Фитнес фэмили типанова: Клубы Fitness Family с бассейном

🏆 Трофеи

Это место было награждено 2 трофеями в следующих категориях:

Адрес

Ulitsa Tipanova, 27/39, Санкт-Петербург, Россия, 196211

Сайт

http: // фитнес-семья.RU

Рейтинг на Google Maps

Последнее обновление: 2020-07-26

Самые популярные места поблизости

1. 4.70 Британский музей (109997 отзывов) Сокровище историка
2. 4.70 ВВЦ (104651 отзывов) Мероприятие с 4-мя традиционными залами
3. 4.ЦПКиО им. Горького, 70 (69951 отзывов) Парк со спортом и кино под открытым небом
4. 4.80 Петергоф (64243 отзыва) Королевский дворец на набережной, парк и музеи
5. 4.40 Парк Зарядье (62747 отзывов) Современный парк с плавучим мостом
6. 4.90 Дворцовая площадь (60530 отзывов) Площадь, облицованная неоклассическими зданиями
7. 4.80 Музей-заповедник Царицыно (49279 отзывов) Роскошный дворец с музеем изобразительных искусств
8. 4.80 Государственный Эрмитаж (48509 отзывов) Музей культуры и искусства, основанный в 1764 году
9. 4.50 Торговый центр Галерея (48363 отзыва) Большой многоуровневый торговый комплекс
10. 4.90 Зимний дворец (46155 отзывов) Бывшая резиденция российских императоров
11. 4.90 Исаакиевский собор (40793 отзывов) Богато украшенное религиозное здание с золотым куполом
12. 4.80 Петропавловская крепость (34411 отзывов) Первоначальная городская стоянка, основанная в 1703 году
13. 4.80 Спас на Крови (32647 отзывов) Церковь 1880-х годов с ярким и роскошным дизайном
14. 4.60 Мега Дыбенко (32470 отзывов) Игровая площадка
15. 4.70 Парк 300-Летия Санкт-Петербурга (31400 отзывов) Ухоженный парк с памятником и др.

3⋆ КОСМОС ≡ Санкт-Петербург, Россия ≡ Самые низкие тарифы на бронирование для Космоса в Санкт-Петербурге

Отель Космос 3 *

Детские кроватки

Детский буфет

Детская игровая площадка

3-звездочный отель Космос Санкт-Петербург расположен 2.2 км от впечатляющего Памятника героическим защитникам Ленинграда и 1,1 км от Московской площади. Эта гостиница с 19 номерами с видом на город расположена в нескольких минутах езды от Чесменской церкви.

Эта гостиница в Санкт-Петербурге расположена в Московском районе.

Уютные квартиры оснащены многоканальным телевидением, звуконепроницаемыми окнами и датчиками дыма. В них есть внешние ванные комнаты с банными полотенцами, феном и полотенцами.

В отеле предлагается бесплатный завтрак «шведский стол».В ресторане с обслуживанием по меню подают блюда европейской кухни. Гости могут попробовать блюда европейской, итальянской, японской и русской кухни в баре Sashas, ​​расположенном в 350 метрах. Поездка на автомобиле до аэропорта Пулково занимает 20 минут. Удобства для отдыха включают телевизор с плоским экраном, спутниковое телевидение и телевизор с плоским экраном.

Политика отеля

Регистрация заезда: с 14:00 до 23:59

Выезд: до 12:00

Удобства

Общий

• Курение на территории запрещено
• Wi-Fi
• Парковка
• Сейф
• Круглосуточная стойка регистрации
• VIP-регистрация заезда / выезда
• Экспресс-регистрация заезда / выезда
• Домашние животные запрещены
• Круглосуточная охрана
• Камера хранения
• Лифт
• Подарочный / газетный киоск
• Парикмахерская
• Торговые автоматы
• Детекторы дыма
• Огнетушители

Еда напитки

• Сушилка
• Завтрак
• Ресторан
• Специальное диетическое меню

Досуг

• Спа и оздоровительный центр
• Фитнес-центр

Услуги

• Обслуживание номеров
• Уборка номеров
• Прачечная
• Магазины / коммерческие услуги
• Факс / ксерокопирование

Удобства в номере

• Отопление
• Звукоизолированные номера
• Гардеробная
• Обеденный стол
• Гладильные принадлежности
• Стиральная машина
• Бесплатные туалетные принадлежности
• Телевизор с плоским экраном
• Будильник AM / FM
• Детские кроватки
• Настольные игры
• Детский буфет
• DVD / Видео для детей
• Детская игровая площадка

• Курение запрещено
• Wi-Fi
• Парковка
• Сейф
• Круглосуточная рецепция
• VIP-регистрация заезда / выезда
• Экспресс регистрация заезда / выезда
• Домашние животные запрещены
• Круглосуточная охрана
• Камера хранения

Расположение

Космос

Текущее местоположение

Планировщик маршрута

Введите точку отправления (по крайней мере, адрес и город), чтобы получить инструкции по проезду к отелю.

• Схема проезда
• Общественный транспорт
• Маршрут пешком

Не удалось найти маршрут.

• Железнодорожные вокзалы

• Варшавский вокзал

  6.5 км

Выберите номер

Уютные номера оснащены многоканальным телевидением, звуконепроницаемыми окнами и датчиками дыма.В них есть внешние ванные комнаты с банными полотенцами, феном и полотенцами.

Пожалуйста, выберите даты, чтобы увидеть свободные номера.

Поиск свободных номеров

Пожалуйста, подождите ……

Проверка доступных отелей

Поиск отелей для вас…

Ограничение физических упражнений, связанное с бессимптомным поражением левого желудочка: аналогия с сердечной недостаточностью стадии B.

