цАМФ-независимые механизмы. ЦАМФ-зависимое подавление липолиза инсулином включает активацию фосфодиэстеразы 3B (63). Связывание инсулина вызывает аутофосфорилирование его рецептора, что приводит к активации и последующему фосфорилированию тирозина субстратов рецептора инсулина и связыванию регуляторной субъединицы p85 фосфатидилинозитолкиназы-3 (PI3K). Активированный PI3K аутофосфорилирует свое инозитоловое кольцо, регуляторную субъединицу p85 и каталитические субъединицы p110, за чем следует фосфорилирование и активация протеинкиназы B / Akt (PKB / Akt).PKB / Akt фосфорилирует и активирует фосфодиэстеразу 3B, которая расщепляет цАМФ в адипоцитах, высвобождая PKA из активации и уменьшая липолиз за счет снижения опосредованной фосфорилированием активации HSL и перилипина. ЦАМФ-независимая регуляция липолиза инсулином включает стимуляцию протеинфосфатазы-1 посредством фосфорилирования ее регуляторной субъединицы (100). Активированная протеинфосфатаза-1 быстро дефосфорилирует и деактивирует HSL, вызывая снижение скорости липолиза (73, 92, 100, 119, 143).
Инсулин также может подавлять липолиз в адипоцитах 3T3-L1 за счет подавления мРНК деснутрина / ATGL (59). Напротив, экспрессия мРНК HSL не регулируется краткосрочными изменениями нутритивного статуса (124). Помимо ингибирующего действия на ферменты при гидролизе ТАГ, инсулин также снижает измеримую скорость липолиза (на что указывает высвобождение свободных жирных кислот и глицерина из интактных клеток), способствуя повторной этерификации жирных кислот (16). Это служит для усиления очевидного подавления гидролиза ТАГ инсулином и физиологического эффекта гормона.
AMP-активированная протеинкиназа (AMPK) в качестве главного сенсора внутриклеточной энергии участвует в регуляции метаболизма глюкозы и липидов (33, 86). Активация AMPK в адипоцитах 5-аминоимидазол-4-карбоксиамид-1-бета-D-рибофуранозидом (AICAR) ингибирует липолиз (32, 33, 112). Инфузия AICAR тучным крысам Zucker, а также худым однопометникам снижает концентрацию ТАГ и ЖК в плазме, а также обмен глицерина (37), тогда как у мышей, лишенных субъединицы AMPK-alpha2, наблюдается повышенное ожирение и увеличение веса (98, 131 ).Однако другие обнаружили, что активация AMPK также может играть роль в стимуляции максимальной скорости липолиза с помощью цАМФ (86). Молекулярные события и мишени, лежащие в основе регуляции липолиза с помощью AMPK, еще предстоит понять.
ЛИПОЛИЗ ПРИ ОЖИРЕНИИ
Ожирение связано с увеличением базального липолиза (102), но снижением липолиза, стимулированного катехоламинами (65). Нарушение чувствительности адипоцитов к передаче сигналов инсулина, включая антилиполитические эффекты этого гормона, может способствовать усилению базального липолиза при ожирении.Сообщалось о снижении опосредованного инсулином подавления липолиза адипоцитов у крыс с ожирением (118), а также у женщин с висцеральным ожирением (3, 54), хотя в нескольких других исследованиях на людях сообщается, что антилиполитические эффекты инсулина хорошо сохраняются даже у субъекты с сильно нарушенной инсулино-опосредованной регуляцией глюкозы (7, 8, 11, 52). Как у страдающих ожирением, так и у пациентов, не страдающих ожирением, голодание и снижение веса вызывают значительное повышение чувствительности к антилиполитическим эффектам инсулина (7, 28, 71).
Избыточная экспрессия гена лептина в адипоцитах и повышенные уровни лептина в кровотоке также могут способствовать усилению базального липолиза при ожирении (74). Обработка адипоцитов, выделенных от худых мышей, лептином, стимулирует липолитическую активность (33). Обработка адипоцитов, выделенных от мышей ob / ob с ожирением и дефицитом лептина, приводит к еще большей стимуляции липолиза (33). Более того, хроническое (112) или острое (32) периферическое введение лептина также стимулирует гидролиз ТАГ жировой ткани у крыс, что приводит к увеличению скорости липолиза в 9–16 раз.Липолитическое действие лептина зависит от рецептора лептина, поскольку тучные крысы fa / fa Zucker (112) и мыши db / db (32), у которых есть инактивирующая мутация длинной формы рецептора лептина, устойчивы к лептину. -индуцированный липолиз. Повышенный уровень циркулирующего лептина может также усиливать липолиз, противодействуя антилиполитическим эффектам инсулина (86). Лептин ухудшает несколько метаболических эффектов инсулина, включая способность гормона ингибировать липолиз, опосредованный бета-адренорецепторами, и активацию PKA (86).
Липолиз, стимулируемый бета-адренорецепторами, нарушается при ожирении (65). Адипоциты субъектов с ожирением имеют более низкие уровни активности аденилатциклазы в условиях, стимулируемых гормонами, по сравнению с адипоцитами из контрольной группы, не страдающей ожирением (77). Этому эффекту могут способствовать изменения адренергических сигнальных путей. Ожирение связано со снижением липолитического эффекта катехоламинов в жировой ткани (65). Адипоциты крыс Zucker с ожирением имеют более высокий уровень антилиполитических α2-адренорецепторов по сравнению с адипоцитами тощих однопометников (19).Напротив, адипоциты мышей с ожирением экспрессируют в два раза более низкие уровни Gsα, субъединицы GTP-связывающего белка, через который бета-адренорецепторы стимулируют аденилатциклазу (38). Пострецепторные дефекты также могут способствовать нарушению гормонально-стимулированного липолиза. Было показано, что максимальная липолитическая способность снижается в адипоцитах, выделенных от субъектов с ожирением, по сравнению с адипоцитами от субъектов без ожирения после стимуляции устойчивым к фосфодиэстеразе аналогом цАМФ дибутирил цАМФ (65).Это открытие указывает на нарушение действия цАМФ ниже воздействия ожирения на передачу сигналов адренергических рецепторов, активацию аденилатциклазы, связанную с G-белком, или уровни цАМФ. HSL и перилипин A являются основными мишенями для цАМФ-зависимой активации PKA. Снижение уровней HSL (65) и перилипина (135) в жировой ткани у субъектов с ожирением может способствовать нарушению катехоламинового липолиза через пострецепторный дефект. Снижение веса у лиц с ожирением вызывает существенное повышение и нормализацию чувствительности к катехоламиновой стимуляции липолиза (77) без изменения количества β-адренорецепторов (102).
Продукция фактора некроза опухоли альфа (TNFα) увеличивается в адипоцитах у людей с ожирением и может способствовать усилению базального липолиза при ожирении (97, 104, 105). Этот цитокин сигнализирует аутокринным / паракринным образом через рецептор TNFα, чтобы активировать митоген-активируемые протеинкиназы p44 / 42 и JNK, которые, в свою очередь, подавляют мРНК перилипина и экспрессию белка (104, 105). Исследования специфических ингибиторов p44 / 42 и JNK подтверждают, что TNFα-опосредованное увеличение липолиза в значительной степени связано со снижением уровней перилипина в адипоцитах (104, 105), а более низкие уровни перилипина были обнаружены в жировой ткани у субъектов с ожирением. (135).
РЕГУЛИРОВАНИЕ ЛИПОЛИЗА АДИПОЦИТОВ ПИЩЕВЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
Кальций
Более высокое потребление кальция связано с уменьшением ожирения и снижением риска ожирения в различных эпидемиологических исследованиях (108 и ссылки в них). Кроме того, было показано, что добавление кальция способствует снижению веса у людей с ожирением, потребляющих калорийную диету (142), и у мышей с ожирением с ограничением калорий (111), а также, как сообщается, ингибирует восстановление веса во время возобновления кормления мышей (122 ).Считается, что усиленный липолиз способствует этим открытиям, и действительно, сообщалось, что острое потребление кальция значительно коррелирует с окислением жиров у людей (82). В нескольких исследованиях изучались молекулярные механизмы, лежащие в основе потенцирования липолиза адипоцитов пищевым кальцием. Увеличение пищевой кальциевой обратной связи подавляет секрецию паратироидного гормона (ПТГ) и, следовательно, активацию 25-гидроксихолекальциферола до 1,25-дигидроксикальциферола (витамин D 3 ; VD 3 ) (87).Адипоциты являются мишенями для действия этих гормонов (141). ПТГ стимулирует дозозависимое повышение уровня внутриклеточного кальция в адипоцитах, что связано как с увеличением притока, так и с мобилизацией внутриклеточных запасов (89). Также было показано, что VD 3 вызывает повышение уровня внутриклеточного кальция (111). Повышенный уровень внутриклеточного кальция в адипоцитах человека подавляет липолиз, стимулируемый путём β-адренорецепторов (111, 138), что приводит к снижению уровней цАМФ и снижению фосфорилирования HSL (138).Эти эффекты, по-видимому, опосредуются в первую очередь активацией фосфодиэстеразы 3B (138). Низкое потребление кальция с пищей и повышенный циркулирующий VD 3 также могут оказывать косвенное ингибирующее действие на липолиз адипоцитов, регулируя использование липолитических субстратов для энергетического метаболизма (111, 122). Обратное регулирование уровней внутриклеточного кальция в адипоцитах кальцитропными гормонами может способствовать влиянию пищевого кальция на ожирение.
Кофеин
Липолитические эффекты кофеина и других метилксантинов, полученных из чая и кофе, хорошо известны и хорошо изучены.Эти соединения стимулируют липолиз за счет увеличения клеточных уровней цАМФ посредством двух основных механизмов. Первый — антагонизм А1-аденозиновых рецепторов (72). Эти рецепторы преобладают на дифференцированных зрелых адипоцитах, где они ингибируют активность аденилатциклазы и подавляют липолиз (12). Антагонизм A1-рецепторов приводит к снижению активности аденилатциклазы и усилению липолиза (72). Метилксантины также подавляют активность фосфодиэстеразы, предотвращая распад цАМФ и стимулируя липолиз в жировых клетках (2, 95).Прием кофеина увеличивает обмен липидов (2) и концентрацию свободных жирных кислот в сыворотке крови (5, 61). Таким образом, высокое потребление метилксантинов может также способствовать снижению веса и поддержанию веса за счет усиленного окисления жиров и термогенеза (137).
Этанол
Острое употребление этанола оказывает антилиполитическое действие, которое вызывает значительное снижение содержания свободных жирных кислот в сыворотке (1) и снижение окисления липидов всего тела (113). Повышенный уровень ацетата в плазме может способствовать этому эффекту (1, 113).Сообщалось, что хроническое употребление этанола у крыс подавляет липолиз адипоцитов, опосредованный бета-адренорецепторами, вероятно, за счет повышенной активации фосфодиэстеразы 4 (56). Это привело к снижению активации PKA, стимулированной бета-адренорецепторами, и снижению активирующего фосфорилирования перилипина A и HSL (56). Сообщалось также, что хроническое потребление этанола связано со снижением секреции ПТГ, что также может способствовать усилению липолиза за счет снижения уровней внутриклеточного кальция в адипоцитах (81).
ОБЗОР И БУДУЩИЕ НАПРАВЛЕНИЯ
Липолиз адипоцитов — сложный процесс, который точно контролируется путем интеграции множества разнообразных гормональных и биохимических сигналов. Нарушение этой регуляции может способствовать развитию ожирения и связанных с ним патологий. В последнее время было сделано много захватывающих достижений, включая открытие основных липаз ТАГ, которые способствуют липолизу адипоцитов in vivo. Однако многое еще предстоит выяснить в отношении функционирования in vivo и относительного вклада этих липаз в общий липолиз адипоцитов.По мере создания генетических мышейных моделей этих ферментов наше понимание липолиза адипоцитов, вероятно, в ближайшем будущем резко улучшится.
КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ
Липолиз точно регулируется множеством гормональных и биохимических сигналов, которые сходятся на адипоцитах, чтобы регулировать функцию липаз и неферментативных дополнительных белков.
Гидролиз ТАГ ограничивает скорость липолиза и катализируется одной или несколькими новыми липазами, которые включают деснутрин / ATGL и TGH.
Основные регуляторы липолиза включают липолитические активаторы глюкагон и катехоламины, а также антилиполитический агент инсулин.
Диетические компоненты также могут регулировать липолиз. К ним относятся диетический кальций, этанол и кофеин.
БУДУЩИЕ ВОПРОСЫ
Создание мышей с дефицитом деснутрина / ATGL, особенно в жировой ткани, поможет выяснить роль этой липазы in vivo в липолизе жировой ткани.
Генетические мышиные модели, дефицитные по другим липазам ТАГ, также будут необходимы для определения их относительного вклада в липолиз.
Роль датчика энергии AMPK в обеспечении липолиза остается неясной. Для решения этой проблемы требуется дополнительная работа.
Было обнаружено, что некоторые диетические питательные вещества регулируют липолиз. Учитывая бремя хронических заболеваний, связанных с ожирением, открытие пищевых веществ, стимулирующих липолиз, будет представлять большой интерес.
Глоссарий
| WAT | белой жировой ткани |
| TAG | триацилглицерида |
| FA | жирных кислот |
| ДАГ | diacylglyceride |
| МАГ | моноацилглицерид |
| Липолиз | гидролиз ТАГ с образованием неэтерифицированных жирных кислот (ЖК) и глицерина, которые высвобождаются в сосудистую сеть для использования другими органами в качестве энергетических субстратов |
| HSL | гормоночувствительная липаза |
| ATG | липаза триглицеридов жировой ткани |
| TGH | триацилглицеридгидролаза |
| MGL | моноглицерид липаза |
| PKA 9012P 154 904 904 904 904 904 протеин 904 CAMP теин киназа B | |
| PTH | паратироидный гормон |
| VD 3 | 1,25 (OH) 2 витамин D 3 |
Трансферрин и железо способствуют липолитическому эффекту сыворотки на изолированные адипоциты
Abstract
Предыдущие отчеты показали, что нормальная сыворотка может увеличить скорость липолиза адипоцитов in vitro. Однако природа липолитической активности остается невыясненной. Мы исследовали липолитическую активность сыворотки крови человека с использованием изолированных адипоцитов крысы. Сыворотка человека вызывала дозозависимую стимуляцию липолиза (высвобождение глицерина) в адипоцитах с полумаксимальной эффективной дозой 0.05% сыворотки и при максимальной стимуляции 1% сыворотки. Эффект сыворотки на высвобождение глицерина был быстрым (в течение 30 минут), и эффект был обратимым. Частичная очистка этой липолитической активности с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии демонстрирует, что белок ~ 80 кДа вносит вклад в липолитическую активность. Трансферрин человека имитировал активность частично очищенной сыворотки, что приводило к максимальному увеличению базального липолиза на 50%. Кроме того, гептагидрат сульфата железа индуцировал двухфазное увеличение скорости липолиза с максимальным увеличением на 50% при ∼0.6 мкг / мл железа. Ингибиторы протеинкиназы A (H89) и митоген-активируемой протеинкиназы (PD98059) не блокировали влияние сыворотки на липолиз, тогда как акцептор свободных радикалов N -ацетил-1-цистеин полностью подавлял эффект. Эти данные свидетельствуют о том, что стимулирующий эффект сыворотки на липолиз частично опосредован железом, вероятно, через прооксидантный механизм.
Липолиз адипоцитов является основным источником циркулирующих свободных жирных кислот (СЖК) в постпрандиальном состоянии.Кроме того, чрезмерное производство FFA все чаще признается как основной фактор, влияющий на медицинские последствия избыточного веса или ожирения. СЖК увеличивают выработку глюкозы в печени (1,2) и ингибируют поглощение глюкозы скелетными мышцами (3), тем самым способствуя развитию синдрома инсулинорезистентности, который является основным фактором риска диабета и способствует повышению сердечно-сосудистого риска, связанного с ожирением. СЖК также увеличивают синтез ЛПОНП в печени, способствуют гипертриглицеридемии и, следовательно, понижают уровень ЛПВП и могут способствовать развитию гипертензии (rev.в 4,5). По этим причинам идентификация циркулирующих факторов, которые могут влиять на липолиз адипоцитов, может дать новое понимание этиологии инсулинорезистентности и диабета 2 типа и связанных с ними расстройств.
Уже более 30 лет известно, что добавление нормальной сыворотки к изолированным адипоцитам может увеличить скорость липолиза (6–9), демонстрируя присутствие липолитического фактора (ов) в сыворотке. Однако основной механизм этого липолитического эффекта сыворотки и природа сывороточного фактора (ов), ответственного за этот эффект, остаются неясными.Важно отметить, что ранее сообщалось (8), что активность частично, но не полностью удаляется ультрафильтрацией, предполагая, что может быть более одного компонента этой липолитической активности.
В этом отчете мы охарактеризовали липолитическую активность сыворотки крови человека и определили, что одним из компонентов этой активности, вероятно, является трансферрин и связанное с ним железо. Эти эффекты трансферрина и железа составляют около 50% липолитической активности сыворотки. Это открытие может способствовать недавно выявленной тесной взаимосвязи между запасами железа, метаболизмом железа и диабетом (10–12).
РАЗРАБОТКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
BSA был получен от Intergen (Purchase, NY), коллагеназа типа 2 — от Worthington (Freehold, NJ), а человеческая сыворотка — от SeraCare Life Sciences (Oceanside, CA). Все остальные реагенты были от Sigma (Сент-Луис, Миссури), если не указано иное.
Самцов крыс Sprague-Dawley использовали для всех экспериментов. Животные (180–240 г) были приобретены у Harlan Sprague-Dawley (Индианаполис, Индиана). Их поддерживали на 12-часовом цикле свет-темнота и кормили Prolab RMH 1000 (PMI Nutrition, Брентвуд, Миссури) и воду из-под крана ad libitum.
Выделение адипоцитов.