Важность Недифференцированная одышка часто встречается в пожилом возрасте, но относительный вклад субклинической сердечной дисфункции неизвестен.Нарушения структуры и функции сердца могут быть характеристикой недифференцированной одышки у пожилых людей, что может дать представление о скрытой сердечной недостаточности (СН). Задача Количественно оценить связь недифференцированной одышки с сердечной дисфункцией после учета других потенциальных факторов. Дизайн, сеттинг и участники В этом поперечном исследовании использовались данные участников исследования риска атеросклероза в сообществах 65 лет и старше, которые посетили пятый визит в рамках исследования (с 2011 по 2013 год) и у которых не было диагностировано сердечная недостаточность, хроническая обструктивная болезнь легких, патологическое ожирение или тяжелое заболевание почек. .Анализы проводились с октября 2017 года по июнь 2018 года. Экспозиции Одышка измерялась с использованием модифицированной шкалы Медицинского исследовательского совета, с оценкой менее 2 баллов от отсутствия до легкой степени и баллами 2 или более от умеренной до тяжелой. Основные результаты и меры Используя многомерную логистическую регрессию, связь недифференцированной одышки была определена с использованием структуры сердца, систолической и диастолической функции, легочного давления (эхокардиография), легочной функции (спирометрия), скорости клубочковой фильтрации, гемоглобина, индекса массы тела, депрессии и физической работоспособности.Риск, связанный с популяцией, рассчитывался для каждого показателя дисфункции. Полученные результаты Среди 4342 участников (средний [SD] возраст 75,9 [5,0] лет; 2533 [58,3%] женщины) у 1173 (27,0%) была недифференцированная одышка. Одышка от умеренной до тяжелой наблюдалась у 574 участников (13,2%) и была связана с гипертрофией левого желудочка (ЛЖ) (отношение шансов [ОШ], 1,53; 95% ДИ, 1,25-1,87; Р <0,001) и диастолическим ЛЖ (ОШ). 1,46; 95% ДИ, 1,20–1,78; P <0,001) и систолическая (OR, 1,28; 95% ДИ, 1,05–1,56; P = 0,02) дисфункция.Одышка от умеренной до тяжелой также была связана с обструктивными (OR, 1,59; 95% ДИ, 1,28-1,99; P <0,001) и рестриктивными (OR, 2,56; 95% ДИ, 1,99-3,27; P <0,001) данными спирометрии. , почечная недостаточность (OR, 1,32; 95% ДИ, 1,08-1,61; P = 0,01), анемия (OR, 1,72; 95% ДИ, 1,39-2,12; P <0,001), ниже (OR, 2,77; 95% CI, 2,18-3,51; P <0,001) и верхних (OR, 1,82; 95% CI, 1,49-2,23; P <0,001) слабость конечностей, депрессия (OR, 3,01; 95% CI, 2,24-4,25; P < 0,001) и ожирение (ОШ 2,35; 95% ДИ 1.95-2,83; P <0,001). После учета этих факторов одышка от умеренной до тяжелой была связана с гипертрофией ЛЖ (OR, 1,30; 95% ДИ, 1,01–1,67; P = 0,04) и не была связана с систолической или диастолической функцией. Напротив, в полностью скорректированной модели другие показатели системы органов были связаны с одышкой, за исключением скорости клубочковой фильтрации и силы захвата. Популяционный риск одышки, связанный только с ожирением, составил 22,6% по сравнению с 5,8% для гипертрофии ЛЖ. Выводы и актуальность Недифференцированная одышка является многофакторной у пожилых людей, и это исследование показало связь с ожирением.При учете других соответствующих систем органов сердечно-сосудистая функция плохо различает пациентов с одышкой и пациентов без одышки. Следовательно, не следует предполагать, что одышка представляет собой скрытую СН в этой популяции.

Изменение плоидности многоядерных клеток при стрессе

Mol Biol Cell. 2015 15 марта; 26 (6): 1129–1140.

Университет Северной Каролины

Департамент биологических наук, Дартмутский колледж, Ганновер, NH 03755

Получено 15 сентября 2014 г .; Пересмотрено 8 января 2015 г .; Принята в печать 16 января 2015 г.

«ASCB®», «Американское общество клеточной биологии®» и «Молекулярная биология клетки®» являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

GUID: 05F4F161-282C-4127-8F44-3F4CA9D17F8E

GUID: C58A81EC-5500-451B-823A-C77

013A

GUID: 9BEA6093-93E1-407C-B942-160034F1D860

GUID: 3D5-A7EA-476B-B855-E14F9E7

Abstract

Изменчивость плоидности обнаруживается в таких разнообразных контекстах, как солидные опухоли, лекарственная устойчивость при грибковой инфекции и нормальное развитие.Изменение числа копий хромосомы или генома поддерживает адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды, но также связано с нарушениями приспособленности, связанными с дисбалансом белков. И анеуплоидия, и полиплоидия могут возникать в результате многоядерных состояний после неудачного цитокинеза или слияния клеток. Последствия вариации плоидности синцитий трудно предсказать, поскольку белковый дисбаланс теоретически компенсируется общей цитоплазмой. Мы исследовали плоидность у естественно многоядерного гриба Ashbya gossypii .Используя интегрированные наборы lac-операторов, мы обнаружили, что количество хромосом существенно варьируется между ядрами, имеющими общую цитоплазму. Популяции ядер варьируются от 1N до> 4N, с разными полиплоидиями в одной и той же клетке и низкими уровнями анеуплоидии. Степень изменчивости плоидности увеличивается с возрастом клеток. В ответ на клеточный стресс полиплоидные ядра уменьшаются, а гаплоидные ядра преобладают. Эти данные предполагают, что смешанная плоидность допустима в этих синцитиях; однако могут быть затраты, связанные с вариациями, поскольку стресс гомогенизирует геномное содержание ядер.Более того, результаты показывают, что совместное использование генных продуктов ограничено, и, таким образом, существует неполная буферизация вариации плоидности, несмотря на общий цитозоль.

ВВЕДЕНИЕ

Вариация плоидности внутри организма может быть определяющим признаком либо патологий, либо нормальных программ развития. Понимание как полезности, так и пагубных последствий изменения количества копий ДНК связано с проблемами в столь разных областях, как биология рака, микробный патогенез и экология, а также развитие растений.Вариация числа копий может рассматриваться от масштаба небольших вставок или делеций, которые влияют на отдельный ген, до амплификаций целых хромосом (анеуплоидия) или всего генома (полиплоидия). Изменения числа копий ДНК могут приводить к изменениям уровней мРНК и белков, кодируемых в амплифицированных областях (Torres et al. , 2007; Pavelka et al. , 2010). Таким образом, экспрессия участков с измененным числом копий может существенно повлиять на физиологию клеток.

Последствия анеуплоидии для функции клеток сильно различаются и зависят от контекста. Большинство солидных опухолей человека имеют анеуплоидные кариотипы, а также состоят из быстро пролиферирующих клеток (Weaver and Cleveland, 2006). Устойчивый рост опухоли парадоксален в свете некоторых модельных анеуплоидных клеток, которые, как можно наблюдать, медленно растут (Torres et al. , 2007). Механизмы, с помощью которых опухоли переносят анеуплоидию, все еще изучаются. Однако одна из известных функций ключевых супрессоров опухолей — контролировать и останавливать рост, когда клетки демонстрируют хромосомную нестабильность, контекст, в котором возникают анеуплоидии (Li et al., 2010; Томпсон и Комптон, 2010). Эти программы отменяются с инактивацией опухолевых супрессоров, совпадающей с прогрессированием опухоли. Работа с модельными анеуплоидными клетками дрожжей и фибробластов с сконструированными дополнительными хромосомами также указывает на то, что одной из основных причин дефектов роста является протеотоксический стресс. Этот стресс возникает из-за попытки расщепить избыточные белки, и предположительно опухолевые клетки адаптируются к этому стрессу (Torres et al. , 2007; Pavelka et al. , 2010; Oromendia et al., 2012).

Как и в опухолях, анеуплоидия также обычно наблюдается у различных видов грибов в естественных, клинических и лабораторных условиях (Morrow and Fraser, 2013; Bennett et al. , 2014). Например, у грибкового патогена Candida albicans анеуплоидные клетки легко возникают в результате временной тетраплоидизации и в ответ на противогрибковые препараты (Forche et al. , 2008; Selmecki et al. , 2010; Harrison et al. , 2014).Эта способность ремоделировать геном полезна для патогена во время инфекции и способствует развитию лекарственной устойчивости. Изменение плоидности также наблюдается в ходе полового развития и инфицирования человеческим патогеном Cryptococcus neoformans (Idnurm, 2010; Semighini et al. , 2011). Кроме того, в некоторых стрессовых условиях анеуплоидные клетки Saccharomyces cerevisiae подходят больше, чем эуплоидные штаммы, что указывает на то, что вариация плоидности может быть высокоадаптивной в зависимости от условий окружающей среды (Pavelka et al., 2010; Yona et al. , 2012; Zhu et al. , 2012). Кроме того, промышленные штаммы дрожжей Saccharomyces , разработанные для пивоварения и выпечки, в основном являются полиплоидными и / или анеуплоидными (Querol and Bond, 2009). Таким образом, способность индуцировать и переносить большие изменения генома может обеспечить адаптивное преимущество для различных грибов в контексте патогенеза и экологического стресса.

Анеуплоидия может возникать по множеству различных молекулярных механизмов.Известные в настоящее время пути к анеуплоидии включают сбой в контрольной точке сборки веретена (SAC), измененную коррекцию ошибок неправильно прикрепленных хромосом и временную полиплоидизацию из-за сбоя цитокинеза или слияния клеток (Burds et al. , 2005; Lu and Kang, 2009; Krajcovic и др., , 2011; Bakhoum, Compton, 2012). Имеются данные о том, что полиплоидия может увеличить вероятность того, что многие клетки, включая клетки почкующихся дрожжей, станут анеуплоидными (Storchova et al., 2006). Сходным образом анеуплоидные клетки печени могут возникать из исходной полиплоидной популяции (Duncan et al. , 2010). В то время как полиплоидия долгое время ценилась за функциональную значимость для растений и конкретных тканей животных, недавние работы по грибам начали фокусировать внимание на полиплоидии как двигателе эволюции (Albertin and Marullo, 2012). Таким образом, полиплоидия может служить резервуаром для генерации функциональных анеуплоидий при определенных стрессах или быть полезной сама по себе для конкретных метаболических потребностей в данной ткани или окружающей среде.

Большинство нитчатых грибов существуют в синцитиальных состояниях, в которых многие ядра имеют общую цитоплазму во время роста мицелия. Более того, очевидно, что у многих грибов разные геномы могут сосуществовать, сотрудничать и / или конкурировать в одной клетке (Roper et al. , 2011). Однако менее ясно, как геномы, различающиеся из-за хромосомного дисбаланса, могут функционировать в грибковых синцитиях. Синцития теоретически может быть очень благоприятной средой для анеуплоидии, поскольку дисбаланс может дополняться несколькими ядрами в одной и той же цитоплазме.Для этого необходимо, чтобы генные продукты были хорошо перемешаны, чтобы белковый дисбаланс цитозольного буфера. В этом случае синцитиальные клетки могут иметь высокие частоты анеуплоидии и меньше страдать от последствий для приспособленности, чем одноядерные клетки с хромосомным дисбалансом. Эта идея подтверждается многоядерными состояниями, наблюдаемыми в опухолях, которые также являются анеуплоидными (Lu and Kang, 2009). В качестве альтернативы, если цитозоль компартментален в больших многоядерных клетках, так что генные продукты не разделяются между ядрами, тогда плоидность может контролироваться более жестко из-за функционально гетерогенного цитозоля.

Мы наблюдали плоидность многоядерного гриба Ashbya gossypii , чтобы изучить изменчивость хромосомного содержания отдельных ядер в пределах одной клетки. Предыдущая работа в Ashbya предположила, что эуплоидное состояние системы является гаплоидным в многоядерном мицелии, а одноядерные гаплоидные споры продуцируются путем бесполого спороношения (Dietrich et al. , 2004). В Ashbya , ядра имеют очень вариабельную продолжительность цикла деления, так что ядра делятся несинхронно со своими соседями (Gladfelter et al., 2006). Одним из возможных источников временных вариаций между ядрами в одной клетке является различное содержание ДНК. В этом исследовании мы проверили гипотезы о том, что существует вариация плоидности между ядрами в одной и той же клетке и что анеуплоидия допустима в синцитии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание ДНК варьируется в зависимости от ядра в отдельной клетке

Клетки Ashbya , экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, меченный гистон-4 (Hhf1-GFP), были сняты на пленку, и была измерена интенсивность флуоресценции гистонового сигнала в отдельных ядрах. при рождении (пре-репликация ДНК) и за мгновение до деления (пост-репликация ДНК).Если все ядра гаплоидные, мы бы предсказали два дискретных пика интенсивности гистонов, соответствующих 1N плоидности при рождении и 2N плоидности перед митозом (). Удивительно, но ядра показали широкий диапазон интенсивности при рождении и непосредственно перед митозом (, N = 47 ядер). Два распределения интенсивности демонстрируют существенное совпадение, хотя средняя интенсивность митоза умеренно, но значительно выше, чем при рождении (среднее при рождении, 12720 ± 3970 а.е.; среднее митозное, 15030 ± 5623 а.u .; двухвыборка t тест, p <0,03). Изменение сигнала не связано с дифференциальным фотообесцвечиванием, поскольку интенсивность ядер Hhf1-GFP не коррелирует с моментом времени при получении изображения (дополнительный рисунок S1). Это говорит о том, что ядра рождаются и делятся с различным количеством ДНК в одной и той же клетке.

Содержание ДНК варьируется между ядрами Ashbya . (A) Схема прогнозируемых относительных изменений интенсивности Hhf1-GFP до репликации и после репликации.(B) Интенсивность Hhf1-GFP при рождении и митозе. Скорректированная по фону интенсивность GFP измерялась путем установления порога вокруг центральной ядерной координаты, которая регистрировалась вручную непосредственно до и после митоза (47 ядер; Anderson et al. , 2013). (C) Скорректированная по фону интенсивность Hhf1-GFP, суммированная для каждого ядра с течением времени. Каждая линия представляет одно ядро ​​(47 ядер). (D) Кратное изменение интенсивности Hhf1-GFP с течением времени для каждого отслеживаемого ядра. Изменение складки определяли как максимальную интенсивность Hhf1-GFP, нормированную на исходную интенсивность Hhf1-GFP для каждого ядра (47 ядер).(E) Гистограмма интенсивности DAPI для всех фаз клеточного цикла. Стадия клеточного цикла оценивалась по состоянию SPB, а интенсивность GFP нормализовалась к среднему значению популяции с одним SPB. Черные столбцы представляют один SPB (G1; N = 126), зеленые столбцы представляют два SPBd (S / G2; N = 117), а синие столбцы представляют два биориентированных SPB (M; N = 19) .