Животные были убиты удушением CO 2 . Протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Bassett Healthcare. Адипоциты выделяли из жировых подушечек придатка яичка, как описано ранее (13,14). Переваривание проводили при 37 ° C при постоянном встряхивании (140 циклов / мин) в течение 26 мин. Клетки фильтровали через нейлоновую сетку (1 мм) и трижды промывали инкубационным буфером (IB), содержащим 137 ммоль / л NaCl, 5 ммоль / л KCl, 4.2 ммоль / л NaHCO 3 , 1,3 ммоль / л CaCl 2 , 0,5 ммоль / л MgCl 2 , 0,5 ммоль / л MgSO 4 , 0,5 ммоль / л KH 2 PO 4 , и 20 ммоль / л HEPES (pH 7,6) плюс 1% BSA.
Лечение адипоцитами.
После выделения адипоциты ресуспендировали 1:20 (вес / объем) в IB, а аликвоты объемом 1 мл инкубировали при встряхивании (140 циклов / мин) в полипропиленовых пробирках 12 × 75 мм, содержащих сыворотку и / или другие добавки, как указано в течение 1 ч (если не указано иное) при 37 ° C.
Анализ липолиза.
Липолиз измеряли по высвобождению глицерина, как описано ранее, с использованием набора от Sigma (15).
Очистка липолитической активности сыворотки.
Для гель-фильтрационной хроматографии человеческую сыворотку разводили 1: 1 в HEPES-буферном физиологическом растворе (HBS), pH 7,6, и наносили на колонку Sephadex G200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Белки элюировали HBS со скоростью 5 мл / ч и собирали фракциями по 30 мин. Для ионообменной хроматографии человеческую сыворотку разбавляли 1: 1 в HBS и наносили на колонку с быстрым потоком Q Sepharose (Pharmacia).После загрузки белок элюировали градиентом NaCl от 150 до 600 ммоль / л со скоростью 18 мл / ч и собирали по 5-минутным фракциям. Концентрацию белка во фракциях определяли по методу Брэдфорда (16) с использованием набора от BioRad (Hercules, CA).
SDS-PAGE и окрашивание серебром. Гели
SDS-PAGE получали с использованием набора для гель-электрофореза BioRad Mini-Protean II в соответствии с протоколом производителя. Очищенные фракции (1 мкг) разделяли на 7,5% SDS-PAGE гелях и затем окрашивали серебром с использованием набора ProteoSilver Silver Stain kit (Sigma).
Идентификация окисленных белков.
Открытые карбонилы окисленных цитозольных и мембранных белков были обнаружены Вестерн-анализом после дериватизации 2,4-динитрофенилгидразином с использованием набора Oxyblot Protein Oxidation Detection (Chemicon, Temecula, CA) в соответствии с инструкциями производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние сыворотки на липолиз.
Для исследования влияния сыворотки на липолиз изолированные адипоциты крысы инкубировали в течение 2 часов с нормальной сывороткой человека в концентрациях от 0 до 1% по объему.Затем измеряли высвобождение глицерина для определения скорости липолиза. Как показано на рис. 1, небольшие количества сыворотки более чем вдвое увеличивают скорость липолиза в этих клетках, при этом полумаксимальный эффект наблюдается в присутствии только 0,05% сыворотки. Эффект был максимальным в присутствии ~ 1% сыворотки.
Для определения скорости проявления сывороточного эффекта адипоциты инкубировали с сывороткой или без нее и измеряли накопление глицерина с течением времени (рис. 2). В этих условиях высвобождение глицерина было линейным во времени до 3 ч, что указывает на постоянство скорости липолиза.Скорость высвобождения глицерина была выше в присутствии 0,1 или 1% сыворотки в самое раннее измеренное время (30 мин). Кроме того, более высокая скорость липолиза сохранялась в течение 3 часов эксперимента. Это открытие показывает, что липолитический эффект сыворотки проявляется очень быстро.
Затем были проведены исследования, чтобы определить, является ли эффект сыворотки обратимым. На рис. 3 адипоциты обрабатывали 1% сывороткой или без нее в течение 1 ч, чтобы обеспечить максимальную стимуляцию сывороткой.Затем клетки промывали и определяли скорость высвобождения глицерина в течение следующих 3 часов. Уровень стимуляции сывороткой заметно не снижался в течение первых 30 минут после удаления сыворотки, но затем вернулся к контрольным значениям через 3 часа, демонстрируя, что липолитический эффект сыворотки легко обратим.
Частичная очистка липолитической активности сыворотки.
Для определения липолитической активности сыворотки было проведено несколько предварительных исследований. Во-первых, активность не удалялась из сыворотки после длительного диализа и осаждалась полиэтиленгликолем, что позволяет предположить, что активность обусловлена одним или несколькими белковыми компонентами сыворотки (данные не показаны).Во-вторых, исследования ультрафильтрации подтвердили наблюдения, сделанные Curtis-Prior в 1973 г. (8) о том, что липолитическая активность сыворотки была разделена между концентратом и ультрафильтратом, независимо от «порогового» значения используемых мембран. Подобным образом активность частично осаждалась сульфатом аммония (данные не показаны). В совокупности эти предварительные исследования предполагают, что липолитическая активность сыворотки обусловлена либо множественными формами липолитических белков, либо небольшой молекулой, которая может связываться с белком без потери активности.
Для дополнительной очистки активности сыворотки, осаждаемой полиэтиленгликолем, человеческую сыворотку разводили 1: 1 в HBS и наносили на колонку с сефадексом G200 (рис. 4 A ). Фракции из колонки G200 анализировали на липолитическую активность, измеряя их влияние на высвобождение глицерина адипоцитами. Наблюдали два основных пика активности при элюировании из колонки G200. Первый пик совпал с пустым объемом колонки, а второй основной пик соэлюировал приблизительно с иммуноглобулинами, но раньше альбумина.Однако активность не связана с иммуноглобулинами. Во-первых, пик довольно широкий. Кроме того, истощение IgG из сыворотки с помощью агарозы с протеином А не приводило к истощению активности, и только IgG не имитировал эффект сыворотки (данные не показаны).
В попытке достичь большей очистки липолитического белка активность была очищена из сыворотки крови человека с использованием колонки с Q-сефарозой (фиг. 4 B ). Белок элюировали градиентом NaCl от 150 до 600 ммоль / л, при этом основная активность элюировалась при ~ 300 ммоль / л NaCl.Две полосы, оцененные по окрашиванию серебром (фиг. 4 C ), с кажущейся молекулярной массой 75 и 80 кДа коррелировали с появлением липолитической активности в элюате Q-сефарозы. Другой основной полосой ~ 66 кДа, вероятно, является альбумин, основной белок сыворотки.
Роль железа в липолитической активности сыворотки.
На основании молекулярной массы полос, элюированных Q-сефарозой, мы предположили, что полосой 80 кДа является трансферрин. Это было исследовано с использованием очищенного трансферрина человека.Обработка изолированных адипоцитов трансферином человека приводила к дозозависимому увеличению липолиза (рис. 5). Трансферрин в концентрации 30 мкг / мл приводил к увеличению скорости липолиза на ~ 35%. Это хорошо соответствует концентрации трансферрина, которую можно ожидать в результате добавления 1% сыворотки, поскольку концентрация трансферрина в нормальной сыворотке составляет ~ 3 мг / мл. Следовательно, трансферрин, вероятно, является компонентом общей липолитической активности нормальной сыворотки.
Затем мы оценили, может ли железо в форме сульфата железа стимулировать липолиз в адипоцитах (рис. 6). Подобно трансферрину, железо II приводило к дозозависимому увеличению липолиза с максимальным увеличением на 50% по сравнению с базальным. В отличие от трансферрина, действие железа было двухфазным с максимальной липолитической концентрацией при 3 мкг / мл гептагидрата сульфата железа (что соответствует ~ 0,6 мкг / мл элементарного железа). Таким образом, само по себе железа оказывается достаточным для стимуляции липолиза в той же степени, что и трансферрин.Кроме того, действие железа не было аддитивным к эффекту трансферрина (данные не показаны), что позволяет предположить, что железо и трансферрин стимулируют липолиз по одному и тому же механизму.
Возможные механизмы липолитической активности сыворотки крови.
Чтобы изучить механизм, с помощью которого сыворотка стимулирует липолиз, мы инкубировали адипоциты с ингибиторами протеинкиназы А или митоген-активируемой протеинкиназы (MAP). На фиг. 7 A адипоциты обрабатывали 2% сывороткой или изопротеренолом в концентрации, выбранной для стимуляции липолиза до сопоставимой скорости (3 нмоль / л изопротеренола).Как и ожидалось, H89, ингибитор протеинкиназы A, полностью блокировал действие изопротеренола. Однако H89 не влиял на липолитическую активность сыворотки. Точно так же ингибитор киназы MAP, PD98059, не предотвращал влияние сыворотки на липолиз (фиг. 7 B ). Дальнейшие эксперименты (не показаны) продемонстрировали, что действие сыворотки также не блокировалось ингибитором протеинкиназы С, стауроспорином, или ингибитором фосфатидилинозитол-3-киназы, вортманнином. Следовательно, влияние сыворотки, по-видимому, не связано с путями цАМФ, MAP-киназы, протеинкиназы C или фосфатидилинозитол-3-киназы.
Поскольку железо, по-видимому, играет роль в сывороточной стимуляции, мы предположили, что липолитическая активность может быть обусловлена прооксидантным действием железа. Известно, что железо катализирует широкий спектр свободных радикалов, включая гидроксильные радикалы, посредством реакции Фентона. На фиг. 8 мы измерили скорость стимулированного сывороткой липолиза в присутствии или в отсутствие акцептора свободных радикалов, N -ацетил-1-цистеина (NALC). NALC (3 ммоль / л) полностью предотвращал влияние сыворотки на липолиз, но не влиял на трехкратную стимуляцию изопротеренолом 3 нмоль / л.Следовательно, липолитический эффект сыворотки может быть частично опосредован прооксидантными эффектами железа и / или других компонентов сыворотки. Для дальнейшего изучения этой возможности мы количественно оценили модифицированные белки в контрольных клетках и клетках, обработанных сывороткой. Многие типы окислительного повреждения белков приводят к образованию карбонильных групп (17). Поэтому мы обработали экстракты из контрольных и обработанных сывороткой клеток (описанные в плане и методах исследования), чтобы преобразовать эти карбонильные группы в их производные динитрофенилгидразина.Затем эти модифицированные белки были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, которое распознает динитрофенилгидразиновые фрагменты. Однако, хотя мы обнаружили множество белков, поврежденных окислением, мы не смогли обнаружить никакой разницы между клетками, обработанными сывороткой или трансферрином, и необработанными адипоцитами (данные не показаны). Это говорит о том, что либо прооксидантные эффекты железа не ответственны за липолитический эффект, либо различия были слишком незначительными, чтобы их можно было обнаружить с помощью этого метода.
Гидроксильные радикалы, образующиеся в результате реакции Фентона, могут инициировать перекисное окисление липидов. Сообщалось (18), что перекисное окисление липидов увеличивает базальную скорость липолиза в адипоцитах. Сообщалось (19), что 4-гидрокси-2-ноненаль (HNE), побочный продукт перекисного окисления липидов, является сигнальной молекулой, регулирующей функцию митохондрий. Поэтому мы определили влияние HNE на липолиз по сравнению с сывороткой (рис. 9). Этот эксперимент показал, что низкие концентрации HNE имитируют влияние сыворотки на липолиз.Это открытие является дополнительным доказательством того, что сыворотка может действовать через прооксидантный механизм, инициируя перекисное окисление липидов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мы продемонстрировали, что добавление очень малых количеств нормальной человеческой сыворотки к адипоцитам крысы приводит к выраженному увеличению скорости липолиза. Хотя об этом наблюдении впервые было сообщено в 1970-х годах (6–9), в более ранних исследованиях использовались гораздо более высокие концентрации сыворотки. Кроме того, основной механизм этого липолитического эффекта сыворотки и природа сывороточного фактора (факторов), ответственного за этот эффект, остаются неясными.
Из настоящих исследований ясно, что по крайней мере часть липолитического эффекта сыворотки обусловлена одним или несколькими высокомолекулярными белками. Об этом свидетельствует частичная очистка активности гель-фильтрацией и тот факт, что активность сохраняется при диализе. Мы исключили ряд белков, которые могли бы объяснить этот эффект. Во-первых, эффект явно не связан с иммуноглобулинами, потому что эффект не имитируется IgG, и он не устраняется обработкой сыворотки агарозой с протеином А.
Тисдейл и его коллеги (20,21) описали «липид-мобилизующий фактор» (LMF), который продуцируется опухолями, и мы рассмотрели возможность того, что LMF ответственен за липолитический эффект сыворотки. Однако LMF имеет ~ 43 кДа, термолабилен, и его действие блокируется ингибитором протеинкиназы A, H89 (21). Напротив, белок, который мы описываем, больше по размеру, очень термостойкий (данные не показаны), и его действию не препятствует H89. Другой возможностью могут быть цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α, но они намного меньше, чем белок (белки), которые мы описываем.Кроме того, эти цитокины циркулируют в очень низких концентрациях в нормальной сыворотке (22), и их действие на липолиз проявляется очень медленно (23–26). Поэтому мы считаем, что липолитическое действие сыворотки связано с одним или несколькими крупными белками, которые могут быть важны для регуляции метаболизма жировых клеток.
Высокая молекулярная масса липолитической активности поднимает вопрос о том, будет ли она иметь доступ к интерстициальному пространству. Однако мы обнаружили, что эффект сыворотки максимален при концентрации всего 1%, т.е.например, когда сыворотка была разбавлена от 1 до 100. Это говорит о том, что эти факторы циркулируют в ~ 100-кратной максимально эффективной концентрации для стимуляции липолиза адипоцитов. Следовательно, вполне вероятно, что в адипоциты попадет достаточно, чтобы регулировать их активность in vivo. Например, было показано, что трансферрин является компонентом липолитической активности сыворотки и, как известно, имеет доступ к интерстициальному пространству.
Все большее признание получает важность регуляции липолиза в определении общего метаболизма глюкозы.В 1963 году Randle et al. (3) предположили, что поглощение глюкозы в скелетных мышцах ингибируется СЖК. Хотя это было спорным в течение многих лет, сейчас есть неопровержимые доказательства того, что циркулирующие СЖК обладают многими действиями, которые противодействуют инсулину у человека in vivo (27–32). В дополнение к эффекту, первоначально определенному Randle et al. И часто называемому «цикл глюкоза-жирные кислоты», в настоящее время установлено, что СЖК увеличивают выработку глюкозы в печени (1,27,31,33) и могут иметь эффекты. на поджелудочную железу (2,30).
Влияние свободных жирных кислот на метаболизм глюкозы, вероятно, важно для нормальной физиологии. Например, во время голодания способность свободных жирных кислот (и кетоновых тел) ингибировать метаболизм глюкозы, вероятно, «экономит» глюкозу для тех тканей, которым для выживания требуется глюкоза, в частности для мозга, эритроцитов и мозгового вещества почек. Однако у тучных субъектов с избыточными запасами жировой ткани вполне вероятно, что образующийся избыток FFA вреден, особенно в отношении инсулинорезистентности и развития диабета 2 типа.Следовательно, понимание механизмов, ответственных за регуляцию липолиза, может привести к новым терапевтическим подходам к лечению инсулинорезистентности и диабета 2 типа и / или к профилактике диабета у субъектов из группы риска. Следовательно, определение идентичности липолитических белков сыворотки, выяснение механизма их действия и определение того, изменяется ли их активность у лиц с ожирением или диабетом, может привести к новому пониманию механизма или лечения инсулинорезистентности.
Эти данные демонстрируют, что ~ 50% липолитического эффекта сыворотки может быть объяснено трансферрином, эффект, который может имитироваться свободным железом. Механизм, с помощью которого железо стимулирует липолиз, неясен, но может быть связан с его прооксидантными эффектами. Железо может катализировать образование свободных радикалов, включая гидроксильные радикалы, через реакцию Фентона. Гидроксильные радикалы могут инициировать перекисное окисление липидов, которое, как было показано (18), увеличивает базальный липолиз. Поглотитель свободных радикалов NALC полностью предотвращает стимуляцию липолиза сывороткой, что позволяет предположить, что может быть задействован прооксидантный механизм.Кроме того, NALC снижает базальный липолиз в этих клетках, что указывает на исходный уровень окислительного стресса, который может быть важным для регуляции липолиза. Однако нам не удалось определить какую-либо разницу в концентрации окислительно модифицированных белков между сывороткой или клетками, обработанными трансферрином, по сравнению с контрольными клетками. Это говорит о том, что либо прооксидантные эффекты железа не ответственны за липолитический эффект, либо различия были слишком незначительными, чтобы их можно было обнаружить этим методом.Напротив, в поддержку идеи о том, что задействован прооксидантный механизм, мы обнаружили, что побочный продукт перекисного окисления липидов HNE, который, как полагают, является сигнальной молекулой в определенных системах (19), имитирует эффект сыворотки. Очевидно, что для выяснения взаимосвязи между прооксидантной активностью железа и его влиянием на липолиз потребуются дальнейшие исследования.
Наши открытия устранили большинство известных сигнальных путей, ответственных за регуляцию липолиза. Во-первых, тот факт, что эффект не блокируется H89 (ингибитор протеинкиназы A), исключает участие цАМФ и, следовательно, классический путь стимуляции, опосредованной β-адренорецепторами.Точно так же эффект не подавлялся стауроспорином или вортманнином, эффективно устраняя участие протеинкиназы С или фосфатидилинозитол-3-киназы. Также возможно, что сыворотка увеличивает концентрацию одного или нескольких цитокинов, многие из которых усиливают липолиз адипоцитов (34). Однако последнее объяснение маловероятно, потому что цитокинам требуется несколько часов для стимуляции липолиза, тогда как эффекты, о которых мы сообщаем, происходят намного быстрее. Очевидно, что потребуется дополнительная работа для выяснения механизма (ов), участвующих в эффектах, о которых мы сообщаем здесь.