Чтобы гарантировать, что интенсивность гистонов увеличивается с прогрессированием клеточного цикла и репликацией ДНК, мы построили график интенсивности гистонов для отдельных ядер и обнаружили, что для всех ядер сигнал увеличивается с прогрессированием в сторону митоза.Время от минимальной до максимальной интенсивности сигнала варьировалось от 30 до 134 минут (среднее значение 83 минуты, SD = 21 минута, N = 47) со средним 1,5-кратным изменением интенсивности гистонов (). Это изменение не может быть двойным из-за пула растворимых гистонов, который присутствует в ядре при рождении и используется для создания нуклеосом во время репликации, или из-за того, что реплицируется не вся ДНК. Эти данные предполагают, что продолжительность S-фазы, вероятно, сильно варьируется, и это может быть связано с переменным содержанием ДНК, гетерогенным импортом Hhf1-GFP или другими ограничивающими факторами, контролирующими репликацию ДНК.Поэтому в качестве второй меры содержания ДНК в клеточном цикле мы измерили включение ДНК-красителя 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в ядра, которые оценивали для стадии клеточного цикла на основе состояния корпус полюса шпинделя (СПБ). Как видно из живых клеток, ядра в одном и том же состоянии SPB и, предположительно, на одной и той же стадии клеточного цикла, демонстрируют широкое распределение интенсивностей DAPI, подтверждая идею о том, что могут быть существенные различия в содержании ДНК между ядрами в одной и той же клетке () .

Ядра различаются по количеству копий отдельных хромосом

Учитывая гетерогенность сигналов гистонов и DAPI, мы затем исследовали количество отдельных хромосом, интегрировав 32 повтора lac-оператора в межгенные области либо хромосомы I (наименьшего размера), либо хромосома VI (самая большая по размеру) в штамме, также экспрессирующем GFP-LacI-NLS (, A и B). Ядра имели от нуля до более четырех пятен сигналов GFP-LacI для каждой из хромосом; наибольшее количество обнаруженных пятен составило шесть (, A – C;> 300 ядер для каждой хромосомы, клетки, набранные на стадии> 100 ядер).На очень низкой частоте ядра можно было увидеть без сигнала LacI, что указывает на редкую потерю хромосомы. Работа с аналогичным образом маркированными хромосомами в S. cerevisiae показала, что сигналы LacI на сестринских хромосомах не разрешаются до анафазы, пока повторяющиеся последовательности далеки от центромер (Straight et al. , 1997; Pearson et al. , 2001). Это говорит о том, что ядра Ashbya с ≥2 пятнами на самом деле имеют дополнительные хромосомы, а не завершенную S-фазу.Тем не менее, мы оценили состояние SPB ядер вместе с сигналами LacI и обнаружили, что 40% ядер с одним SPB имеют> 1 пятно LacI, предполагая, что присутствие дополнительных пятен LacI происходит не просто из-за репликации (). В качестве альтернативной меры количества хромосом мы использовали флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) для визуализации хромосомы VI в локусе CLN1 / 2 . В частности, мы локализовали мРНК CLN1 / 2 для идентификации сайтов активной транскрипции и определения числа хромосом в ядрах.Согласно этому подходу, 32% ядер имеют две или более копии хромосомы VI (; N = 436). Таким образом, эти два разных подхода к обнаружению отдельных хромосом подтверждают идею о том, что отдельные ядра различаются по содержанию хромосом и что значительная часть популяции ядер не гаплоидна.

Индивидуальные хромосомы различаются между ядрами. (A, B) Схема хромосом Ashbya . Все семь хромосом и митохондриальная ДНК показаны в масштабе.Красные овалы обозначают центромеры; зеленые полосы указывают на расположение интеграции 32lacO :: Gen3 на хромосомах I (A) и VI (B). Интеграции lacO хромосомы I и IV находятся на расстоянии 126 и 56 т.п.н. от центромеры, соответственно. Неподвижные изображения ядер Ashbya , содержащих от нуля до четырех копий обеих хромосом I и VI, показаны рядом с каждой схемой. (C) Количественная оценка количества хромосом в ядрах Ashbya . Количество хромосомы I указано черным, а количество хромосомы VI — серым (хромосома I, N = 350; VI, N = 364).(D) Количество хромосомы I не зависит от фазы клеточного цикла, на что указывает состояние SPB. Темно-синие столбцы представляют собой распределение хромосомы I для одного SPB (G1), а голубые столбцы представляют распределение хромосомы I для двух SPB (S / G2 / M). Один СПБ, N = 112; два SPB, N = 66. (E) РНК FISH отдельных ядер с использованием зондов CLN1 / 2 -TAMRA, которые гибридизуются с мРНК. Сигналы в ядре представляют собой участки экспрессии гена, и> 90% ядер экспрессируют транскрипт CLN1 / 2 .Изображения ДНК (Hoechst) и хромосом и объединенное изображение показывают, что отдельные ядра, содержащие один или два сигнала, указывают на сайты, где CLN1 / 2 экспрессируется в одном ядре.

Число хромосом увеличивается с возрастом клеток

Затем мы рассмотрели, как частота изменения числа хромосом изменяется с возрастом клеток. Ashbya споры не прорастают синхронно, поэтому мы использовали количество ядер в клетке как меру возраста. Это связано с тем, что количество ядер увеличивается с ростом, что, как правило, одинаково у людей определенного возраста.Мы определили «молодые» клетки как клетки с <40 ядрами и «старые» клетки как клетки с ≥40 ядрами. Интересно, что количество хромосом I на ядро ​​увеличивается с возрастом мицелия, со сдвигом от режима 1 в очень молодых клетках и режима 2 в более старых клетках. Это говорит о том, что отклонения от гаплоидного набора хромосом накапливаются с возрастом клетки ().

Вариация хромосом Ashbya не зависит от местоположения в клетке и увеличивается с возрастом клетки. (A) Подсчет хромосомы I и возраст клеток.Черные столбцы представляют собой распределение хромосомы I для молодых клеток (<40 ядер), а серые столбцы представляют собой распределение хромосомы I для более старых клеток (> 40 ядер). Молодые клетки, N = 178; старые клетки, N = 350. (B) График кумулятивного распределения количества хромосомы I и расстояния от кончика клетки (ANOVA, F = 1,56, p > 0,20).

Ядра с повышенным содержанием хромосом расположены по всей клетке

Увеличение числа копий хромосом с возрастом клетки побудило нас изучить положение ядер с дополнительной ДНК.Ядра в клетках Ashbya , как было показано, перемещаются и перемешиваются внутри мицелия (Anderson et al. , 2013). Поэтому мы предположили, что ядра с множеством копий отдельных хромосом могут быть расположены дальше от активно растущих кончиков клеток Ashbya . Это могло бы гарантировать, что гаплоидные ядра будут преимущественно заселять наиболее активные части клетки, тогда как ядра с измененным числом хромосом располагаются в более внутренних частях клетки.Удивительно, однако, что нет явного отклонения в положении для конкретных плоидностей, поскольку ядра с каждым числом хромосом были обнаружены как близко, так и далеко от кончиков растущих клеток (; дисперсионный анализ [ANOVA], F = 1,56, p > 0,20). Таким образом, ядра с изменяющейся плоидностью могут быть обнаружены по всей клетке, что указывает на то, что ядра с измененной плоидностью являются функциональными или, по крайней мере, допустимыми даже в активно растущих областях.

Хромосомы точно сегрегированы при митозе

Учитывая вариацию числа копий хромосом I и VI и увеличение по мере старения клеток, мы предположили, что ядер Ashbya неправильно расщепляли хромосомы во время митоза.Мы снимали клетки с меченой хромосомой I и, что примечательно, не обнаружили никаких доказательств неправильной сегрегации, как это определено равным наследованием пятен LacI-GFP (и дополнительных фильмов S1 и S2, N = 36 митозов). Независимо от того, начиналось ли наблюдаемое ядро ​​с одного или двух пятен LacI, все отмеченные хромосомы были точно разделены. В соответствии с точной сегрегацией, большинство сестринских ядер родились со сравнимыми уровнями интенсивностей Hhf1-GFP, что было бы маловероятно, если бы имелись большие хромосомные дисбалансы (, 15 сестринских пар).Сходство между сестрами было замечено независимо от интенсивности материнского ядра. Эти данные подтверждают идею о том, что вариация числа копий хромосом не возникает из-за неаккуратной сегрегации хромосом в митозе. Таким образом, даже в синцитиальной клетке, где теоретически допустима большая вариабельность числа копий генома, существует контроль нестабильности хромосом.

Ashbya точно разделяет хромосомы при митозе. (A) Неподвижные изображения сегрегации хромосом при митозе.Вверху, кадры из дополнительного фильма S1, на которых изображена одна копия хромосомы I. Стрелки указывают на отдельные точки хромосомы. Внизу кадры из дополнительного фильма S2, на которых показаны две копии хромосомы I. Звездочка расположена между двумя копиями хромосомы I в каждом ядре. (B) Интенсивность сестры Hhf1-GFP при рождении. Суммарная интенсивность Hhf1-GFP более яркой сестры нанесена черным цветом, а более тусклая сестра наложена серым (15 пар сестер). (C) Тестовая диаграмма Колмогорова-Смирнова (K-S) наблюдаемых сестринских интенсивностей Hhf1-GFP.Наблюдаемая разница в интенсивности сестринского Hhf1-GFP при рождении (сразу после митоза) отображается в виде графика кумулятивного распределения черным цветом. Была рассчитана рандомизированная разница для двух разных популяций наблюдаемых ядер; самые низкие 10 наблюдаемых интенсивностей Hhf1-GFP использовали как распределение для 1N, а самые высокие 10 наблюдаемых интенсивностей Hhf1-GFP использовали как распределение для 2N. Не наблюдается разницы между различием в интенсивности сестринского Hhf1-GFP и случайным спариванием ядер в этих двух субпопуляциях (15 сестринских пар; по сравнению с 1N [красная линия], D = 0.26, p = 0,26; по сравнению с 2N [синяя линия], D = 0,19, p = 0,65).

Популяции ядер полиплоидны с ограниченной анеуплоидией

Точная сегрегация хромосом в Ashbya предполагает, что многие ядра могут быть полиплоидными, а не анеуплоидными. К сожалению, из-за ограниченного выбора маркеров, доступных в Ashbya , мы не можем использовать вместе два разных меченных репортера хромосом, такие как lacO и tetO. Поэтому, чтобы оценить частоту анеуплоидии и полиплоидии, мы создали штамм с хромосомами I и VI, отмеченными lacO-повторами в одних и тех же ядрах ().Если ядра полиплоидные, ядра должны иметь пятна LacI, кратные двум, например двум, четырем или восьми. Однако, если ядра анеуплоидны, то с некоторой частотой должны наблюдаться нечетные числа, поскольку случайно хромосома I или VI окажется в избытке или отсутствует (). При оценке в очень молодых клетках большинство ядер в штамме с двумя маркированными хромосомами содержат два пятна LacI, что согласуется с идеей, что ядра гаплоидны в молодом возрасте (<40 ядер). По мере роста клеток (≥40 ядер) распределение сдвигается к модальному количеству четырех точек, что указывает на две копии каждой хромосомы (, N = 118 [≥40 ядер], N = 253 [<40 ядер] ).Одновременно со старением наблюдается увеличение количества ядер с нечетным числом хромосом, что отражает умеренный уровень (~ 25%) анеуплоидии. Эти данные согласуются с наблюдаемой достоверной сегрегацией хромосом при митозе в молодых клетках (и дополнительных фильмов S1 и S2) и подтверждают идею о том, что ядра внутри синцития могут существовать с хромосомными анеуплоидиями, но преимущественно полиплоидны. Мы предполагаем, что по мере увеличения объема цитозоля с возрастом низкий уровень анеуплоидии становится допустимым.Таким образом, ядра различаются по плоидности в одной и той же клетке, но большая часть изменений, вероятно, связана с амплификацией целых геномов, а не отдельных хромосом.

Ядра Ashbya преимущественно полиплоидные. (A) Схема хромосом Ashbya . Все семь хромосом и митохондриальная ДНК показаны в масштабе. Красные овалы указывают на центромеры, а зеленые полосы указывают на расположение интеграции 32lacO :: Gen3 на хромосомах I и VI. (B) Схема результатов ChI 32lacO :: Gen3 / ChVI 32-lacO :: Nat1.Ядра с двумя, четырьмя или восемью разрешаемыми пятнами LacI являются полиплоидными. Все остальные точечные подсчеты LacI будут свидетельством анеуплоидии. (C) Количественная оценка количества хромосом в ядрах ChI 32-lacO :: Gen3 / ChVI 32-lacO :: Nat1 Ashbya . Черные столбцы представляют собой распределение для молодых клеток (<40 ядер, N = 118), а серые столбцы представляют распределение для более старых клеток (> 40 ядер, N = 253).

Белок контрольной точки веретена Mad2 необходим для нормального роста

Учитывая, что частота анеуплоидии низкая в молодых клетках, мы предположили, что SAC имеет решающее значение для сдерживания анеуплоидии.Затем активность контрольной точки может снижаться по мере старения клеток, когда появляются анеуплоидные ядра. Мы генерировали мутанты, лишенные Mad2 — части консервативного механизма контрольной точки сборки веретена — и обнаружили, что mad2 Δ клетки растут медленно и имеют сильно нерегулярные границы, что отражает неравномерный рост по множеству гиф (). Такие переменные края роста можно ожидать, если имеет место стохастическая потеря стабильности генома и, следовательно, локальная гибель или старение клеток в определенных ветвях, что приводит к их неспособности расти, в то время как другие поддерживают рост.Этот наблюдаемый фенотип роста считается «гаплонедостаточным», поскольку они являются гетерокарионами и все еще существует Mad2 дикого типа, экспрессируемый из субнабора нетрансформированных ядер. Следовательно, в областях, где имеется много трансформированных ядер mad2 Δ, предположительно рост не может происходить, тогда как те ветви с достаточным количеством ядер, экспрессирующих Mad2, продолжают расти. Альтернативно, общая доза Mad2 недостаточна для каждого ядра, чтобы запустить контрольную точку, когда это необходимо, или ядра, находящиеся в одной и той же клетке, обычно не имеют общих компонентов контрольной точки.Мы предполагаем, что потеря Mad2 в ветвях вызывает более высокие уровни анеуплоидии, чем это допустимо, и локализованную остановку роста. Гетерокарионные клетки, лишенные Mad2, также не способны продуцировать бесполые споры, что делает невозможным создание гомокарионных нулевых мутантов. Это требование для контрольной точки веретена предполагает, что анеуплоидия в молодых клетках плохо переносится и, вероятно, контролируется SAC. Это также предполагает, что хромосомный дисбаланс не компенсируется даже при наличии нескольких соседних ядер, способных поставлять отсутствующие или несбалансированные генные продукты.SAC, вероятно, активен и необходим даже в невозмущенных условиях, что указывает на то, что обычно могут быть высокие уровни ошибок в прикреплении хромосом, возможно, из-за присутствия дополнительных хромосом в полиплоидных ядрах и недостаточного количества микротрубочек веретена.

mad2 Δ-клетки снизили жизнеспособность в Ashbya . Рост колоний штаммов гетерокарионов дикого типа (-ade2) и mad2 Δ :: NAT1. Барс, SD; три пластины / штамм. Изображения представляют рост колонии через 5 дней.