Наши результаты показывают, что и трансферрин, и свободное железо увеличивают скорость липолиза в адипоцитах. Однако эти эффекты не были аддитивными, что позволяет предположить, что они работают по одному и тому же механизму. Расчеты на основе опубликованной константы диссоциации связывания железа с трансферрином предсказывают, что концентрация свободного железа в нормальной сыворотке будет порядка 10 −19 мкг / мл (35). В наших руках концентрации ультрафильтруемого железа в образцах сыворотки были меньше нижнего предела нашего анализа (0.02 мкг / мл), тогда как эффективная концентрация железа в наших анализах липолиза составляла ∼0,6 мкг / мл. Следовательно, гораздо более вероятно, что железо, связанное с трансферрином, является физиологически релевантной формой для стимуляции липолиза. Хорошо известно, что адипоциты экспрессируют рецепторы трансферрина (36), поэтому вполне вероятно, что сывороточное железо поглощается адипоцитами в его связанной с трансферрином форме посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.
В литературе (11) имеется много доказательств связи между метаболизмом железа и диабетом 2 типа.Например, было показано (10) кровопускание для улучшения инсулинорезистентности и функции β-клеток при диабете с высоким содержанием ферритина. Кроме того, недавний отчет исследования здоровья медсестер (12) выявил сильную положительную взаимосвязь между запасами железа и риском диабета 2 типа. Перегрузка железом снижает чувствительность к инсулину в печени и метаболизм глюкозы в скелетных мышцах (11), что, возможно, способствует развитию диабета. Представленные здесь данные предполагают другой механизм, с помощью которого избыток железа может ухудшать инсулинорезистентность, т.е.е., увеличивая липолиз, повышая уровень циркулирующих FFA и, следовательно, способствуя инсулинорезистентности с помощью механизмов, описанных выше.
Таким образом, эти результаты демонстрируют, что нормальная человеческая сыворотка содержит высокомолекулярные компоненты, включая трансферрин и связанное с ним железо, которые увеличивают скорость липолиза в изолированных адипоцитах. Потребуются дальнейшие исследования для выяснения механизма (ов), с помощью которого трансферрин и железо регулируют липолиз, и для определения других липолитических компонентов нормальной сыворотки.
РИС. 1.Влияние сыворотки крови человека на липолиз. Выделенные адипоциты инкубировали при 37 ° C с различными концентрациями сыворотки крови человека, как указано. После 2-часовой инкубации измеряли высвобождение глицерина. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3). ED 50 , полумаксимальная эффективная доза.
РИС. 2.Динамика липолитического действия сыворотки крови. Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C с 0 (○), 0,1 (•) или 1% (□) сывороткой человека. В указанные моменты времени измеряли высвобождение глицерина.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
РИС. 3.Обратимость сывороточного действия. Изолированные адипоциты инкубировали с (•) или без (○) 1% сыворотки при 37 ° C в течение 1 ч, а затем отбирали аликвоту среды для измерения высвобождения глицерина. Затем клетки промывали свежей средой и инкубировали в течение 30 мин, и другую аликвоту отбирали для измерения высвобождения глицерина. Среду заменяли и отбирали аликвоты через 1, 2 и 3 часа. Через 3 часа во всех образцах измеряли высвобождение глицерина.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 4).
РИС. 4.Частичная очистка липолитической активности сыворотки. A : Сыворотку человека фракционировали на колонке G200. Изолированные адипоциты инкубировали с 20 мкл фракций G200 при 37 ° C в течение 2 ч и измеряли высвобождение глицерина (в наномолях на 0,5 мл). Строили график липолитической активности, где общий белок представлен относительной абсорбцией при A 280 нм . B : Сыворотку фракционировали на колонке с Q-сефарозой, используя градиент NaCl от 150 до 600 ммоль / л.Липолитическую активность из 20 мкл фракций выражали как высвобождение глицерина (в наномолях на 25 мкл) и наносили на график с общим белком, представленным относительной абсорбцией при A 280 нм . C : Фракции Q-сефарозы (1 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE, и белок визуализировали окрашиванием серебром.
РИС. 5.Влияние трансферрина человека на липолиз. Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч с различными концентрациями трансферрина человека, как указано, а затем измеряли высвобождение глицерина.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
РИС. 6.Влияние железа на липолиз. Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч с различными концентрациями гептагидрата сульфата железа, а затем измеряли высвобождение глицерина. Гептагидрат сульфата железа содержит 20,1% железа по весу. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
РИС. 7.Влияние ингибиторов протеинкиназы A ( A ) и MAP-киназы ( B ). A : Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа без добавок (□), 2% сыворотки крови человека (сыворотка, ) или 3 нмоль / л изопротеренола (IPT, ▪) в присутствии или в отсутствие 50 мкмоль / л H89. B : Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов с 1% сывороткой (сыворотка, ▪) в присутствии или в отсутствие 100 мкмоль / л PD98059. После инкубации измеряли высвобождение глицерина. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
РИС. 8.NALC подавляет действие сыворотки на липолиз. Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч без добавок (□), 1% сыворотки ( ) или 3 нмоль / л изопротеренола (IPT, ▪) в присутствии или отсутствии 3 ммоль / л NALC, а затем измеряли высвобождение глицерина.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3). A: Абсолютные скорости высвобождения глицерина. B: Данные выражены в процентах от скорости, определенной в отсутствие сыворотки или изопротеренола.
РИС. 9.Влияние побочного продукта перекисного окисления липидов, HNE, на липолиз. Изолированные адипоциты инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч с 1% сывороткой или указанными концентрациями HNE, а затем измеряли высвобождение глицерина. Средние значения ( n = 3) из репрезентативного эксперимента представлены на графике как процент от контроля ± стандартная ошибка.
Благодарности
Работа поддержана Фондом Стивена Кларка.
Сноски
- Принято 20 июля 2004 г.
- Получено 1 марта 2004 г.
- ДИАБЕТ
ССЫЛКИ
- ↵
глюконеогенеза жирными кислотами в перфузированной печени крыс. Proc Natl Acad Sci U S A56 : 247 –254,1966
- ↵
Бергман Р.Н., Миттельман С.Д.: Центральная роль адипоцитов в инсулинорезистентности.J Basic Clin Physiol Pharmacol9 : 205 –221,1998
- ↵
Randle PJ, Garland PB, Hales CN, Newsholme EA: Цикл жирных кислот глюкозы: его роль в чувствительности к инсулину и метаболических нарушениях при сахарном диабете. Lanceti : 785 –789,1963
- ↵
Бергман Р.Н., Ван Циттерс Г.В., Миттельман С.Д., Деа М.К., Гамильтон-Весслер М., Ким С.П., Элмер М.: Центральная роль адипоцитов в метаболическом синдроме. J Invest Med49 : 119 –126,2001
- ↵
Иган Б.М., Грин Э.Л., Гудфренд Т.Л .: Инсулинорезистентность и сердечно-сосудистые заболевания.Am J Hypertens14 : 116S –125S, 2001
- ↵
Burns TW, Hales CN, Stockell Hartree A: Наблюдения за липолитической активностью человеческой сыворотки и фракций гипофиза in vitro. J Эндокринол39 : 213 –225,1967
Curtis-Prior PB: Липолитические эффекты сыворотки и плазмы на изолированные жировые клетки крысы in vitro. Диабетология9 : 158 –160,1973
- ↵
Curtis-Prior PB: Липолитическая активность сыворотки и продуктов ее ультрафильтрации.Horm Metab Res5 : 305 , 1973
- ↵
Recant L, Alp H, Koch MB, Eggeman J: Активность диабетической сыворотки по высвобождению неэтерифицированных жирных кислот. Ланцет II : 614 –616,1963
- ↵
Fernández-Real JM, Peñarroja G, Castro A, García-Bragado F, Hernández-Aguado I, Ricart W: Кровопускание при диабете с высоким содержанием ферритина 2 типа: влияние на чувствительность к инсулину и Функция β-клеток. Сахарный диабет51 : 1000 –1004,2002
- ↵
Fernández-Real JM, Lopez-Bermejo A, Ricart W: Перекрестный разговор между метаболизмом железа и диабетом.Сахарный диабет51 : 2348 –2354,2002
- ↵
Цзян Р., Мэнсон Дж. Э., Мейгс Дж. Б., Ма Дж., Рифаи Н., Ху Ф.Б .: Запасы железа в организме в отношении риска диабета 2 типа у практически здоровых женщин. JAMA291 : 711 –717,2004
- ↵
Грин A, Джонсон Дж. Л., Миллиган G: Подавление подтипов Gi путем длительной инкубации адипоцитов с агонистом аденозинового рецептора A1. J Biol Chem265 : 5206 –5210,1990
- ↵
Грин А, Миллиган Г., Добиас С.Б.: Даун-регуляция Gi как механизм гетерологичной десенсибилизации в адипоцитах.J Biol Chem267 : 3223 –3229,1992
- ↵
Gasic S, Green A: G i подавление и гетерологичная десенсибилизация в адипоцитах после обработки агонистом α 2 , Великобритания 14304. Biochem Pharmacol49 : 785 –790,1995
- ↵
Bradford MM: Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах с использованием принципа связывания белок-краситель. Анальный секс Biochem72 : 248 –254,1976
- ↵
Stadtman ER, Levine RL: Окисление белков.Энн Н. Й. Акад. Sci 899 : 191 –208,2000
- ↵
Рейхолькова М., Вильгельм Дж., Свобода П.: Перекисное окисление липидов ингибирует стимулированный норэпинефрином липолиз в адипоцитах крыс: снижение числа бета-адреноцепторов. Biochem Biophys Res Commun150 : 802 –810,1988
- ↵
Schrauwen P, Hesselink MKC: Окислительная способность, липотоксичность и повреждение митохондрий при диабете 2 типа. Диабет53 : 1412 –1417,2004
- ↵
Тодоров П.Т., МакДевитт TM, Мейер Д.Дж., Уэяма Х., Окубо И., Тисдейл М.Дж.: Очистка и характеристика липид-мобилизирующего фактора опухоли.Рак Res58 : 2353 –2358,1998
- ↵
Хан С., Тисдейл MJ: Катаболизм жировой ткани под действием липид-мобилизирующего фактора, продуцируемого опухолью. Инт J Рак80 : 444 –447,1999
- ↵
Hotamisligil GS, Spiegelman BM: Фактор некроза опухоли α: ключевой компонент связи ожирения и диабета. Диабет43 : 1271 –1278,1994
- ↵
Gasic S, Tian B, Green A: Фактор некроза опухоли-α стимулирует липолиз в адипоцитах, снижая концентрацию белка G i .J Biol Chem274 : 6770 –6775,1999
Green A, Dobias SB, Walters DJA, Brasier AR: Фактор некроза опухоли увеличивает скорость липолиза в первичных культурах адипоцитов без изменения уровней гормоночувствительной липазы. Эндокринология134 : 2581 –2588,1994
Розенсток М., Гринберг А.С., Рудич А: Четкое долгосрочное регулирование высвобождения глицерина и неэтерифицированных жирных кислот инсулином и TNF-α в адипоцитах 3T3 – L1. Диабетология44 : 55 –62,2001
- ↵
Souza SC, Yamamoto MT, Franciosa MD, Lien P, Greenberg AS: BRL 49653 блокирует липолитическое действие фактора некроза опухоли альфа: потенциальный новый механизм сенсибилизации к инсулину для тиазолидиндионов.Диабет47 : 691 –695,1998
- ↵
Чен X, Икбал Н., Боден Г.: Влияние свободных жирных кислот на глюконеогенез и гликогенолиз у нормальных субъектов. Дж Клин Инвест103 : 365 –372,1999
Griffin ME, Marcucci MJ, Cline GW, Bell K, Barucci N, Lee D, Goodyear LJ, Kraegen EW, White MF, Shulman GI: инсулинорезистентность, вызванная свободными жирными кислотами, связана с активация протеинкиназы Cθ и изменения в сигнальном каскаде инсулина.Диабет48 : 1270 –1274,1999
Kruszynska YT, Worrall DS, Ofrecio J, Frias JP, Macaraeg G, Olefsky JM: Инсулинорезистентность, индуцированная жирными кислотами: снижение активации PI3K в мышцах, но неизменное фосфорилирование Akt. J Clin Endocrinol Metab87 : 226 –234,2002
- ↵
McGarry JD: Взаимодействие глюкозы и жирных кислот в здоровье и болезнях. Am J Clin Nutr67 (Дополнение) : 500S –504S, 1998
- ↵
Миттельман С.Д., Бергман Р.Н.: Ингибирование липолиза вызывает подавление выработки эндогенной глюкозы независимо от изменений инсулина.Am J Physiol Endocrinol Metab279 : E630 –E637,2000
- ↵
Roden M, Price TB, Perseghin G, Petersen KF, Rothman DL, Cline GW, Shulman GI: Механизм индуцированной свободными жирными кислотами инсулинорезистентности у людей. J Clin Invest97 : 2859 –2865,1996
- ↵
Mittelman SD, Fu Y-Y, Rebrin K, Steil G, Bergman RN: Непрямое действие инсулина на подавление эндогенной продукции глюкозы является доминирующим даже при гиперглюкагонемии. J Clin Invest100 : 3121 –3130,1997
- ↵
Фейнгольд К.Р., Грюнфельд К. Роль цитокинов в индукции гиперлипидемии.Диабет41 (Приложение 2) : 97 –101,1992
- ↵
Aisen P, Leibman A, Zweier J: Стехиометрические и сайтные характеристики связывания железа с трансферрином человека. J Biol Chem253 : 1930 –1937,1978
- ↵
Davis RJ, Corvera S, Czech MP: Инсулин стимулирует поглощение клеточного железа и вызывает перераспределение внутриклеточных рецепторов трансферрина в плазматическую мембрану. J Biol Chem261 : 8708 –8711,1986
Катехоламин-индуцированный липолиз вызывает диссоциацию комплекса mTOR и ингибирует захват глюкозы в адипоцитах
Значение
Жировая ткань поддерживает метаболический гомеостаз во время голодания и питания.Когда питательных веществ много, анаболические сигналы опосредуются инсулином, стимулируя адипоциты поглощать глюкозу для хранения энергии. В отсутствие питательных веществ катаболическая передача сигналов инициирует липолиз или высвобождение липидов для использования энергии и опосредуется катехоламинами. Эти противоположные пути эволюционно законсервированы и предотвращают бесполезные циклы, но могут привести к метаболическим нарушениям, таким как резистентность к инсулину, если их не регулировать должным образом. Здесь мы определяем новый механизм, посредством которого липолиз подавляет инсулино-стимулированное поглощение глюкозы адипоцитами.Этот сигнальный механизм, вероятно, способствует инсулинорезистентности, когда липолиз активен, например, во время сильного стресса или ожирения, и это новое понимание может привести к новым подходам к лечению гипергликемии.
Abstract
Анаболическая и катаболическая передача сигналов противостоят друг другу в жировой ткани для поддержания клеточного и организменного гомеостаза, но эти пути часто не регулируются при метаболических нарушениях. Хотя давно установлено, что стимуляция β-адренорецептора ингибирует инсулино-стимулированный захват глюкозы в адипоцитах, механизм остается неясным.Здесь мы сообщаем, что β-адренергическое ингибирование захвата глюкозы требует липолиза. Мы также показали, что липолиз подавляет захват глюкозы, ингибируя мишень рапамицина (mTOR) 1 и 2 у млекопитающих посредством диссоциации комплекса. Кроме того, мы показываем, что продукты липолиза ингибируют mTOR посредством диссоциации комплекса in vitro. Эти находки раскрывают ранее нераспознанный внутриклеточный сигнальный механизм, посредством которого липолиз блокирует путь фосфоинозитид-3-киназа-Akt-mTOR, что приводит к снижению захвата глюкозы.Этот ранее неустановленный механизм регуляции mTOR, вероятно, способствует развитию инсулинорезистентности.
Жировая ткань играет важную роль в поддержании энергетического гомеостаза всего тела, накапливая или высвобождая питательные вещества. Этот баланс контролируется противоположными сигнальными путями, где анаболические процессы активируются инсулином (INS), а катаболические действия активируются катехоламинами. Важный безответный вопрос в биологии жировой ткани заключается в том, как индуцированная катехоламином β-адренергическая передача сигналов противодействует стимулированному инсулином захвату глюкозы (1-6).Удивительно, но основной механизм этого хорошо установленного физиологического ответа в адипоцитах до сих пор неизвестен.
Когда питательных веществ много, инсулин высвобождается поджелудочной железой и стимулирует абсорбцию глюкозы и жирных кислот в жировой ткани, где они упаковываются и хранятся в виде триацилглицерина (ТАГ) в каплях клеточного липида. Передача сигналов инсулина в адипоцитах обеспечивается путем фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) –Akt – mTOR. mTOR — это высококонсервативная серин / треониновая протеинкиназа, которая функционирует в любом из двух различных мультипротеиновых комплексов: mTOR-комплекс 1 (mTORC1) и mTOR-комплекс 2 (mTORC2).mTORC1 определяется прежде всего ассоциацией mTOR с raptor, тогда как mTORC2 включает mTOR с rictor (7). Важно отметить, что фосфорилирование mTORC2 Akt по S473 необходимо для активности Akt на AS160, что необходимо для захвата глюкозы в ответ на инсулин (8–11). Следует отметить, что как для mTORC1, так и для mTORC2 целостность этих белковых комплексов важна для специфичности субстрата киназы и правильной передачи сигналов (12, 13).
Во время голодания или стресса катехоламины высвобождаются симпатической нервной системой для активации липолиза.Стимуляция β-адренорецептора на адипоцитах активирует аденилатциклазу (AC), что приводит к повышению активности цАМФ и протеинкиназы A (PKA). PKA инициирует липолиз путем прямого фосфорилирования гормоночувствительной липазы (HSL) и перилипина (14⇓ – 16) и непрямой активации липазы триглицеридов жиров (ATGL) (17⇓ – 19). Липолиз включает гидролиз ТАГ, хранящегося в липидной капле, с образованием диацилглицерина (ДАГ), моноацилглицерина (МАГ), жирных кислот и глицерина. Эти липолитические продукты являются важными энергетическими субстратами, которые могут действовать как предшественники других липидов и влиять на передачу сигналов в клетках.Однако их потенциальная роль как сигнальных молекул недооценивается (20).