Стресс способствует перераспределению ядер в гаплоидное состояние

В предыдущих исследованиях было обнаружено или постулировано, что вариация плоидности — в первую очередь анеуплоидия — может быть адаптивной в стрессовых или колеблющихся условиях. Фактически, экспериментальные эволюционные эксперименты показывают, что анеуплоидия может быть одним из самых быстрых способов адаптации дрожжевых клеток к меняющимся условиям (Yona et al. , 2012). Если это так, мы прогнозируем, что растущие клетки в условиях стресса могут способствовать еще более резким различиям в плоидности и потенциально увеличивать уровень хромосомных вариаций между ядрами.Мы подвергли штаммов Ashbya с lacO-маркированной хромосомой I группе стрессовых условий, включая стресс клеточной стенки (2 мМ кофеин), осмотический стресс (200 мМ NaCl), избыток цинка (10 мМ ZnSO ₄ ), Ингибитор синтеза эргостерола и клинический противогрибковый флуконазол (325 нМ) и температура (37 ° C). Примечательно, что во всех стрессовых условиях, за исключением кофеина, статус плоидности значительно сдвигался в эуплоидное состояние, а не в более полиплоидное состояние, так что большинство ядер теперь содержали единственное обнаруживаемое пятно LacI-GFP (; Z test, p <0.05; > 85 ядер в каждом состоянии). Это подтверждает идею о том, что клетки Ashbya могут изменять плоидность в ответ на внешние сигналы, но, что примечательно, стресс приводит клетки к более эуплоидному состоянию, а не к более изменчивой плоидности.

Изменение числа хромосом уменьшается в ответ на различные клеточные стрессы. Количественная оценка хромосомы I составляет ядер Ashbya при нормальном росте и при наличии различных клеточных стрессов (> 85 ядер / состояние).

ОБСУЖДЕНИЕ

Было показано, что вариации плоидности полезны или вредны в зависимости от биологического контекста.Например, анеуплоидия является общим признаком солидных опухолей и связана с инфекцией и лекарственной устойчивостью грибковых патогенов человека, однако при искусственном превращении в клетки анеуплоидия может быть недостатком пригодности. Хотя многие анеуплоидии возникают из клеток, которые проходят многоядерную стадию, функциональные последствия наличия различных плоидностей в одном цитозоле не исследовались. Учитывая, что в многоядерных клетках существует возможность смешивания и совместного использования продуктов генов между ядрами с разными генотипами, неясно, будет ли анеуплоидия вредной, полезной или нейтральной.Здесь мы проанализировали естественную изменчивость плоидности у многоядерного гриба Ashbya , у которого ядра проходят цикл деления асинхронно (Gladfelter et al. , 2006; Nair et al. , 2010). Таким образом, целью этой работы было как понять, как плоидность может меняться в синцитиях, так и посмотреть, может ли плоидность быть источником различий между ядрами. Недавняя работа показала, что анеуплоидия задерживает прогрессирование клеточного цикла (Thorburn et al. , 2013), и мы предположили, что вариации плоидности могут допускаться в общей цитоплазме и быть источником вариаций времени деления между ядрами.

Мы наблюдали в Ashbya , что ядра имеют различное количество хромосом, от одной до более чем четырех копий индивидуально помеченных хромосом. Ядра способны точно разделять хромосомы и, по-видимому, часто бывают полиплоидными и реже анеуплоидными. Удаление MAD2 является вредным, предполагая, что функциональная контрольная точка сборки веретена необходима для нормального роста у Ashbya . Следует отметить, что рост в условиях стресса приводит к снижению плоидности до почти эуплоидной, что свидетельствует о том, что вариабельность количества хромосом не сохраняется при стрессе.Таким образом, полиплоидия и до некоторой степени анеуплоидия допустимы у Ashbya в оптимальных условиях роста. Электронно-томографический анализ небольшого количества ядер в молодых клетках Ashbya показал, что митотическое веретено содержит такое же количество микротрубочек кинетохор, как у почкующихся дрожжей, и все же гаплоид A. gossypii имеет менее половины числа хромосом (семь хромосом в Ashbya по сравнению с 16 в S. cerevisiae ; Gibeaux et al., 2012). Следовательно, вероятно, что в диплоидных ядрах образуется достаточное количество микротрубочек кинетохор для правильного прикрепления хромосом при митозе, но, поскольку плоидности увеличиваются с возрастом клетки, микротрубочки кинетохор становятся ограничивающими и / или неправильные прикрепления более обычны.

Помимо полиплоидии, существует также степень анеуплоидии среди ядер Ashbya , что предполагает некоторый уровень потери хромосом. У патогенного гриба C. albicans парасексуальные циклы приводят к тетраплоидным ядрам, которые претерпевают согласованную потерю хромосом, приближаясь к диплоидии (Hull et al., 2000; Беннетт, 2003; Forche et al. , 2008 г.). Потеря хромосом после полиплоидизации также наблюдалась у S. cerevisiae , у которых частота потери возрастала с увеличением плоидности (Mayer and Aguilera, 1990; Gerstein et al. , 2006, 2008). Сходным образом, в ректальных клетках Drosophila полиплоидные клетки продуцируют высокие уровни анеуплоидии (Schoenfelder et al. , 2014). Возможно, что преимущественно полиплоидные ядра нечасто подвергаются хромосомной потере, что приводит к низким уровням анеуплоидии, которые мы наблюдаем у Ashbya .В соответствии с этой гипотезой мы видим повышенный уровень анеуплоидии в более старых клетках, предполагая, что повышенная вариабельность плоидности в более зрелых клетках может приводить к увеличению потери хромосом.