В этом исследовании мы раскрываем механизмы, которые связывают β-адренергическую стимуляцию с ингибированием инсулино-стимулированного захвата глюкозы. А именно, мы показываем, что активация липолиза имеет решающее значение. Более того, мы обнаружили, что сами продукты липолиза вызывают ингибирование mTOR за счет диссоциации комплекса, что ингибирует захват глюкозы в адипоцитах. Этот механизм регуляции mTOR (т.е. путем диссоциации комплекса) имеет большое значение для регуляции клеточного метаболизма и, вероятно, способствует стресс-индуцированной гипергликемии и инсулинорезистентности, вызванной ожирением.
Результаты
Ингибирование захвата глюкозы, индуцированное катехоламином, и передача сигналов инсулина требует липолиза.
Мыши, лишенные ATGL, демонстрируют улучшенную толерантность к глюкозе и устойчивы к инсулинорезистентности, вызванной диетой с высоким содержанием жиров (21⇓ – 23). Дефицит ATGL также улучшает передачу сигналов инсулина в белой жировой ткани (21). Эти наблюдения указывают на то, что липолиз вызывает инсулинорезистентность. Кроме того, известно, что стимуляция β-адренорецептора в изолированных адипоцитах резко ингибирует стимулируемое инсулином поглощение глюкозы (2, 3, 6).Чтобы исследовать возможную роль липолиза в эффектах действия катехоламинов, мы сравнили поглощение глюкозы в первичных адипоцитах мышей WT и ATGL — / — во время лечения изопротеренолом, агонистом β-адренергических рецепторов. Как сообщалось ранее, изопротеренол ингибировал захват глюкозы в адипоцитах дикого типа; однако здесь мы показываем, что это ингибирование было устранено в отсутствие ATGL (фиг. 1 A и фиг. S1 A ). Как и ожидалось, липолиз эффективно блокировался в адипоцитах ATGL — / — даже во время лечения изопротеренолом (рис.S1 B ). Восстановление поглощения глюкозы также наблюдалось в культивируемых адипоцитах 3T3-L1 после ингибирования липазы с помощью E600, общего ингибитора липазы, который необратимо связывается с активным центром липаз (фиг. S1 C ). Кроме того, передача сигналов инсулина, необходимая для транслокации GLUT4, была восстановлена в адипоцитах ATGL — / — по сравнению с WT (фиг. 1 B и фиг. S1 D и E ). Взятые вместе, эти данные показывают, что липолиз необходим для опосредованного катехоламином ингибирования захвата глюкозы адипоцитами.
Рис. 1.Индуцированное катехоламином ингибирование захвата глюкозы и передачи сигналов инсулина требует липолиза. ( A ) Анализ поглощения глюкозы с радиоактивной меткой в WT по сравнению с первичными адипоцитами мыши ATGL — / — . Изолированные адипоциты обрабатывали инсулином (10 нМ) или без него в присутствии или в отсутствие изопротеренола (0,1 мкМ) в течение 30 минут, а затем [U- 14 C] -d-глюкозы (10 мкМ) в течение 20 минут. Все анализы содержали аденозиндезаминазу (ADA) (2 единицы / мл). ( B ) Вестерн-блоттинг-анализ передачи сигналов инсулина в первичных адипоцитах мыши WT и ATGL — / — , обработанных как в A , перед добавлением глюкозы.Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов. Звездочки указывают на значительную разницу (*** P <0,001).
Путь β-адренергического / цАМФ ухудшает передачу сигналов инсулина, ингибируя комплексы mTOR.
Подобно изопротеренол-опосредованному ингибированию передачи сигналов инсулина, обработка адипоцитов форсколином, мощным активатором AC, ингибирует передачу сигналов инсулина (4, 5). Мы обнаружили, что действие форсколина значительно ингибировало mTORC1 и -2 в ответ на инсулин, что измерялось по фосфорилированию S6K (T389) и Akt (S473), соответственно (рис.2 А ). Хотя передача сигналов ниже комплексов mTOR была ингибирована, передача сигналов выше по течению не затрагивалась, как показано фосфорилированием тирозина рецептора инсулина и PDK1-опосредованным фосфорилированием Akt в T308 (фиг. 2 A ). Аналогичные результаты наблюдались в первичных адипоцитах крыс, обработанных изопротеренолом перед стимуляцией инсулином (фиг. S2 A ), и ингибирование AS160 как в культивируемых адипоцитах 3T3-L1, так и в первичных адипоцитах крыс (фиг. 2 A и фиг.S2 A ) демонстрирует, что активность AC играет роль в ослаблении поглощения глюкозы. Эффекты активности AC на mTOR были подтверждены обработкой проницаемым через мембрану аналогом цАМФ cpt-cAMP, ингибитором фосфодиэстеразы (PDE) 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) и изопротеренолом, демонстрируя, что повышенного уровня цАМФ достаточно для ингибирования mTOR. в адипоцитах (рис. 2 B и рис. S2 B ). Активацию липолиза адипоцитов измеряли по фосфорилированию HSL (рис.2 A и B и рис. S2 A ) и высвобождение глицерина (рис. S2 C и D ). Кроме того, обработка форсколином не влияла на фосфорилирование хищника AMPK (рис. S2 E ). Интересно, что форсколин не ингибирует передачу сигналов инсулина в фибробластах 3T3-L1 перед дифференцировкой в адипоциты или в первичные гепатоциты мыши (рис. S2 F ). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что активность цАМФ ингибирует mTOR в адипоцитах, что может играть роль в наблюдаемом вызванном катехоламином снижении поглощения глюкозы.
Рис. 2.Путь β-адренорецепторов / цАМФ нарушает передачу сигналов инсулина, ингибируя комплексы mTOR. ( A ) Вестерн-блоттинг и количественный анализ культивированных адипоцитов 3T3-L1, обработанных форсколином или без него (FSK, 10 мкМ), рапамицином (Rap, 20 нМ) или Torin1 (250 нМ) за 30 минут до лечения инсулином (INS , 10 нМ) в течение 15 мин. ( B ) Вестерн-блоттинг и количественный анализ культивированных адипоцитов 3T3-L1, обработанных форсколином или без него (FSK, 10 мкМ), Cpt-cAMP (Cpt, 100 мкМ), изопротеренолом (ISO, 5 мкМ) или IBMX (200 мкМ). мкМ) за 30 мин до лечения инсулином (INS, 10 нМ) за 15 мин.Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов. Звездочки указывают на значительную разницу (* P <0,05 или ** P <0,01, соответственно).
cAMP-опосредованное ингибирование mTOR требует PKA и липазной активности.
Основная роль цАМФ в адипоцитах заключается в активации PKA, что приводит к липолизу за счет активации липазы и фосфорилирования перилипина (14⇓ – 16). Чтобы исследовать механизм cAMP-опосредованного ингибирования mTOR, мы фармакологически ингибировали PKA во время лечения форсколином и инсулином.АТФ-конкурентный ингибитор PKA, H89, значительно ингибировал активность PKA и восстанавливал активность как mTORC1, так и -2 в ответ на инсулин (фиг. 3 A и C ). Кроме того, блокирует действие липазы с помощью E600; атглистатин, специфический ингибитор ATGL; или CAY10499, специфический ингибитор HSL, обращал опосредованное цАМФ ингибирование mTOR (фиг. 3 B и C и фиг. S3 A ). Интересно, что блокирование действия липазы индуцировало фосфорилирование S6K во время лечения одним форсколином (рис.3 B ), тогда как адипоциты постоянно демонстрируют ингибирование mTORC1 в ответ на повышенный уровень цАМФ (24–26). Эта, казалось бы, парадоксальная тенденция может быть похожа на активацию цАМФ mTORC1 в других типах клеток (27), когда ингибирующие эффекты липолиза отсутствуют. Этого не наблюдалось в активности mTORC2 на Akt (фиг. 3 B ). Ингибирование липазы также блокировало липолиз, что измерялось по высвобождению глицерина (фиг. S3 B ). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что повышенный уровень цАМФ действует через PKA и активацию липолиза, нарушая активность mTOR в адипоцитах.
Рис. 3.cAMP-опосредованное ингибирование mTOR требует активности PKA и липазы. ( A ) Вестерн-блоттинг культивированных адипоцитов 3T3-L1, предварительно обработанных H89 (10 мкМ) в течение 20 минут перед обработкой форсколином и инсулином, как на фиг. 2 A . ( B ) Вестерн-блот-анализ культивированных адипоцитов 3T3-L1, предварительно обработанных диэтил-п-нитрофенилфосфатом (E600, 150 мкМ) или атглистатином (10 мкМ) перед обработкой форсколином и инсулином, как на фиг. 2 A . ( C ) Количественный анализ pS6K (T389) и pAKT (S473) из экспериментов в A и B .Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов. Звездочки указывают на значительную разницу (* P <0,05 или ** P <0,01, соответственно).
Липолитические продукты ингибируют активность mTOR in vitro.
Липолиз производит DAG, MAG, жирные кислоты и глицерин за счет действия липазы на TAG. Чтобы определить, ответственны ли эти липолитические продукты за опосредованное липолизом ингибирование mTOR, мы исследовали их способность ингибировать очищенный рекомбинантный mTOR (рис.4 A ) in vitro. Мы экстрагировали липиды из адипоцитов, обработанных липолитическими агентами форсколином или изопротеренолом или без них, и включили эти липиды в анализы киназы mTOR. Мы показываем, что липиды, экстрагированные из культивируемых адипоцитов, подвергающихся липолизу, последовательно ингибировали mTOR, тогда как липиды из контрольных клеток не имели никакого эффекта (фиг. 4 B и фиг. S4 A ). Липиды, экстрагированные из первичных адипоцитов мышей дикого типа, показали аналогичные результаты; однако липиды из контрольных или обработанных изопротеренолом адипоцитов мыши ATGL — / — не влияли на mTOR (рис.4 С ). Важно отметить, что хотя липиды, экстрагированные из контрольных клеток, не ингибировали mTOR, обработка липидов липазой in vitro действительно генерировала ингибирующие липиды (фиг. 4 D ). Чтобы исследовать, какие липиды могут быть ответственны за ингибирование mTOR, мы включили определенные жирные кислоты или глицеролипиды в анализ киназы mTOR. Они не показали значительного влияния на активность mTOR (фиг. 4 E ), что позволяет предположить, что это может быть конкретный липид, высвобождающийся во время липолиза, а не липолитические продукты в целом, которые ингибируют mTOR.Чтобы убедиться, что активность киназы была обусловлена исключительно очищенным mTOR, мы показали полное ингибирование Torin1 (фиг. S4 B ) и кинетический анализ активности mTORC1 in vitro (фиг. S4 C ). Эти данные демонстрируют, что липолитические продукты ингибируют mTOR in vitro, предполагая, что они могут способствовать индуцированному катехоламинами ингибированию захвата глюкозы в адипоцитах.
Рис. 4.Липолитические продукты ингибируют активность mTOR in vitro. ( A ) Окрашивание Кумасси при очистке рекомбинантного mTORC1, показывающее mTOR (верхняя полоса) и raptor (нижняя полоса).( B ) Анализы радиоактивной киназы mTOR in vitro с использованием очищенного рекомбинантного mTORC1 и 4E-BP1 в качестве субстрата. Липидный носитель или липиды, экстрагированные из культивированных адипоцитов 3T3-L1, обработанных форсколином или без него (FSK, 10 мкМ) в течение 30 минут, не добавляли в анализ за 10 минут до добавления [γ- 32 P] -ATP. ( C ) Анализ киназы mTOR, как в B , с использованием липидов, экстрагированных из первичных адипоцитов мышей WT или ATGL — / — после обработки изопротеренолом (ISO, 10 мкМ) или без него в течение 30 минут.( D ) Анализы киназы mTOR, как в B , с использованием липидов, экстрагированных из культивированных адипоцитов 3T3-L1. Липиды обрабатывали липазой или без нее in vitro перед добавлением их в анализ киназы mTOR. ( E ) Анализы киназы mTOR, как в B , где DAG (в частности, 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицерин), MAG (в частности, 2-олеоил-глицерин), олеат или пальмитат были добавлены, как указано . Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов. Звездочки указывают на значительную разницу (* P <0.05 или ** P <0,01 соответственно).
Липолитические продукты ингибируют mTOR посредством комплексной диссоциации.
В наших попытках очистить mTOR из адипоцитов мы наблюдали, что комплексы mTOR 1 и 2 диссоциировали в клетках, обработанных форсколином, по сравнению с контролем (фиг. 5 A и фиг. S5 A ). Подобно спасению передачи сигналов mTOR, показанному на фиг.3 B и C , атглистатин спасает ассоциацию mTORC1 и -2 в культивируемых адипоцитах (фиг.5 B ), предполагая, что механизм индуцированного форсколином ингибирования mTOR происходит через диссоциацию комплекса mTOR. В дополнение к данным по захвату глюкозы и передаче сигналов инсулина на фиг. 1, диссоциация mTORC2 также наблюдалась у WT и спасалась в первичных адипоцитах мыши ATGL — / — (фиг. 5 C ). Эти данные демонстрируют, что липолиз необходим для наблюдаемой диссоциации комплекса mTOR. Кроме того, липидные экстракты из культивированных адипоцитов, обработанных форсколином, вызывали диссоциацию комплекса mTOR in vitro, тогда как липиды из адипоцитов, обработанных носителем, не влияли на комплекс (рис.S5 B ). Чтобы количественно показать диссоциацию mTOR in vitro, мы очистили комплекс mTOR с флуоресцентной меткой, состоящий из меченого Венерой mTOR и меченного Cerulean хищника или риктора (фиг. 5 D ). Этот рекомбинантный комплекс mTOR был полезен, поскольку флуоресцентные белковые метки могут быть обнаружены спектрофотометрически. В нашем анализе диссоциации mTOR обнаруженная эмиссия Венеры или Cerulean непосредственно представляет присутствие mTOR или raptor / rictor, соответственно (рис. S5 C ), и диссоциация может быть эффективно и количественно определена in vitro.Мы использовали этот анализ, чтобы показать, что липиды, экстрагированные из адипоцитов, обработанных форсколином, диссоциируют mTORC1 и -2 in vitro, тогда как липиды, экстрагированные из необработанных клеток, метаболиты, которые распределяются в водную фазу, или липиды из фибробластов 3T3-L1 перед дифференцировкой или первичные гепатоциты. нет эффекта (рис. 5 E ). В дополнение к передаче сигналов инсулина, показанной на фиг. 3, ингибирование липазы также блокирует диссоциацию mTOR (фиг. 5 F ). Липиды, полученные в результате обработки экстрактов клеток адипоцитов липазой in vitro, также вызывали диссоциацию mTOR, тогда как липиды, обработанные носителем, не вызывали (рис.5 G ). Взятые вместе, эти данные показывают, что липолитические продукты способствуют ингибированию mTOR за счет диссоциации комплекса mTOR.
Рис. 5.Липолитические продукты ингибируют mTOR за счет диссоциации комплекса. ( A ) Вестерн-блот-анализ коиммунопреципитации mTORC1 и mTORC2 против raptor и rictor, соответственно, где культивированные адипоциты обрабатывали форсколином (FSK, 10 мкМ), рапамицином (Rap, 20 нМ) или торином1 (250 нМ) или без него. за 30 мин до лечения инсулином (INS, 10 нМ) за 15 мин.( B ) Вестерн-блот-анализ коиммунопреципитации mTORC1 и mTORC2 против mTOR, где культивированные адипоциты обрабатывали атглистатином (10 мкМ) или без него в течение 1 ч перед обработкой форсколином и инсулином, как в A . ( C ) Вестерн-блот-анализ ассоциации mTORC2 с использованием коиммунопреципитации против mTOR, где первичные адипоциты мыши WT или ATGL — / — обрабатывали инсулином или без него (10 нМ) в присутствии или в отсутствие изопротеренола (0.1 мкМ) в течение 30 мин, как на фиг.1 A и B перед добавлением глюкозы. ( D ) Иллюстративное представление анализа диссоциации mTOR. ( E ) Анализ диссоциации mTOR, в котором культивированные адипоциты 3T3-L1 обрабатывали форсколином или без него (10 мкМ) перед лизисом клеток и органической экстракцией ( Материалы и методы ). Очищенные флуоресцентно меченые mTORC1 или mTORC2 инкубировали либо с лизатом, либо с экстрагированными органическими или водными фазами культивированных адипоцитов или лизатом фибробластов или гепатоцитов в течение 30 минут перед промывкой и обнаружением флуоресценции.( F ) Анализ диссоциации mTOR, в котором культивированные адипоциты 3T3-L1 обрабатывали ДМСО в качестве контроля, диэтил-п-нитрофенилфосфатом (E600, 150 мкМ) или атлистатином (10 мкМ) перед обработкой форсколином и инкубацией с флуоресцентным mTOR, как в . E . ( G ) Анализ диссоциации mTOR, в котором липиды экстрагировали из культивированных адипоцитов 3T3-L1 и обрабатывали липазой или без нее in vitro, а затем инкубировали с mTOR, как в E . Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов.# указывает на значительное отличие от контроля ( # P <0,0001).
Ингибирование захвата глюкозы, индуцированное торином-1, не зависит от липолиза.
Активность mTOR необходима для облегчения индуцированного инсулином захвата глюкозы адипоцитами (8–11). Здесь мы показываем, что стимуляция изопротеренолом β-адренергического рецептора и прямое ингибирование mTOR с помощью Torin1 ингибируют захват глюкозы в первичных адипоцитах мышей дикого типа, тогда как одного прямого ингибирования mTOR достаточно для блокирования захвата глюкозы в отсутствие ATGL (рис.6 А ). Кроме того, в то время как стимуляция β-адренергического рецептора подавляет передачу сигналов инсулина только в адипоцитах WT (фиг. 1 B и фиг. S1 D и E ), Torin1 ингибирует передачу сигналов инсулина как в WT, так и в ATGL — / — адипоцитов (рис.6 B ). Взятые вместе, эти данные предполагают, что ингибирование mTOR липолизом является вероятным механизмом индуцированного катехоламином ингибирования захвата глюкозы в адипоцитах.
Рис. 6.Ингибирование захвата глюкозы, индуцированное Torin1, не зависит от липолиза.( A ) Анализ поглощения глюкозы с радиоактивной меткой в WT по сравнению с первичными адипоцитами мыши ATGL — / — . Изолированные адипоциты обрабатывали или без Torin1 (250 нМ) в течение 10 минут перед обработкой или без инсулина (10 нМ) в присутствии или в отсутствие изопротеренола (0,1 мкМ) в течение 30 минут с последующим добавлением [U- 14 C] -d-глюкоза (10 мкМ) в течение 20 мин. Все анализы содержали аденозиндезаминазу (ADA) (2 единицы / мл). ( B ) Вестерн-блоттинг-анализ передачи сигналов инсулина в первичных адипоцитах мыши WT и ATGL — / — , обработанных как в A , перед добавлением глюкозы.( C ) Иллюстрация предложенного механизма, связывающего стимуляцию β-адренорецептора с нарушением захвата глюкозы адипоцитами. Каждый график представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех экспериментов. Звездочки указывают на значительную разницу (*** P <0,001).
Обсуждение
Главный вывод этого исследования заключается в том, что липолиз резко ингибирует стимулируемое инсулином поглощение глюкозы в адипоцитах. Способность катехоламинов снижать захват глюкозы адипоцитами известна в течение десятилетий и неоднократно подтверждена документально (2-6), но механизм остается неясным.Здесь мы не только показываем, что липолиз необходим для опосредования этого ингибирования поглощения глюкозы, но и что механизм ингибирования может происходить через диссоциацию комплексов mTOR и последующее ингибирование стимулируемой инсулином активности Akt. Интересно, что передача сигналов mTOR и комплексная ассоциация восстанавливаются, когда липолиз ингибируется, а липолитические продукты, которые распределяются в органическую фазу, способны напрямую диссоциировать mTOR in vitro, предполагая, что эти липиды могут действовать как сигнальные молекулы для регулирования действия инсулина.Липолитические продукты, произведенные in vitro, также ингибируют mTOR посредством диссоциации, что позволяет предположить, что дальнейшая ферментативная активность не требуется для липолиза, чтобы опосредовать эти эффекты на mTOR. Хотя недавно было показано, что липолитические продукты могут активировать рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом (PPAR) α и δ (28), потенциально влияя на передачу сигналов инсулина через экспрессию PTEN, наши открытия, что липолиз не влияет на передачу сигналов инсулина выше mTOR, предполагает, что это не так. механизм инсулинорезистентности в нашей модели.
Липотоксичность — одна из исследуемых гипотез для объяснения механизмов, с помощью которых ожирение вызывает инсулинорезистентность. Также известная как теория липидных метаболитов, липотоксичность характеризуется избытком липидов, которые могут действовать как сигнальные молекулы, подавляя передачу сигналов инсулина (29–31). Предыдущие данные показали, что инсулинорезистентность часто связана с накоплением липидов в печени и скелетных мышцах, а высокий уровень циркулирующих липолитических продуктов может коррелировать с ожирением и инсулинорезистентностью при диабете 2 типа (32, 33).Важно отметить, что накопление липидов в печени, как было показано, специфически ингибирует передачу сигналов инсулина за счет снижения целостности и активности комплекса mTORC2 (34). Кроме того, уровни базального липолиза повышаются при ожирении (35, 36), а снижение липолиза из-за дефицита липазы у мышей снижает резистентность к инсулину, вызванную диетой (22, 37). Взятые вместе, эти наблюдения предполагают участие липолитических продуктов в развитии инсулинорезистентности, и здесь мы демонстрируем, что липиды, высвобождаемые во время липолиза, оказывают локальное влияние на передачу сигналов mTOR и стимулируемое инсулином поглощение глюкозы в адипоцитах.
Хотя инсулинорезистентность зависит от действия инсулина во многих тканях, у мышей GLUT4 — / — , специфичных для жировой ткани, развивается системная инсулинорезистентность и гипергликемия (38), тогда как гиперэкспрессия GLUT4, специфическая для жировой ткани, приводит к повышенной чувствительности к инсулину in vivo (39). Это указывает на то, что нарушения действия инсулина только в жировой ткани достаточно для развития инсулинорезистентности и гипергликемии всего тела. Наша предыдущая работа также демонстрирует, что нарушение действия инсулина из-за снижения экспрессии риктора в жировой ткани приводит к инсулинорезистентности всего тела и гипергликемии (11).Взятые вместе, наша работа показывает ингибирование комплекса mTOR как остро регулируемое событие, которое приводит к нарушению передачи сигналов инсулина в адипоцитах, что может влиять на развитие системной инсулинорезистентности. Это исследование также демонстрирует ранее не идентифицированный механизм диссоциации и ингибирования комплекса mTOR липолитическими продуктами. Этот механизм подчеркивает важность липолиза в регуляции клеточных сигнальных событий как потенциального следствия высвобождения запасов энергии.
В дополнение к механистическим деталям противоположных действий анаболической и катаболической передачи сигналов в жировой ткани, наши результаты прямо указывают на липолиз как на механизм, лежащий в основе резистентности жировой ткани к инсулину во время острых стрессовых событий, и могут дать представление об инсулинорезистентности, вызванной ожирением.Острая гипергликемия часто развивается после травмы или серьезного хирургического вмешательства, особенно хирургического вмешательства в брюшной полости (40), после тяжелых ожоговых травм или сепсиса. При отсутствии лечения это состояние, называемое гипергликемией, вызванной стрессом, способствует смертности и задерживает заживление послеоперационных больных и пациентов в отделениях интенсивной терапии (41). Хотя влияние стресса на действие инсулина хорошо известно, механистическая связь остается неясной. Реакция на стресс — это эволюционная адаптация, которая сохраняет глюкозу для жизненно важных тканей, таких как мозг, во время травмы.Этот ответ характеризуется быстрой активацией нейроэндокринной и воспалительной систем, вызывающей метаболическое состояние стресса. В результате анаболические процессы подавляются, тогда как катаболические процессы, такие как липолиз, усиливаются, высвобождая субстраты для заживления тканей (41–43). Наше открытие о том, что липолиз играет ключевую роль в снижении передачи сигналов инсулина, предполагает, что он может быть фактором, способствующим развитию гипергликемии, вызванной стрессом.
У людей с ожирением, хотя катехоламиновая стимуляция липолиза иногда ослаблена, базальные уровни липолиза обычно повышены.Таким образом, помимо острых событий, исследованных в этом отчете, интересно рассмотреть роль липолиза и ингибирования сигнальных путей mTOR в жировой ткани в развитии инсулинорезистентности, вызванной ожирением, с течением времени. Помимо β-адренергической стимуляции, липолиз усиливается воспалительными цитокинами, натрийуретическими пептидами, гормонами роста и кортизолом (44), подчеркивая, что многие факторы могут вносить свой вклад в этот механизм инсулинорезистентности.Хотя мы показали, что острая стимуляция липолиза может ингибировать захват глюкозы за счет диссоциации комплекса mTOR, необходимы дальнейшие исследования для определения вклада липолиза в инсулинорезистентность, вызванную ожирением.
В этом исследовании мы определили новый механизм передачи сигналов адипоцитов, посредством которого липолитические продукты диссоциируют комплексы mTOR, что приводит к снижению стимулируемого инсулином захвата глюкозы (рис. 6 C ). Эта модель имеет значение для инсулинорезистентности, вызванной ожирением, и гипергликемии, вызванной стрессом, и демонстрирует, что липолитические продукты могут действовать как сигнальные молекулы для регулирования клеточных процессов.Это также дает представление о механизмах противоположной регуляции анаболической и катаболической передачи сигналов в жировой ткани.
Материалы и методы
Экстракция липидов и диссоциация mTOR in vitro.
Адипоциты 3T3-L1 из 6-см планшетов или 100 мкл упакованных изолированных адипоцитов дважды промывали PBS, гомогенизировали в 100 мкл буфера A (1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 0,1% Tween 20, 10 мМ фосфат натрия и 50 мМ β-глицерофосфат, pH 7,4), с добавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина, 10 мкг / мл пепстатина и 0.LR микроцистина 5 мкм и гомогенаты центрифугировали при 16000 × g в течение 10 мин. Всего добавляли 400 мкл гексана / этилацетата (1: 1) и смешивали с супернатантами в течение 30 минут с последующим центрифугированием при 8000 × g в течение 2 минут. Водную и органическую фазы разделяли и органический растворитель выпаривали. Высушенный липидный остаток солюбилизировали суспензией в буфере А (содержащий 0,1% Твин 20) и смешивали с флуоресцентно меченным иммунным комплексом mTOR-Raptor или mTOR-Rictor на шариках в течение 30 мин при комнатной температуре.Затем шарики трижды промывали, переносили в 96-луночный планшет и определяли выбросы Венеры и Церулеана. Для обработки липазой in vitro ресуспендированные липиды обрабатывали липазой (2 единицы / мл) в течение 30 минут при комнатной температуре и липиды реэкстрагировали, как описано. Рекомбинантные флуоресцентно меченые комплексы mTOR-Raptor и mTOR-Rictor были созданы путем временной трансфекции в клетки HEK293T с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Плазмиды HA-Venus-mTOR и FLAG-Cerulean-Raptor / FLAG-Cerulean-Rictor трансфицировали с использованием 40 и 10 мкг плазмиды на 15-см планшет, соответственно, и липофектамина 2000 при соотношении ДНК: липофектамин 2: 1.
Статистический анализ.
Значения выражены как средние значения ± SEM. Сравнение между двумя группами одного и того же лечения (стимулированного инсулином) проводилось с использованием теста Стьюдента t . Сравнения между более чем двумя группами проводились с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным анализом Даннета (INS установлен в качестве контроля). Данные представлены в трех экземплярах из трех отдельных экспериментов, если не указано иное. Значимость обозначена * P <0,05, ** P <0.01, *** P <0,001 или # P <0,0001 соответственно.
Реагенты антител, культура клеток, вестерн-блоттинг и количественный анализ, уход за животными, выделение первичных адипоцитов, поглощение глюкозы, иммунопреципитация mTOR, очистка mTOR, анализ киназы mTOR, а также измерения глицерина, глицеролипидов и жирных кислот подробно описаны в материалах SI и Методы .
Благодарности
Мы благодарим Эвана Таддео за выделение первичных гепатоцитов мыши.Это исследование финансировалось грантами Американской диабетической ассоциации для младших преподавателей 7-11-JF-21 и R01 1R01DK101946 (для TEH), R01 R01DK096076 (для Нидерландов), грантами от бельгийских Fonds de la Recherche Scientifique (для PPR), American Heart Предфинансовая стипендия ассоциации 14PRE20480252 (для GRM) и стипендии Телеви (для С. Бланквэрта).
Сноски
Вклад авторов: G.R.M., L.W., and T.E.H. спланированное исследование; G.R.M., L.W., V.R., S.G.S., R.C.G., S.Борода, J.M.E., S. Blancquaert, T.E.H. проведенное исследование; G.R.M., L.W. и T.E.H. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; G.R.M., L.W., P.P.R., N.L. и T.E.H. проанализированные данные; и G.R.M. и T.E.H. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1410530111/-/DCSupplemental.
Топирамат влияет на липолиз в адипоцитах 3T3-L1
Введение
Ожирение связано с несколькими хроническими заболеваниями. Изменения окружающей среды недостаточно для борьбы с ожирением; однако есть неопровержимые доказательства того, что некоторые фармакологические агенты могут действовать как терапевтические мишени при ожирении. Одним из таких агентов является топирамат (TPM), первоначально применяемый при эпилепсии. лечение и профилактика мигрени. TPM — это глутамат α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионовая кислота / каинат агонист рецепторов и усиливает ингибирующие эффекты, опосредованные γ-аминомасляная кислота (1).Один из побочным эффектом TPM является потеря веса, что делает этот препарат возможный вариант лечения ожирения. Центральные механизмы Предлагаемые для снижения веса, вызванного TPM, включают снижение энергии эффективность, влияние на гипоталамус и изменение нейропептиды (1). Однако прямая действие TPM на жировую ткань, особенно на липолиз, не имеет наблюдалось.
Два основных фермента гидролиза липидов: триглицерид-липаза адипоцитов (ATGL) и гормоночувствительная липаза (HSL).ATGL гидролизует триацилглицерины до жирной кислоты и диацилглицерин (2). Чтобы полностью активировать, ATGL должен взаимодействовать со своим кофактором, сравнительно генетическим идентификация 58 (CGI-58) (3). В адипоциты без липолитических стимулов, CGI-58 прочно связан с липидные капли, взаимодействующие с перилипином А (2). Однако перилипин А и CGI-58 диссоциируют. когда липолитическая активность стимулируется активацией β-адренорецепторы, вызывающие увеличение циклических аденозинмонофосфат и последующая активация протеинкиназы А (ПКА).Этот процесс освобождает CGI-58 для связи с ATGL. Перилипин А — это структурный белок, который покрывает липидные капли и защищает молекулы триглицеридов (ТАГ) от базальных ферментативных гидролиз (4). Кроме того, в стимулированные клетки, перилипин А фосфорилируется и способствует Транслокация HSL с поверхности жировых пузырьков с последующим доступ к его диацилглицериновому субстрату (5). Вместе фосфорилирование HSL и его перемещение на поверхность липидных капель в сочетании с активация ATGL с помощью CGI-58 приводит к гидролизу 90% ТЕГ.
Было показано, что лечениеTPM снижает ожирение у люди и грызуны (6,7). Предполагается, что TPM действует непосредственно на липолиз, однако, это не было подробно описано в vivo, как только TPM действует на центральную нервную систему (ЦНС). Таким образом, В настоящем исследовании использовались адипоциты 3T3-L1, а TPM был продемонстрировано прямое влияние на липолиз.
Материалы и методы
Культура клеток и измерение липолиз
клеток 3T3-L1 были получены из клеток американского типа. Сбор культур и культивирование при 37 ° C в 5% CO2 в Среда Игла, модифицированная Дульбекко, с добавлением 25 ммоль / л глюкоза, 1.0 ммоль / л пирувата, 4,02 ммоль / л L-аланилглютамина и 10% фетальная бычья сыворотка (Гибко, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Клетка дифференциация началась через 24 ч после слияния и произошла в течение 4 дней в среде, содержащей 0,25 мкМ дексаметазона, 0,5 ммоль / л 3-изобутил-1-метилксантин и 5 мкг / мл инсулина (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). После дифференцировки клетки культивировали 10 дней в питательной среде, содержащей 5 мкг / мл инсулина. Каждый параметр оценивали с использованием 6-луночной аликвоты из этой культуры. В день 10 после дифференцировки клетки инкубировали в течение 24 ч в среда, содержащая 0.5% фетальная бычья сыворотка. Клетки обрабатывали 10 мкл TPM (50 мкМ) или изопротеренола (20 мкМ) в течение 30 мин. На конец инкубации, глицерин и неэтерифицированная жирная кислота (NEFA) содержание (Wako Chemical, Richmond, Inc., VA, USA) инкубационная среда использовалась как показатель липолиза и была измеряли с помощью ферментно-колориметрических наборов. В дополнение высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ), индуцированное плазматической мембраной нарушение культуральной среды использовалось как жизнеспособность клеток. индекс.
Регистрация [1-14C] -пальмитат в липиды
Клетки инкубировали в смеси Кребса / Рингера / фосфата. буфер (pH 7.4), с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 1 ммоль / л пальмитата при 37 ° C в атмосфере CO2 (5%) / O2 (95%) газовая смесь. Аликвоты (450 мкл) переносили в полипропиленовые пробирки, содержащие 5 мкл [1-14C] -пальмитат, в присутствии или в отсутствие инсулина (10 нмоль / л), а также в присутствии или в отсутствие TPM (50 мкМ). Эти Затем образцы инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C в водяной ванна. После инкубации смесь подкисляли 0,2 мл. h3SO4 (8 н.) и инкубировали в течение дополнительного 30 минут.По окончании инкубации реакционную смесь перемешивали. обработаны 2,5 мл реактива Дола (изопропанол: н-гептан: h3SO4, 4: 1: 0,25, об. / Об. / Об.) Для экстракции липидов.
Иммуноблоттинг
Экстракты целых клеток получали лизисом клетки в буфере для экстракции [1% Triton X-100, 100 ммоль / л Tris (pH 7,4), содержащий 100 ммоль / л пирофосфата натрия, 100 ммоль / л фторид натрия, 10 ммоль / л ЭДТА, 10 ммоль / л ванадат натрия, 2 ммоль / л фенилметилсульфонилфторид и 0,1 мг апротинина / мл] при 4 ° C.Экстракты центрифугировали при 9000 × g при 4 ° C (5804R; Eppendorf AG, Гамбург, Германия) в течение 40 мин для удаления нерастворимых материала, а супернатанты этих тканей использовали для количественное определение белка по методу Брэдфорда. Белки денатурировали кипячением в буфере для образцов Лэммли, содержащем 100 мМ дитиотреитол, запустить на SDS-PAGE и перенести в нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны были заблокированы, зондированы и промокают первичными антителами. Антитела, используемые для иммуноблоттинга были фосфо HSLser660, фосфо HSLser563, Всего HSL (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США) и фосфо PKAThr198, PKA общий, CGI-58, перилипин A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Даллас, Техас, США), фосфон ATGLSer406, ATGL общий, β-актин (Abcam, Eugene, OR, США) и фосфоперилипин А (Vala Sciences, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Хемилюминесцентное детектирование проводили с хреном. вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США). Авторадиограммы мембран были получены для визуализация белковых полос. Результаты блотов представлены как прямые сравнения площади видимых полос на авторадиографах и количественно определено денситометрией с помощью Scion Программное обеспечение для обработки изображений (программное обеспечение Scion Image; Scion Corp., Фредерик, доктор медицины, США).