Хотя наблюдаются ограниченные анеуплоидии, они, вероятно, плохо переносятся у Ashbya. Делеция MAD2 приводит к снижению роста колоний и дает фенотипы даже тогда, когда некоторые ядра экспрессируют Mad2. Это указывает как на то, что анеуплоидия, вероятно, не переносится, так и на то, что контрольные точки могут быть внутренними по действию ядра, что было замечено в контексте двуядерных дрожжевых и сумчатых клеток (Rieder et al., 1997; Demeter et al. , 2000). Почему анеуплоидия недопустима, если генные продукты теоретически могут быть разделены между ядрами синцития? Фактически, цитозоль может быть не таким функционально однородным, как можно было бы ожидать. Эти результаты согласуются с недавней работой Ashbya , показывающей, что ядра могут создавать функциональные компартменты, а соседние ядра не полностью перемешивают окружающий их цитозоль. Эти ядерные территории требуют цитоплазматических микротрубочек и функциональных белковых агрегатов, которые локализуют мРНК (Anderson et al., 2013; Ли и др. , 2013). Регионализация цитозоля вокруг отдельных ядер может снизить любую гипотетическую буферную способность синцития. В контексте, в котором цитозоль регионализирован, а не гомогенизирован, ядра с полиплоидными дополнениями хромосом создают функциональные территории. Анеуплоидные ядра могут не быть функционально дополнены соседними ядрами и, следовательно, могут не поддерживаться.

Существование функционально различных областей цитозоля с ограниченным обменом может помочь объяснить, почему внешний клеточный стресс снижает вариабельность плоидности.Хорошо известно, что для белков, которые для функционирования образуют более крупные комплексы (например, гетеродимеры тубулина), дисбаланс в экспрессии одного из компонентов является пагубным (Weinstein and Solomon, 1990). Кроме того, было показано, что избыточные белки, возникающие в результате амплификации хромосом, создают протеотоксическую нагрузку на клетки, поскольку они расщепляют избыточные белки для достижения оптимальной стехиометрии в белковых комплексах (Oromendia et al. , 2012). В Ashbya , в котором гаплоидное, диплоидное и тетраплоидное ядра могут быть соседями, существует возможность некоторых локальных дисбалансов в уровнях белков в комплексах на границах между ядерными территориями, и это может представлять собой некоторый низкий базовый уровень протеотоксичности. стресс.Этот стресс можно перевесить в нормальных условиях, если некоторые ядра обладают повышенной биосинтетической способностью за счет размещения большего количества ДНК. При стрессе, возможно, бремя протеотоксического стресса слишком велико, и гаплоидные ядра вступают во владение, что видно в большинстве проанализированных стрессовых состояний. Интересно, что кофеин не приводил к снижению плоидности, возможно, из-за другой реакции на это конкретное состояние или из-за того, что уровень стресса был недостаточным для генерации протеотоксического штамма. В любом случае, эта работа раскрывает другой пример, в котором плоидность изменяется при стрессе, и показывает, что количество ядер в клетке может быть важным фактором в том, как состояние плоидности может измениться при стрессе.Это важно в свете наблюдения за многоядерными клетками в опухолях.

Как устанавливаются различия плоидности в Ashbya ? При съемке отдельных ядер с маркированными хромосомами, которые не выявили неправильной сегрегации, к сожалению, не было никаких намеков на то, как ядра становятся полиплоидными. Мы не нашли доказательств ядерного слияния, неудачных анафаз или четкой эндоредупликации, но мы прогнозируем, что должна быть некоторая частота этих событий, которые потенциально подавляются во время визуализации живых клеток и ускользают от нашего обнаружения.Хотя прямой механизм установления изменчивости плоидности остается неуловимым, поразительный сдвиг, который мы наблюдали от явно гаплоидного состояния в очень молодых клетках к полиплоидному состоянию с возрастом, предполагает, что ростки возникают из гаплоидных спор. Это также подтверждается широким применением обратной генетики в системе, в которой штаммы, заменяющие чистые гены, обычно могут быть получены из отдельных спор гетерокарионного трансформанта (Wendland et al. , 2000).

Как гаплоидные споры возникают из зрелого полиплоидного / анеуплоидного мицелия? Клетки Ashbya образуют бесполые споры только после того, как колонии созреют в течение нескольких дней на чашке с агаром.Специфические механизмы образования спор у Ashbya плохо изучены, и неизвестно, присутствует ли мейотический компонент в споруляции. Существует много консервативных компонентов мейоза, и было высказано предположение, что ядра сливаются, а затем подвергаются мейотическим редукциям с образованием спор (Wasserstrom et al. , 2013). Однако отсутствие механических доказательств мейотического сокращения предполагает, что все споры, исследованные в лаборатории, бесполые. Создание гаплоидных спор из ядер с переменной плоидностью зрелого мицелия означает вероятное снижение плоидности и коррекцию низких уровней анеуплоидии во время образования спор.В качестве альтернативы, популяция образовавшихся бесполых спор может иметь переменную плоидность и быть стратегией ограничения ставок для прорастания в различных средах, что может быть особенно полезным источником генетического разнообразия в популяции, воспроизводящейся бесполым путем. Мы видели, что прорастает только половина спор Ashbya дикого типа ( N > 200; неопубликованные данные). Такая низкая частота прорастания предполагает, что вполне вероятно, что образуются споры многих плоидий, но только гаплоиды способны прорастать в лабораторных условиях.Кроме того, споры из штаммов mad2 Δ демонстрируют еще более низкую скорость прорастания — 33%, что позволяет предположить, что изменение SAC и предположительно увеличение вариабельности плоидности дополнительно снижает жизнеспособность спор в лабораторных условиях. У S. cerevisiae > 90% спор прорастают и остаются жизнеспособными (Klapholz et al. , 1985; Diaz et al. , 2002). Однако многие грибы, которые при определенных условиях оказались анеуплоидными, в том числе некоторые штаммы S.cerevisiae , Neurospora crassa , Sordaria macrospora и базидиомицеты C. neoformans и Coprinus cinereus, снизили жизнеспособность спор (Klapholz et al. , 1985; Диаз и др. , 2002; Сторлацци и др. , 2003; Боуринг и др. , 2006). Возможно, что различия в количестве копий генома, даже если они сбалансированы, как в случае полиплоидии, более вредны для спор с одним ядром, тогда как вариация плоидности более терпима в зрелых клетках.

Высокая степень изменчивости плоидности у Ashbya поразительна и может быть механизмом, с помощью которого ядра циклически асинхронно проходят через клеточный цикл. Связь между плоидностью, компартментализацией цитоплазмы и адаптивной приспособленностью увлекательна, и дальнейшие исследования идеально свяжут эти черты с вариациями времени клеточного цикла в общей цитоплазме.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия роста и конструирование штамма

Среда A. gossypii , условия культивирования и трансформации были выполнены, как описано ранее (Ayad-Durieux et al., 2000; Wendland et al. , 2000). Штаммы в этом исследовании описаны в дополнительной таблице S1, используемые плазмиды перечислены в дополнительной таблице S2, а используемые олигонуклеотидные праймеры перечислены в дополнительной таблице S3. Все рестрикционные ферменты были от New England BioLabs, Ipswich, MA, и все олигонуклеотиды были от Integrated DNA Technologies, Coralville, IA.

Конструкция плазмиды lacO

Для создания плазмид AGB245 / 246, pAKh47 и AGB21 расщепляли Kpn I и Nde I (NEB).Полосу ~ 1600 пар оснований (pAKh47) и полосу 4214 пар оснований (AGB21) экстрагировали из геля и лигировали с использованием T4-лигазы (NEB). Полученные плазмиды проверяли путем переваривания с помощью Kpn I и Nde I и секвенирования. Для создания плазмид AGB264 / 265, AGB246 и pRS416 расщепляли Nde I и Sbf I. Полосу из 3343 пар оснований из AGB246 экстрагировали из геля и лигировали с расщепленной pRS416 с использованием Т4-лигазы (NEB). Полученные плазмиды проверяли с помощью расщепления Sac I и секвенирования с помощью AGO37.