Статистический анализ
Полоски представляют 6 различных экспериментов. Отличия между группами оценивались с помощью одностороннего анализа дисперсия с последующим апостериорным тестом Бонферрони. P <0,05 было считается, что это указывает на статистически значимое различие. В программное обеспечение, используемое для анализа данных, было Статистическим пакетом для Социальные науки (SPSS) версии 17.0 для Windows (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США).
Результаты
Влияние TPM на липолиз в 3T3-L1 адипоциты
Для оценки физиологических изменений, вызванных TPM, в липолиз, содержание глицерина и NEFA определяли в инкубационная среда.Содержание глицерина и NEFA в клетки, обработанные изопротеренолом, были выше по сравнению с контролем группа. Аналогичные результаты наблюдались для группы изопротеренола. (Рис. 1A и B). Анализировать липогенез, инсулин-индуцированный [1-14C] -пальмитат анализировали включение в липиды. Эти результаты показывают, что использование TPM снижает включение пальмитата в липиды по сравнению с в контрольную группу независимо от инсулинового стимула (рис. 1С). Чтобы оценить, насколько подвержен риску TPM влияет на жизнеспособность клеток, высвобождение цитозольного фермента ЛДГ было количественно.Анализируемые группы не продемонстрировали значимых различия, предполагающие, что TPM не был цитотоксичным в то время и использованные дозировки (рис. 1D).
Рис. 1.Влияние топирамата на липолиз и липогенез в адипоцитах 3T3-L1. Адипоциты инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C в присутствии или в отсутствие топирамата или изопротеренол. (A) Высвобождение глицерина и (B) неэтерифицированных жирных кислот кислоты (NEFA) в культуральную среду измеряли и выражали как мг / дл / мкг белка и нМ / мкл / мкг белка соответственно.Изопротеренол был положительным контролем. (C) Включение [14C] -пальмитат в липиды в присутствии или в отсутствие инсулина (10 нмоль / л) и наличие или отсутствие топирамата (50 мкМ). Результаты выражаются в процентах от базального контроль. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью (D) мониторинга лактата. дегидрогеназа (ЛДГ) и выражается в ммоль / л / дл / мкг белка. Фосфорилирование (E) протеинкиназы A (PKA), (F) гормоночувствительная липаза Ser660 (HSLSer660), (G) HSLSer563, (H) перилипин, (I) ATGLSer406 и (J) сравнительная генетическая идентификация кофакторов 58 (CGI-58) уровни протеина соответственно.На нижней панели показаны полосы представитель PKA, HSL, перилипина, триглицерида адипоцитов липаза (ATGL) и уровень белка β-актина. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего 6 различных экспериментов. * P <0,05, по сравнению с контрольной группой. На рис. 1C * P <0,05 по сравнению с контрольной группой без инсулин (-) и #P <0,05 для топирамата по сравнению с контролем группа с инсулином (+). КОН, контроль; ISO, изопротеренол; ВЕРШИНА, топирамат. |
На основании текущих результатов мы предполагаем, что Обработка TPM может увеличить фосфорилирование основных липолитические ферменты.Впоследствии фосфорилирование PKAThr198, HSLSer660, HSLSer563, ATGLSer406 и перилипин А, а также белок уровни CGI-58, PKAThr198, HSLSer660, HSLSer563, ATGLSer406 и перилипин A были проанализированы (рис. 1E – J). Обработка TPM привело к более высокому ферментативному фосфорилированию по сравнению с контролем группа. Следовательно, этот результат может объяснить, по крайней мере частично, почему уровни глицерина и NEFA были увеличены. Примечательно, что проанализированные фосфорилирование белка и уровни белка CGI-58 были аналогичными для клеток, обработанных TPM или изопротеренолом (рис.1E – J).
Обсуждение
Как усиление липолиза и снижение липогенеза вызывают потерю жира у людей с ожирением, в настоящем исследовании проверено увеличивает ли использование TPM липолиз в клетках 3T3-L1. В Клетки 3T3-L1, обработанные TPM, показали высокое фосфорилирование липолитические ферменты и последующий липолиз без изменения Жизнеспособность клеток. Кроме того, данные показали, что TPM модулировал липогенез. Предыдущее 6-месячное рандомизированное исследование на людях показало: что TPM привел к заметной потере веса по сравнению с плацебо (8).Другое недавнее исследование показало, что совместное лечение фентермином и TPM также вызывало потерю веса у пациенты с ожирением (9). Исследование, в котором животных, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров, показало, что сопутствующие Использование TPM в дозе 50 мг / кг привело к снижению массы тела и снижению инсулина. улучшение чувствительности (10). Карицилли и др. (11) наблюдали что TPM улучшил чувствительность к инсулину и лептину в гипоталамус мышей с ожирением, что может способствовать снижению приема пищи и ожирения. Однако эти исследования in vivo не исключил влияние TPM на ЦНС.
В настоящем исследовании лечение TPM увеличивало высвобождение NEFA и глицерина в питательную среду. Кроме того, снижение включения [14C] -пальмитата наблюдалось в адипоциты, подвергшиеся воздействию TPM. Один из предложенных механизмов для снижение липогенеза может быть ферментом карбоангидразы торможение, которое выполняет первый шаг de novo липогенез. Хотя этот фермент в настоящее время не анализировался. исследования, предыдущее исследование показало, что TPM может ингибировать цитозольный и митохондриальный уровни этого фермента, что приводит к похудание (12).
После того, как NEFA и глицерин уровни были изменены, пять молекул, которые играют решающую роль в гидролиз триацилглицерина. Обработка TPM увеличена фосфорилирование PKA, HSL, ATGL и перилипина A, а также уровни белка CGI-58 по сравнению с контрольными клетками. Тем не мение, степени фосфорилирования, индуцированного TPM, были аналогичны таковым при использовании изопротеренол. Настоящие данные не позволяют предположить механизм, ответственный за увеличение этих молекул индуцированный TPM.Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что TPM лечение привело к липолизу независимо от его воздействия на ЦНС. Эти данные улучшают понимание процессов, связанных с потеря веса, вызванная TPM, и предполагают прямое действие этого препарат на жировой ткани.
Благодарности
Настоящее исследование поддержано грантами Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) и University of Extremo Sul Catarinense (UNESC).
Глоссарий
Сокращения
Сокращения:
ATGL | триглицерид липаза адипоцитов |
CGI-58 | кофактор сравнительный генетический идентификация 58 |
CNS | центральная нервная система |
HSL | гормоночувствительная липаза |
ЛДГ | лактатдегидрогеназа |
NEFA | неэтерифицированная жирная кислота |
ПКА | протеинкиназа А |
ТЕГ | триглицеридов |
TPM | топирамат |
Список литературы
1 | Верротти А, Скапарротта А, Агостинелли С, Di Pillo S, Chiarelli F и Grosso S: вес, вызванный топираматом потеря: обзор.Epilepsy Res. 95: 189–199. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
2 | Zechner R, Kienesberger PC, Haemmerle G, Циммерманн Р. и Ласс А: липаза триглицеридов жиров и липолитический катаболизм клеточных жировых отложений. J Lipid Res. 50: 3–21. 2009. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
3 | Дева А, Циммерманн Р., Хеммерле Г, Riederer M, Schoiswohl G, Schweiger M, Kienesberger P, Strauss JG, Gorkiewicz G и Zechner R: триглицерид липазы жировой ткани липолиз клеточных жировых отложений активируется CGI-58 и дефект при синдроме Чанарина-Дорфмана.Cell Metab. 3: 309–319. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
4 | Сталрид К., Сюй Дж., Дорвард Х., Танси Дж. Т., Contreras JA, Kimmel AR и Londos C: перилипин A необходим для транслокация гормоночувствительной липазы во время липолитического активация. J Cell Biol. 161: 1093–1103. 2003. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
5 | Brasaemle DL: Серия тематических обзоров: Биология адипоцитов.Семейство перилипинов структурных липидных капель белки: стабилизация липидных капель и контроль липолиза. J Lipid Res. 48: 2547–2559. 2007. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
6 | Бен Менахем, Аксельсен М., Йохансон Э. Stagge A и Smith U: Предикторы потери веса у взрослых с Эпилепсия, принимаемая топираматом. Obes Res. 11: 556–562. 2003. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
7 | Пикард Ф., Деше Й., Лалонд Дж., Самсон П. и Ричард Д: Топирамат снижает прирост энергии и жира у худых. (Fa /?) И тучные (fa / fa) крысы Цукера.Obes Res. 8: 656–663. 2000 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
8 | Уилдинг Дж., Ван Гаал Л., Риссанен А., Vercruysse F и Fitchet M: Исследовательская группа OBES-002: рандомизированная группа. двойное слепое плацебо-контролируемое исследование долгосрочной эффективности и безопасность топирамата при лечении пациентов с ожирением. Int J Obes Relat Metab Disord. 28: 1399–1410. 2004. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
9 | Гадде К.М., Эллисон ДБ, Райан Д.Х., Петерсон CA, Troupin B, Schwiers ML и Day WW: эффекты низких доз, с контролируемым высвобождением, комбинация фентермин плюс топирамат на вес и сопутствующие заболевания у взрослых с избыточным весом и ожирением (ПОБЕДИТЬ): рандомизированное плацебо-контролируемое исследование фазы 3.Ланцет. 377: 1341–1352. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
10 | Abo-Elmatty DM и Zaitone SA: топирамат способствует снижению веса и улучшает чувствительность к инсулину в диетических тучные крысы: сравнение с сибутрамином. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 15: 1187–1195. 2011.PubMed / NCBI |
11 | Каричилли AM, Penteado E, de Abreu LL, Quaresma PG, Santos AC, Guadagnini D, Razolli D, Mittestainer FC, Карвалейра Дж. Б., Веллосо Л. А. и др.: Лечение топираматом улучшает гипоталамический инсулин и лептин, сигнализация и действие, а также снижает ожирение у мышей.Эндокринология. 153: 4401–4411. 2012. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
12 | Супуран CT, Ди Фьоре А и Де Симоне Джи: Ингибиторы карбоангидразы как новые лекарственные средства для лечения ожирения. Экспертное мнение Emerg Drugs. 13: 383–392. 2008. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI |
Границы | Короткоцепочечные жирные кислоты по-разному влияют на внутриклеточный липолиз в белых адипоцитах человека, модель
Введение
Все больше данных свидетельствует о том, что микробиота кишечника человека и ее продукты играют ключевую роль в метаболизме, массе тела и чувствительности к инсулину, тем самым внося свой вклад в этиологию ожирения и связанных с ним расстройств (1).Микробиота кишечника может сбраживать неперевариваемые питательные вещества в короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), из которых наиболее распространены ацетат, пропионат и бутират (2). Следует отметить, что эти SCFA могут захватываться эпителиальной выстилкой кишечника и выбрасываться в кровоток (3). Таким образом, они могут действовать как важные сигнальные молекулы между микробиотой кишечника и физиологией хозяина, оказывая влияние на энергетический и субстратный метаболизм, например, на адипогенез и липолиз в жировой ткани (4).
Нарушения функции жировой ткани, характеризующиеся сниженной способностью накапливать липиды, по-видимому, играют важную роль в развитии инсулинорезистентности и сахарного диабета 2 типа у людей (5).В нормальных здоровых условиях жировая ткань является важным буферным органом для ежедневных потоков жирных кислот (ЖК) после приема пищи, когда эндогенный липолиз ингибируется. Таким образом, жировая ткань предотвращает чрезмерное поступление липидов в нежировые ткани, такие как печень, скелетные мышцы и поджелудочная железа. Это буферное действие может быть нарушено при ожирении в условиях инсулинорезистентности (6, 7), что приводит к увеличению циркулирующих липидов и эктопическому накоплению жира в нежирных тканях, тем самым вызывая нарушения передачи сигналов инсулина и метаболизма субстратов (8, 9).
SCFA может влиять на буферную способность липидов жировой ткани, влияя на внутриклеточный липолиз, процесс гидролиза хранящегося триацилглицерина в одну молекулу глицерина и три молекулы ЖК, и тем самым может влиять на концентрацию циркулирующих липидов (4). Действительно, уже несколько десятилетий назад наблюдалось снижение свободных жирных кислот (СЖК) в плазме после однократного перорального приема ацетата, что указывало на антилиполитическую роль ацетата (10). Более поздняя идентификация двух чувствительных к коклюшному токсину (PTX) ингибиторных рецепторов G (Gi), связанных с белком (GPR) для SCFA, рецептора свободных жирных кислот 3 (FFAR3, также известного как GPR41) и FFAR2 (также известного как GPR43). ) в жировой ткани человека (11), привело к возобновлению интереса к липолитическим свойствам SCFA.Кроме того, недавно была обнаружена прямая связь между сигнальным путем SCFA / FFAR и липолитической активностью в адипоцитах мышей (12). Обработка дифференцированных адипоцитов мышей 3T3-L1 ацетатом и пропионатом в диапазоне от 0,1 до 0,3 ммоль / л выявила активацию FFAR2 и снижение внутриклеточной липолитической активности, что оценивалось по снижению высвобождения глицерина в культуральной среде (12). Напротив, инкубация адипоцитов 3T3-L1 с супрафизиологическими концентрациями пропионата (20 ммоль / л) или бутирата (5 ммоль / л) приводила к усиленному высвобождению глицерина (13).Однако в адипоцитах 3T3-L1 мышей экспрессируется только FFAR2, а не FFAR3 (14-17). Следовательно, еще предстоит определить, распространяются ли эти данные на адипоциты человека, в которых экспрессируются как FFAR3, так и FFAR2 (11, 18). Таким образом, срочно необходимы дальнейшие исследования роли SCFA в липолизе адипоцитов человека.
Недавно мы наблюдали, что инфузии смесей ацетата, пропионата и бутирата в толстой кишке в соотношениях и концентрациях, которые могут быть достигнуты после приема пищевых волокон, ослабляют липолиз всего тела у нормогликемических мужчин с избыточной массой тела (19).Таким образом, целью настоящего исследования было выяснить, ответственна ли измененная скорость липолиза внутриклеточных адипоцитов за антилиполитический эффект SCFA, обнаруженного in vivo , а также провести дальнейшее исследование основных механизмов. Таким образом, мы исследовали эффекты in vitro инкубации со смесями SCFA и одиночных SCFA на внутриклеточный липолиз на модели белых адипоцитов человека, человеческих мультипотентных стволовых клетках, полученных из жировой ткани (hMADS). Чтобы изучить, опосредуются ли эти эффекты через Gi-сопряженных рецепторов, мы исследовали влияние SCFA на активацию липазы и выполнили опосредованное PTX ингибирование FFAR.
Материалы и методы
Культура клеток
Человеческие мультипотентные стволовые клетки жировой ткани, подтвержденная модель белых адипоцитов человека для изучения метаболизма липидов (20), были получены из биоптатов подкожной жировой ткани человека и дифференцированы в адипогенную линию. Как описано ранее Jocken et al. (21) клетки высевали с плотностью 2000 клеток / см 2 и хранили в среде для пролиферации [среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM) и питательная смесь Ham’s F-12 (Gibco, Bleiswijk, Нидерланды), 10% плодов крупного рогатого скота. сыворотка (Bodinco BV, Alkmaar, NL, Нидерланды) и 50 Ед / мл пенициллина (Gibco), 50 мкг / мл стрептомицина (Gibco)].При слиянии 70–80% добавляли 250 мкмоль / л IBMX (Sigma, Сент-Луис, Мичиган, США) и 5 мкмоль / л розиглитазона (Enzo Life Sciences, Raamsdonksveer, Нидерланды), чтобы вызвать адипогенную дифференцировку. Липолитические эксперименты проводили между 12 и 14 днями дифференцировки.
Объединенные клетки hMADS были получены от доноров-мужчин с большим диапазоном ИМТ (20-40 кг / м 2 ) и глюкометаболическим статусом. Доноры-мужчины были в возрасте от 35 до 70 лет и участвовали в двух различных проведенных клинических испытаниях (http: // ClinicalTrials.gov, NCT02241421 и NCT02598544). Протоколы исследования были одобрены Медицинским этическим комитетом больницы Джессы, Университет Хасселта и Хасселта, Бельгия, и Медицинским этическим комитетом Медицинского центра Маастрихтского университета, Маастрихт, Нидерланды. Все процедуры соответствовали Хельсинкской декларации (исправленная версия, октябрь 2008 г.).
Эксперимент по липолизу
Анализ высвобождения свободного глицерина
Для изучения влияния смесей SCFA на базальное высвобождение глицерина адипоциты hMADS инкубировали в течение 6 часов с 300 мкл DMEM 3% БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Мичиган, США) с добавкой или без смеси с высоким содержанием ацетата, содержащей 80% ацетата, 10% пропионата и 10% бутирата (80:10:10), смесь SCFA, содержащая 60% ацетата, 20% пропионата и 20% бутирата. (60:20:20), смесь с высоким содержанием PA, содержащая 40% ацетата, 35% пропионата и 25% бутирата (40:35:25), и смесь с высоким содержанием BA, содержащая 40% ацетата, 25% пропионата и 35% бутират (40:25:35) в конечных концентрациях 1 ммоль / л или 1 мкмоль / л в течение 6 часов.
Для изучения влияния одиночных SCFA на базальное (нестимулированное) высвобождение глицерина, адипоциты hMADS инкубировали с 300 мкл DMEM 3% БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Мичиган, США) с добавками ацетата (Merck, Дармштадт, Германия), пропионата (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Мичиган, США) или без них (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Мичиган, США) в Конечная концентрация 1 ммоль / л и концентрации 1 мкмоль / л в течение 6 часов.
Чтобы изучить влияние отдельных смесей SCFA или SCFA на опосредованное β-адренергическим рецептором высвобождение глицерина, через 30 минут после начала инкубации SCFA был добавлен неселективный β-агонист изопреналин (ISO) в конечной концентрации 1 мкмоль. / L.
После 6 ч инкубации планшеты помещали на лед, чтобы остановить реакции, а затем 250 мкл супернатанта удаляли, сразу мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до анализа. Концентрации глицерина определяли количественно, используя коммерческий флуорометрический анализ (набор для анализа Adipolysis EnzyChrome ™, BioAssay Systems, Хейворд, Калифорния, США).
Экспрессия гена FFAR3 и FFAR2 в адипоцитах hMADS
Для определения экспрессии мРНК FFAR3 и FFAR2 общую РНК экстрагировали из адипоцитов hMADS на 0, 2, 7, 10 и 12 дни с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) и проводили ПЦР в реальном времени на основе SYBR-Green с использованием iCylcer ( Biolegio, Неймеген, Нидерланды; последовательность праймеров см. В таблице 1).Результаты были нормализованы для 18S рибосомной РНК (расчет значений дельта-дельта Ct). Значения Ct варьировали от 27 до 33 для FFAR3 / 2 и от 6 до 9 для 18S рибосомной РНК.
Таблица 1 . Последовательности праймеров.
Вестерн-блоттинг
Для изучения влияния ацетата на экспрессию белка и активацию (фосфорилирование) ключевых липолитических ферментов липазы триглицеридов жиров (ATGL) и гормон-чувствительной липазы (HSL) адипоциты hMADS инкубировали с 300 мкл DMEM 3% BSA с добавлением или без ацетата в конечной концентрации 1 мкмоль / л в течение 1 ч.Кроме того, через 30 минут после начала инкубации с ацетатом в среду добавляли ISO до конечной концентрации 1 мкмоль / л для исследования влияния ацетата на фосфорилирование HSL, опосредованное β-адренергическим рецептором. После 1-часовой инкубации клетки дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером и клетки гомогенизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации с добавлением смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз (Cell Signaling, Лейден, Нидерланды). 20 мкг солюбилизированных белков разделяли на готовом геле Criterion TGX (Bio-Rad), переносили с использованием системы переноса Trans Blot Turbo (Bio-Rad) и инкубировали с первичными антителами.Антитело HSL было любезным подарком профессора К. Холма (Лундский университет, Лунд, Швеция). Антитела ATGL (№: 2138) и фосфорилированный HSL (pHSL) по остатку серина 650 (крысиный SER660) (№: 4126) были получены от Cell Signaling Technology, Лейден, Нидерланды. Для определения экспрессии белков FFAR3 (антитело № 103718, Abcam, Кембридж, Великобритания) и FFAR2 (антитело № 131003, Abcam, Кембридж, Великобритания) общий белок экстрагировали из адипоцитов hMADS в дни 0, 2, 4, 7, 9, 11 и 14.
Эффект ингибирования Gi-белков с использованием PTX
Для изучения предполагаемого участия FFAR, связанных с G-белком Gi-типа, в индуцированном ацетатом ингибировании липолитического ответа, мы инкубировали адипоциты hMADS в течение 6 часов с ацетатом в концентрации 1 мкмоль / л во время базальной и ISO-стимуляции. условий (см. протокол выше), с добавлением или без добавления PTX в течение целых 6 часов в среду с конечной концентрацией 100 нг / мл (№: P7208, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Мичиган, США).Эксперименты с PTX проводились в соответствии с рекомендациями Европейского химического агентства (Хельсинки, Финляндия).
Статистический анализ
Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. Достоверность определялась с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни при сравнении двух групп (одиночный SCFA, вестерн-блоттинг и эксперимент PTX) или теста Краскела – Уоллиса H при сравнении большего количества групп (смеси SCFA). В случае значимого теста Краскела – Уоллиса H , был проведен апостериорный тест Dunns .Статистические данные проводили с использованием программного пакета GraphPad Prism 5.0a (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). и P <0,05 (двустороннее значение P ) считали статистически значимым.
Результаты
Смеси SCFA с высоким содержанием ацетата и пропионата снижают высвобождение базального глицерина адипоцитов
In vitroМы исследовали, связано ли наблюдаемое снижение системного глицерина, обнаруженное в нашем исследовании in vivo (19), с ослабленным внутриклеточным липолизом адипоцитов.Поэтому мы инкубировали адипоциты hMADS в течение 6 часов с 1 мкмоль / л и 1 ммоль / л смесей SCFA. Смеси SCFA с высоким содержанием ацетата и пропионата (80:10:10, 60:20:20 и 40:35:25) снижали базальное (нестимулированное) высвобождение глицерина по сравнению с контролем ( P <0,05, Рисунок 1А). Смесь SCFA с высоким содержанием бутирата (40:25:35) не оказала значительного влияния на базальное высвобождение глицерина (рис. 1A). В отличие от сниженного базального липолиза, опосредованное β-адренергическим рецептором высвобождение глицерина не претерпело значительных изменений после инкубации со всеми смесями SCFA в физиологических концентрациях в диапазоне от 1 мкмоль / л до 1 ммоль / л (рис. 1B).
Рисунок 1 . Влияние смесей короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) на базальный и β-адренергический рецепторы, стимулированное высвобождением глицерина в мультипотентных стволовых адипоцитах жировой ткани человека. (A) Базальные (нестимулированные) концентрации глицерина в течение 6 часов инкубации со смесями SCFA 1 ммоль / л или 1 мкмоль / л, включая ацетат (C2), пропионат (C3) и бутират (C4). (B) Влияние 6-часовой инкубации со смесями SCFA 1 ммоль / л или 1 мкмоль / л, включая ацетат (C2), пропионат (C3) и бутират (C4), на стимулированные β-адренорецепторы (1 мкмоль / л изопреналина) ) высвобождение глицерина; Значения представлены как средние значения ± стандартное отклонение ( n = 4–6 независимых экспериментов).Статистическая значимость по сравнению с базовым показателем обозначается звездочкой (*), когда P <0,05, и двойной звездочкой (**), когда P <0,01.
Отдельный SCFA дифференцированно влияет на высвобождение глицерина адипоцитов
In vitroЗатем мы изучили, был ли один конкретный SCFA ответственным за наблюдаемый антилиполитический эффект. Поэтому мы инкубировали адипоциты hMADS в течение 6 часов с ацетатом, пропионатом и бутиратом в концентрациях 1 мкмоль / л и 1 ммоль / л.Инкубация с 1 мкмоль / л ацетата снижает базальное высвобождение глицерина по сравнению с контрольными клетками ( P <0,05, рис. 2A). Кроме того, ацетат подавлял опосредованное β-адренорецептором высвобождение глицерина в концентрациях 1 ммоль / л и 1 мкмоль / л по сравнению с контролем ( P <0,05, рис. 2B). Напротив, обработка бутиратом 1 мкмоль / л немного увеличивала базальное ( P <0,05, рис. 2A) и опосредованное β-адренорецептором высвобождение глицерина ( P <0.01, фиг. 2B) по сравнению с контрольными обработанными клетками. Ни в базальном состоянии, ни во время стимуляции β-адренергических рецепторов не наблюдалось существенной разницы между адипоцитами, обработанными пропионатом и контрольной группой (Фигуры 2A, B).
Рисунок 2 . Влияние одной короткоцепочечной жирной кислоты на базальный и β-адренергический рецепторы стимулировало высвобождение глицерина в мультипотентных стволовых адипоцитах жировой ткани человека. (A) Базальные (нестимулированные) концентрации глицерина в течение 6 часов инкубации с 1 ммоль / л или 1 мкмоль / л ацетата (C2), пропионата (C3) или бутирата (C4). (B) Влияние 6-часовой инкубации с 1 ммоль / л или 1 мкмоль / л ацетата (C2), пропионата (C3) или бутирата (C4) на β-адренергический рецептор, стимулированный (1 мкмоль / л изопреналина) высвобождение глицерина ; значения даны как средние значения ± стандартное отклонение ( n = 4–7 независимых экспериментов). Статистическая значимость по сравнению с базовым показателем обозначена звездочкой (*), когда P <0,05, и тройной звездочкой (***), когда P <0,001.
Ацетат ослабляет фосфорилирование HSL в адипоцитах
Поскольку приведенные выше данные показали, что главным образом ацетат является движущей силой антилиполитического действия SCFA в адипоцитах человека, мы впоследствии более подробно исследовали лежащие в основе механизмы путем количественной оценки ключевых ферментов, участвующих во внутриклеточном липолизе, включая ATGL, HSL и pHSL.Никаких различий ацетата в отношении общего содержания белка HSL или ATGL не наблюдалось (рис. 3А для общего белка HSL). Как показано на Фигуре 3B, обработка адипоцитов hMADS 1 мкмоль / л ацетата приводила к снижению относительного количества фосфорилирования HSL на серине 650 по сравнению с контрольными необработанными клетками ( P <0,01, Рисунок 3B) . Как и ожидалось, фосфорилирование HSL на серине 650 увеличивалось от пяти до шести раз в присутствии ISO по сравнению с нестимулированными адипоцитами (Фигуры 3A, B).Однако предварительная обработка адипоцитов hMADS 1 мкмоль / л ацетата и ISO привела к снижению относительного количества pHSL (SER650) по сравнению с одной стимуляцией ISO ( P <0,05, рис. 3B).
Рисунок 3 . Ацетат ослабляет фосфорилирование гормон-чувствительной липазы (HSL) (SER 650) в стволовых адипоцитах, полученных из мультипотентной жировой ткани человека. (A) Репрезентативный вестерн-блоттинг, показывающий, что 1 мкмоль / л ацетата (C2) снижает относительное количество HSL, фосфорилированного по серину 650 в присутствии изопреналина (ISO).В этом блоте инсулин использовали в качестве контроля. Соответствующие полные блоты см. На рисунке S1 в дополнительном материале (B) Количественная оценка вестерн-блоттинга с использованием ImageLab 3.0, нормализованного к общему количеству HSL ( n = 4). Значения даны как средние ± стандартное отклонение. Статистическая значимость при сравнении с базальным показателем обозначается двойной звездочкой (**), когда P <0,01; и по сравнению с ISO как кинжал ( † ), когда P <0,05.
Обработка PTX предотвращает антилиполитический эффект ацетата в клетках hMADS
Наконец, мы исследовали участие ингибиторных рецепторов, связанных с G-белком, в этом опосредованном ацетатом антилиполитическом эффекте.И FFAR3, и FFAR2, основные рецепторы SCFA, были экспрессированы на уровне РНК (Рисунок 4A) и белка (Рисунок 4B) в наших клетках hMADS, и экспрессия увеличивалась во время адипогенной дифференцировки с максимальной экспрессией на 12 и 14 дни (см. Рисунок 4 ; Рисунок S3C в дополнительном материале для экспрессии белка FFAR2 в hMADS на 14 день).
Рисунок 4 . Рецепторы свободных жирных кислот (FFAR) 3 и FFAR2 экспрессируются на уровне РНК и белка в стволовых адипоцитах, полученных из мультипотентной жировой ткани человека. (A) Экспрессия мРНК FFAR3 / 2 во время дифференцировки адипоцитов (дни 0–12). (B) Экспрессия белка FFAR3 / 2 во время дифференцировки адипоцитов (дни 0–14) ( n = 1). Соответствующие полные блоты см. На рисунке S2 в дополнительных материалах.
Затем адипоциты hMADS инкубировали с или без PTX, который необратимо блокирует функцию Gi, тем самым подавляя как FFAR3, так и FFAR2 в наших адипоцитах hMADS. Интересно, что PTX предотвращал опосредованное ацетатом (1 мкмоль / л) снижение базального и стимулированного β-адренорецепторами высвобождения глицерина ( P <0.01, рисунок 5).
Рисунок 5 . Коклюшный токсин (PTX) отменял индуцированное ацетатом ингибирование (1 мкмоль / л) опосредованного изопреналином (ISO) высвобождения глицерина в адипоцитах мультипотентного ствола жировой ткани (hMADS) человека. Значения даны как отдельные точки и средние значения ± стандартное отклонение ( n = 4 независимых эксперимента). Статистическая значимость по сравнению с базальным показателем, обозначенным звездочкой (*), когда P <0,01; и по сравнению с ISO как кинжал ( † ), когда P <0.001.
Обсуждение
Это исследование дает новое представление о влиянии SCFA на липолиз адипоцитов человека. Ранее мы показали, что острое введение в толстую кишку трех физиологически значимых смесей SCFA и последующее повышение концентрации циркулирующего ацетата снижает концентрацию циркулирующего глицерина у мужчин с избыточной массой тела, что свидетельствует о снижении липолиза всего тела (19). Однако для дальнейшего изучения того, связано ли снижение липолиза всего тела с предполагаемым влиянием SCFA на внутриклеточный липолиз белых адипоцитов, мы провели несколько экспериментов in vitro с использованием нашей проверенной модели адипоцитов hMADS.Наше настоящее исследование in vitro на адипоцитах hMADS продемонстрировало, что в основном ацетат обладает антилиполитическим действием, которое сопровождается сниженным фосфорилированием HSL (при SER650). Инкубация с ингибитором Gi PTX предотвращала опосредованный ацетатом антилиполитический эффект, предполагая, что этот антилиполитический эффект может быть опосредован посредством связанного с ацетатом FFAR сигнального пути (схематический обзор см. На фиг. 6).
Рисунок 6 . Предлагаемый механизм ацетатопосредованного антилиполитического действия на адипоциты человека.Снижение высвобождения жирных кислот и глицерина во время инкубации с ацетатом сопровождается сниженным фосфорилированием HSL (SER650) , что указывает на роль протеинкиназы А в этом антилиполитическом процессе. Ингибитор рецепторов свободных жирных кислот (FFAR) коклюшный токсин предотвращает ацетатный токсин. опосредованный антилиполитический эффект, что указывает на роль механизма рецепторов, связанных с Gi-белками (например, FFAR3 и / или FFAR2) в липолизе адипоцитов человека.
Это исследование продемонстрировало, что смеси SCFA в физиологических (1 мкмоль / л) и более супрафизиологических (1 ммоль / л) концентрациях ослабляют внутриклеточный липолиз в адипоцитах человека.Кроме того, путем последующей инкубации адипоцитов человека с одиночными SCFA мы продемонстрировали, что наиболее распространенный в кишечнике и системном плане ацетат SCFA, по-видимому, является основным двигателем этого антилиполитического эффекта. Ацетат является наиболее широко циркулирующими SCFA и обнаруживается в сыворотке и плазме, средние концентрации варьируются от 5 до 220 мкмоль / л, в зависимости от статуса питания (3, 22–24). Пропионат и бутират обнаруживаются при гораздо более низких максимальных средних концентрациях 13 и 12 мкмоль / л соответственно (3, 22, 23).Однако отсутствуют данные о людях, отражающие концентрации SCFA, которые достигают жировой ткани через их капилляров. Основываясь на мало доступных данных о концентрациях SCFA в крови, соотношение ацетата, пропионата и бутирата 80:10:10 и 60:20:20 может напоминать физиологически циркулирующие концентрации, а концентрации SCFA, используемые в этом исследовании, могут быть физиологическими (1 мкмоль / л) до супрафизиологического (1 ммоль / л) диапазона. Интересно, что наиболее выраженные эффекты на липолиз были обнаружены при концентрации ацетата 1 мкмоль / л, которая, таким образом, кажется ниже, чем концентрации в крови.Поэтому было бы очень интересно измерить фактическую концентрацию ацетата в капиллярах жировой ткани или интерстициальных жидкостях. Насколько известно авторам, данные об этом отсутствуют, что было бы очень интересно обнаружить с помощью , например, методами микродиализа.
Кроме того, мы наблюдали, что антилиполитический эффект ацетата сопровождался сниженным фосфорилированием HSL по серину 650, главному регуляторному сайту протеинкиназы A (PKA). В соответствии с этим наблюдением Aberdein et al.(25) показали, что обработка адипоцитов 3T3-L1 мыши супрафизиологическими концентрациями (4 ммоль / л) ацетата натрия снижает стимулируемое β-адренорецептором высвобождение неэтерифицированных ЖК и снижает фосфорилирование HSL в другом регуляторном сайте PKA (серин 563) ( 25). Ge et al. (12) показали, что обработка адипоцитов 3T3-L1 ацетатом и пропионатом в диапазоне от 0,1 до 0,3 ммоль / л снижает базальную и стимулированную β-адренорецепторами внутриклеточную липолитическую активность, о чем свидетельствует снижение высвобождения глицерина в культуральной среде ( 12).В отличие от антилиполитического действия ацетата, мы наблюдали незначительное усиление базального липолитического ответа после обработки бутиратом в адипоцитах hMADS. Сравнимые результаты были получены Rumberger et al. (13) демонстрируют повышенный базальный липолитический ответ (высвобождение глицерина) после инкубации адипоцитов мышей 3T3-L1 с 5 ммоль / л бутирата (13). Однако механизм, лежащий в основе этого липолитического действия бутирата, требует дальнейшего изучения на клетках hMADS. В совокупности эти результаты предполагают, что ацетат является основным фактором антилиполитических эффектов SCFA, который сопровождается ослабленным фосфорилированием HSL как в мышиных, так и в человеческих адипоцитах.
Наконец, мы заметили, что антилиполитический эффект ацетата может зависеть от FFAR. Мы впервые показали, в соответствии с другими сообщениями на моделях адипоцитов человека (18), что транскрипты и белок FFAR3 и FFAR2 экспрессируются в нашей модели адипоцитов hMADS, и что оба они увеличиваются во время адипогенной дифференцировки. Кроме того, мы показали, что эффекты ацетата отменяются при совместной инкубации PTX. PTX является хорошо известным ингибитором FFAR и необратимо инактивирует белки Gi.Таким образом, эти данные предполагают, что эффекты ацетата опосредованы через путь рецептор белка Gi-PKA. В частности, предыдущее исследование адипоцитов 3T3-L1 мышей показало, что липолитический эффект ацетата опосредован активацией FFAR2 (12). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, опосредуются ли эффекты SCFA на внутриклеточный липолиз адипоцитов человека в основном через FFAR2 и / или FFAR3, с использованием конкретных моделей нокдауна человека. В частности, роль белка FFAR3 / 2 должна быть дополнительно исследована через с использованием нокдауна и сверхэкспрессии в моделях адипоцитов человека.
Кроме того, появляется все больше данных о том, что метаболический фенотип следует учитывать в будущих исследованиях липолиза. В современной литературе представлены доказательства того, что связанные с ожирением метаболические нарушения, такие как инсулинорезистентность, связаны с различиями в уровнях циркулирующего ацетата и метаболических ответах, вызванных ацетатом. Например, в наши исследования острых состояний (19, 24) мы включили людей с избыточным весом и ожирением со средней концентрацией ацетата натощак примерно 20-50 мкмоль / л, тогда как в другом исследовании нашей группы с инсулинорезистентными людьми с ожирением были заметно более высокие концентрации ацетата примерно Найдено 70–90 мкмоль / л (26).Кроме того, кинетическое исследование показало, что скорость клиренса ацетата ниже, а период полувыведения больше у пациентов с диабетом 2 типа по сравнению со здоровыми контрольными пациентами с нормогликемией (27). Это свидетельствует о нарушенном поглощении и / или метаболизме ацетата, что может иметь отношение к индуцированным ацетатом метаболическим эффектам и передаче клеточных сигналов в периферических тканях. Кроме того, есть признаки того, что инсулинорезистентные люди с избыточной массой тела по сравнению с нормогликемическими людьми имеют более низкие антилиполитические реакции, вызванные ацетатом, на уровне всего тела (28).Острое исследование показало, что внутривенное введение ацетата приводит к большему падению и восстановлению FFA у здоровых взрослых по сравнению с людьми с гиперинсулинемией (28). Таким образом, сравнение SCFA-опосредованного ингибирования липолитического ответа и внутриклеточного сигнального механизма в адипоцитах, происходящих от нормогликемических, чувствительных к инсулину доноров, с метаболически более скомпрометированными донорами представляет большой интерес. Здесь мы включили клетки взрослых людей с широким диапазоном ИМТ и глюкометаболическим статусом, поэтому мы не различали метаболические фенотипы, что является ограничением.
Тем не менее, это исследование имеет клиническое значение. Если наблюдаемые результаты могут быть преобразованы в долгосрочные метаболические эффекты in vivo , повышенная системная доступность ацетата может улучшить буферную способность липидов белой жировой ткани человека и снизить вторичное распространение липидов жировой ткани. В конечном итоге это может привести к ослаблению эктопического накопления жира и улучшению действия инсулина в чувствительных к инсулину тканях, таких как скелетные мышцы, поджелудочная железа и печень, предотвращая резистентность к инсулину.Настоящее исследование показало, что ацетат вызывает частичное ингибирование внутриклеточного липолиза в основных условиях. Интересно, что объединенные данные, полученные на грызунах и людях, продемонстрировали, что сопоставимое частичное ингибирование внутриклеточного липолиза оказывает положительное влияние на чувствительность к инсулину, не влияя на массу жировой ткани в долгосрочной перспективе (29, 30). Помимо повышенного базального липолиза, чувствительность к агонистам β-адренергических рецепторов снижается у лиц с ожирением, резистентных к инсулину (31–33), что ставит вопрос о том, положительно ли дальнейшее снижение β-адренергического липолиза с помощью SCFA в отношении метаболического здоровья.Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, в том числе кривые «концентрация изопреналина-ответ», чтобы установить вызванные SCFA изменения эффективности или активности агонистов β-адренергических рецепторов при различных метаболических фенотипах.
В настоящем исследовании in vitro с использованием нашей модели адипоцитов человека мы исследовали механизм, который мог бы объяснить ранее наблюдаемый in vivo антилиполитический эффект физиологически релевантных смесей SCFA (19). Однако здесь нельзя исключить другие механизмы, которые также могут способствовать антилиполитическому эффекту, вызванному SCFA, на уровне всего тела.Например, параллельно с концентрациями ацетата, концентрации циркулирующего пептида YY (PYY) были увеличены после инфузии смесей SCFA в толстой кишке в нашем эксперименте in vivo (19). Действительно, PYY ранее был признан за его антилиполитическое свойство в адипоцитах человека (34). Кроме того, интригующее исследование на грызунах показало, что SCFA могут влиять на энергетический гомеостаз, включая липолиз через спинные симпатические ганглии и спинномозговые пути (35).
В заключение мы продемонстрировали, что, в частности, наиболее распространенный ацетат SCFA в толстой и периферической областях играет важную роль в регуляции липолиза жировой ткани человека.Мы показали, что люминальный и системно наиболее распространенный ацетат SCFA был главным образом ответственен за антилиполитический ответ, через FFAR-опосредованное ослабление фосфорилирования HSL в адипоцитах человека. Это указывает на то, что модуляция ацетата толстой кишки и системного может быть целью предотвращения или улучшения инсулинорезистентности у человека. Следовательно, будущие исследования должны быть сосредоточены на улучшении диетических стратегий для повышения доступности циркулирующего ацетата, например, через добавление специфических ацетогенных волокон, для улучшения метаболизма липидов человека.
Заявление об этике
клеток hMADS, проверенная модель белых адипоцитов человека для изучения метаболизма липидов, были получены из биоптатов подкожной жировой ткани человека от доноров-мужчин. Доноры-мужчины участвовали в двух различных клинических испытаниях (http://ClinicalTrials.gov, NCT02241421 и NCT02598544). Протоколы исследования были одобрены Медицинским этическим комитетом больницы Джессы, Университет Хасселта и Хасселта, Бельгия, и Медицинским этическим комитетом Медицинского центра Маастрихтского университета, Маастрихт, Нидерланды.Все процедуры соответствовали Хельсинкской декларации (исправленная версия, октябрь 2008 г.).
Авторские взносы
JE, EB и EC отвечали за концепцию и дизайн исследования, анализ и интерпретацию данных, а также критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания. MH, YE и NH сгенерировали данные. JE и EC собрали все данные, выполнили статистический анализ и составили рукопись. CB критически отредактировал рукопись. EB получил финансирование и руководил исследованием.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарим всех добровольцев, участвующих в наших исследованиях.
Финансирование
Исследование финансируется TI Food and Nutrition, государственно-частным партнерством по предконкурентным исследованиям в области пищевых продуктов и питания.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2017.00372/full#supplementary-material.
Список литературы
1. Дельценн Н.М., Кани П.Д., Эверард А., Нейринк А.М., Биндельс Л.Б. Микроорганизмы кишечника как многообещающие мишени для лечения диабета 2 типа. Диабетология (2015) 58 (10): 2206–17. DOI: 10.1007 / s00125-015-3712-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
2. Канфора Э. Э., Блаак Э. Э. Роль полидекстрозы в контроле массы тела и регуляции уровня глюкозы. Curr Opin Clin Nutr Metab Care (2015) 18 (4): 395–400. DOI: 10.1097 / MCO.0000000000000184
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
3. Bloemen JG, Venema K, van de Poll MC, Olde Damink SW, Buurman WA, Dejong CH.Обмен короткоцепочечных жирных кислот через кишечник и печень у людей измеряется во время операции. Clin Nutr (2009) 28 (6): 657–61. DOI: 10.1016 / j.clnu.2009.05.011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
4. Канфора Э. Э., Джокен Дж. В., Блаак Э. Э. Короткоцепочечные жирные кислоты контролируют массу тела и чувствительность к инсулину. Nat Rev Endocrinol (2015) 11 (10): 577–91. DOI: 10.1038 / nrendo.2015.128
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
5.Goossens GH. Роль дисфункции жировой ткани в патогенезе инсулинорезистентности, связанной с ожирением. Physiol Behav (2008) 94 (2): 206–18. DOI: 10.1016 / j.physbeh.2007.10.010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
6. Mensink M, Blaak EE, ван Баак MA, Wagenmakers AJ, Saris WH. Поглощение и окисление свободных жирных кислот из плазмы уже уменьшено у субъектов с высоким риском развития диабета 2 типа. Диабет (2001) 50 (11): 2548–54.DOI: 10.2337 / диабет.50.11.2548
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
7. Jocken JW, Langin D, Smit E, Saris WH, Valle C, Hul GB, et al. Экспрессия жировой триглицерид-липазы и гормоночувствительного белка липазы снижается при ожирении при инсулинорезистентном состоянии. J Clin Endocrinol Metab (2007) 92 (6): 2292–9. DOI: 10.1210 / jc.2006-1318
CrossRef Полный текст | Google Scholar
8. Равуссин Э., Смит С.Р. Повышенное потребление жиров, нарушение окисления жиров и отказ от пролиферации жировых клеток приводят к эктопическому накоплению жира, инсулинорезистентности и сахарному диабету 2 типа. Ann N Y Acad Sci (2002) 967 (1): 363–78. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.2002.tb04292.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
9. Бриттон К.А., Фокс С.С. Внематочные жировые отложения и сердечно-сосудистые заболевания. Тираж (2011) 124 (24): e837–41. DOI: 10.1161 / CIRCULATIONAHA.111.077602
CrossRef Полный текст | Google Scholar
10. Крауз Дж. Р., Герсон К. Д., ДеКарли Л. М., Либер К. С.. Роль ацетата в снижении содержания свободных жирных кислот в плазме крови, производимых этанолом у человека. J. Lipid Res. (1968) 9 (4): 509–12.
PubMed Аннотация | Google Scholar
11. Xiong Y, Miyamoto N, Shibata K, Valasek MA, Motoike T, Kedzierski RM и др. Короткоцепочечные жирные кислоты стимулируют выработку лептина в адипоцитах через рецептор GPR41, связанный с G-белком. Proc Natl Acad Sci U S A (2004) 101 (4): 1045. DOI: 10.1073 / pnas.2637002100
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
12. Ge H, Li X, Weiszmann J, Wang P, Baribault H, Chen JL, et al.Активация рецептора 43, связанного с G-белком, в адипоцитах приводит к ингибированию липолиза и подавлению свободных жирных кислот в плазме. Эндокринология (2008) 149 (9): 4519. DOI: 10.1210 / en.2008-0059
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
14. Кимура И., Одзава К., Иноуэ Д., Имамура Т., Кимура К., Маэда Т. и др. Микробиота кишечника подавляет опосредованное инсулином накопление жира через рецептор короткоцепочечных жирных кислот GPR43. Нац Коммуна (2013) 4: 1829.DOI: 10.1038 / ncomms2852
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
15. Иноуэ Д., Цудзимото Г., Кимура И. Регулирование энергетического гомеостаза с помощью GPR41. Фронт-эндокринол (2014) 5:81. DOI: 10.3389 / fendo.2014.00081
CrossRef Полный текст | Google Scholar
16. Хонг Й.Х., Нисимура Й., Хисикава Д., Цузуки Х., Мияхара Х., Гото С. и др. Ацетатные и пропионатные короткоцепочечные жирные кислоты стимулируют адипогенез через GPCR43. Эндокринология (2005) 146 (12): 5092.DOI: 10.1210 / en.2005-0545
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
17. Заиби М.С., Стокер С.Дж., О’Доуд Дж., Дэвис А., Беллахсен М., Которн М.А. и др. Роль GPR41 и GPR43 в секреторных ответах лептина адипоцитов мышей на короткоцепочечные жирные кислоты. FEBS Lett (2010) 584 (11): 2381–6. DOI: 10.1016 / j.febslet.2010.04.027
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
18. Вангавети В., Раш К., Томас Л., Расалам Р. Р., Малабу Ю. Х., МакКумбе С. Г. и др.Короткоцепочечные жирные кислоты увеличивают экспрессию и секрецию фактора-1, происходящего из стромальных клеток, в повторных адипоцитах мыши и человека. Гормоны (2014) 13: 532–42. DOI: 10.14310 / горм.2002.1519
CrossRef Полный текст | Google Scholar
19. Canfora EE, Beek CM, Jocken JW, Goossens GH, Holst JJ, Damink SWO, et al. Инфузии смесей короткоцепочечных жирных кислот в толстой кишке способствуют энергетическому обмену у мужчин с избыточным весом / ожирением: рандомизированное перекрестное исследование. Sci Rep (2017) 7 (1): 2360.DOI: 10.1038 / s41598-017-02546-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
20. Безайр В., Майрал А., Рибет С., Лефорт С., Гирусс А., Джокен Дж. И др. Вклад липазы триглицеридов жировой ткани и гормоночувствительной липазы в липолиз в адипоцитах hMADS. J Biol Chem (2009) 284 (27): 18282–91. DOI: 10.1074 / jbc.M109.008631
CrossRef Полный текст | Google Scholar
21. Jocken JW, Goossens GH, Popeijus H, Essers Y, Hoebers N, Blaak E.Вклад дефицита липазы в митохондриальную дисфункцию и инсулинорезистентность в адипоцитах hMADS. Int J Obes (2015) 40 (3): 507–13. DOI: 10.1038 / ijo.2015.211
CrossRef Полный текст | Google Scholar
22. Каммингс Дж., Помаре Э., Бранч В., Нейлор С., Макфарлейн Г. Короткоцепочечные жирные кислоты в толстой кишке, воротной, печеночной и венозной крови человека. Кишечник (1987) 28 (10): 1221. DOI: 10.1136 / gut.28.10.1221
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
23.Фернандес Дж., Фогт Дж., Волевер Т. Кинетическая модель метаболизма ацетата у здоровых и гиперинсулинемических людей. Eur J Clin Nutr (2014) 68 (9): 1067–71. DOI: 10.1038 / ejcn.2014.136
CrossRef Полный текст | Google Scholar
24. van der Beek CM, Canfora EE, Lenaerts K, Troost FJ, Damink SWO, Holst JJ, et al. Дистальные, а не проксимальные инфузии ацетата толстой кишки способствуют окислению жиров и улучшают метаболические маркеры у мужчин с избыточным весом / ожирением. Clin Sci (2016) 130 (22): 2073–82.DOI: 10.1042 / CS20160263
CrossRef Полный текст | Google Scholar
25. Абердеин Н., Швейцер М., Болл Д. Ацетат натрия снижает фосфорилирование гормоночувствительной липазы в стимулированных изопротеренолом зрелых адипоцитах 3T3-L1. Адипоцит (2014) 3 (2): 121. DOI: 10.4161 / adip.27936
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
26. Canfora EE, van der Beek CM. Дополнение диеты галактоолигосахаридами увеличивает бифидобактерии, но не повышает чувствительность к инсулину у лиц с преддиабетом, страдающих ожирением. Гастроэнтерология (2017) 153 (1): 87–97.e3. DOI: 10.1053 / j.gastro.2017.03.051
CrossRef Полный текст | Google Scholar
27. Лим Дж., Генри С.Дж., Халдар С. Уксус как функциональный ингредиент для улучшения постпрандиального гликемического контроля — результаты вмешательства человека и молекулярные механизмы. Mol Nutr Food Res (2016) 60 (8): 1837–49. DOI: 10.1002 / mnfr.201600121
CrossRef Полный текст | Google Scholar
28. Фернандес Дж., Фогт Дж., Волевер TM. Внутривенный ацетат вызывает больший отскок свободных жирных кислот у нормальных людей, чем у людей с гиперинсулинемией. Eur J Clin Nutr (2012) 66 (9): 1029–34. DOI: 10.1038 / ejcn.2012.98
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
29. Гирусс А., Тавернье Дж., Валле С., Моро С., Мейхерт Н., Динель А.-Л. и др. Частичное ингибирование липолиза жировой ткани улучшает метаболизм глюкозы и чувствительность к инсулину без изменения жировой массы. PLoS Biol (2013) 11 (2): e1001485. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1001485
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
30.Schweiger M, Romauch M, Schreiber R, Grabner GF, Hütter S, Kotzbeck P и др. Фармакологическое ингибирование липазы триглицеридов жировой ткани корректирует инсулинорезистентность и гепатостеатоз у мышей, вызванные диетой с высоким содержанием жиров. Нац Коммуна (2017) 8: 14859. DOI: 10.1038 / ncomms14859
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
31. Large V, Hellström L, Reynisdottir S, Lönnqvist F, Eriksson P, Lannfelt L, et al. Полиморфизм гена бета-2-адренорецептора человека очень часто встречается при ожирении и связан с измененной функцией бета-2-адренорецептора адипоцитов. Дж. Клин Инвест (1997) 100 (12): 3005. DOI: 10.1172 / JCI119854
CrossRef Полный текст | Google Scholar
32. Hoffstedt J, Arner P, Hellers G, Lönnqvist F. Вариация адренергической регуляции липолиза между сальниковыми и подкожными адипоцитами у мужчин с ожирением и без ожирения. J. Lipid Res. (1997) 38 (4): 795–804.
PubMed Аннотация | Google Scholar
33. Jocken J, Goossens G, van Hees A, Frayn K, van Baak M, Stegen J, et al. Влияние бета-адренергической стимуляции на липолиз подкожной жировой ткани всего тела и брюшной полости у худых и полных мужчин. Диабетология (2008) 51 (2): 320–7. DOI: 10.1007 / s00125-007-0866-y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
34. Valet P, Berlan M, Beauville M, Crampes F, Montastruc J, Lafontan M. Нейропептид Y и пептид YY ингибируют липолиз в жировых клетках человека и собаки через G-белок, чувствительный к коклюшному токсину. Дж. Клин Инвест (1990) 85 (1): 291. DOI: 10.1172 / JCI114425
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
35.De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, Goncalves D, Vinera J, Zitoun C, Duchampt A, et al. Метаболиты, вырабатываемые микробиотой, улучшают метаболизм через нервные цепи кишечника и мозга.