Хромосома I 32-lacO :: Gen3

Гомология хромосомы I была сконструирована с использованием ремонта разрывов. Приблизительно 250 пар оснований 5′-гомологии с хромосомой I были амплифицированы из геномной ДНК ΔlΔt с использованием AGO638 / 639. AGB264 / 265 переваривали с помощью Stu I и котрансформировали в дрожжи с гомологией 5′-хромосомы I с образованием AGB266 / 267, что было подтверждено перевариванием Bgl I и секвенированием с AGO640. Приблизительно 250 пар оснований 3′-гомологии с хромосомой I амплифицировали из геномной ДНК ΔlΔt с использованием AGO641 / 642.AGB266 / 267 были расщеплены Nde I и котрансформированы в дрожжи с гомологией 3′-хромосомы I с образованием AGB268 / 269, что было подтверждено расщеплением с Spe I / Stu I и секвенированием с AGO640 и AGO678. Фрагмент из 4260 пар оснований очищали в геле от AGB268 / 269 после расщепления с помощью Spe I / Stu I и трансформировали в AG302 с образованием AG459.1-4. Первичные трансформанты собирали на планшеты с G418 (200 мкг / мл) и собирали отдельные споры для генерации гомокариона AG460.Штаммы были проверены с использованием олигопар AGO721 / AGO761, AGO723 / AGO759 и AGO721 / AGO723.

Хромосома VI 32-lacO :: Gen3

Приблизительно 200 пар оснований 5′-гомологии с хромосомой VI амплифицировали из геномной ДНК ΔlΔt с использованием AGO753 / 754. AGB264 / 265 расщепляли Stu I и котрансформировали в дрожжи с гомологией 5′-хромосомы VI с образованием AGB309 / 310, что подтверждали расщеплением Xho I и секвенированием с AGO640. Приблизительно 250 пар оснований 3′-гомологии с хромосомой VI амплифицировали из геномной ДНК ΔlΔt с использованием AGO765 / 766.AGB309 / 310 расщепляли Nde I и котрансформировали в дрожжи с гомологией 3′-хромосомы I с образованием AGB322 / 323, что подтверждали расщеплением с помощью Xnm I / Xho I и секвенированием с помощью AGO678. AGB322 / 323 расщепляли с использованием Spe I / Stu I и трансформировали в AG302 с образованием AG479.1-3. Первичные трансформанты собирали на планшеты с G418 (200 мкг / мл) и собирали отдельные споры для генерации гомокариона AG480. Штаммы были проверены с использованием олигопар AGO757 / AGO758, AGO98 / AGO760 и AGO757 / AGO760.

Хромосома I 32-lacO :: Gen3 / хромосома VI 32-lacO :: Nat1

Чтобы получить штамм AG514 / 515, AGB268 / 269 расщепляли с использованием Spe I / Stu I и трансформировали в AKh36.2. Первичные трансформанты собирали на планшеты с G418 (200 мкг / мл) и собирали отдельные споры для генерации гомокариона AG517 / 518. Штаммы были проверены с использованием олигопар AGO721 / AGO761, AGO723 / AGO759 и AGO721 / AGO723. Для создания плазмиды Nat1, гомологичной хромосоме VI, фрагмент из 1817 пар оснований экстрагировали в гель из AGB09, расщепленного с помощью Sap I и Nde I.Используя эту полосу, Nat1 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием AGO1050 / 968 и котрансформировали с помощью AGB322 / 323 для получения плазмиды AGB403.1 / 403.2. Плазмиды были проверены с использованием расщепления Kpn I и секвенирования с помощью AGO234 / 235. AGB403.1 трансформировали в AG517 для получения штамма AG720. Штаммы были проверены с использованием олигопар AGO757 / AGO758, AGO760 / AGO234 и AGO757 / AGO760.

mad2Δ :: Nat1

Для создания штамма AG600 / 601 AGB9 разрезали с помощью Pvu II-HiFi. NAT1 амплифицировали из этой разрезанной плазмиды с использованием AGO1101 / AGO1102.Продукты ПЦР были объединены и непосредственно интегрированы в Ashbya . Первичные трансформанты собирали на планшеты CloNat (Werner Bioagents, Jena, Germany). Штаммы были проверены с использованием олигопар AGO1103 / AGO235, AGO234 / AGO1104 и AGO1103 / AGO1105.

Установка микроскопа и условия получения изображений

Использовался прямой световой микроскоп Zeiss Axioimage-M1 (Carl Zeiss, Йена, Германия), оснащенный масляным объективом с числовой апертурой Plan-Apochromat 63 × / 1,4. Для визуализации сигналов флуоресценции использовалась лампа Exfo X-Cite 120 в сочетании с Zeiss 38HE (GFP), Chroma 41002B (TAMRA), Zeiss 49 (Hoechst / DAPI) и Chroma 41043 (mCherry; Chroma Technology, Brattleboro, VT. ).Изображения получали на камеру Orca-AG с зарядовой связью (CCD) (C4742-80-12AG; Hamamatsu, Bridgewater, NJ), управляемую Volocity (Perkin-Elmer, Waltham, MA).

Для изображения пятен хромосомы LacI клетки выращивали в течение 16 ч и отображали на тонких гелевых подушечках, содержащих 2% агарозы и 100% минимальную среду с низкой флуоресценцией 2 ×. Z -стопки были получены с 0,5 мкм срезами, охватывающими гифы. Изображения экспонировались в течение 50–100 мс при 100% пропускании. Все изображения были обработаны методом итеративной деконволюции (100 итераций) с использованием вычисленных функций разброса точек в Volocity, а ядра визуально оценивались по количеству хромосом, меченных LacI-GFP.

Для визуализации сегрегации хромосом клетки отображали на микроскопе OMX, оборудованном ПЗС-матрицей Hamamatsu с электронным умножением. Для освещения GFP использовался твердотельный лазер с длиной волны 488 нм, мощность лазера составляла 1,08%. Клетки визуализировали каждую минуту через глубину 10 мкм z (21 срез по 0,5 мкм).

Количественная оценка интенсивности Hhf1-GFP

Покадровая съемка и предыдущее ядерное отслеживание использовались для количественной оценки интенсивности Hhf1-GFP с течением времени (Anderson et al. , 2013).Покадровые изображения и ядерные координаты были импортированы в MATLAB, а ядра вокруг центральных координат были найдены с использованием пороговой обработки. Поправка на фотообесцвечивание применялась к отдельным ядрам с течением времени. Интенсивность гистонов измеряли как суммарную интенсивность GFP для каждого ядра. Изменения складок для каждого ядра рассчитывали с использованием максимального и минимального сигнала Hhf1-GFP на протяжении всего трекинга. Продолжительность S-фазы представляла собой время между максимальной и минимальной интенсивностью GFP.

Оценка тела полюса веретена

Стадии клеточного цикла определяли с использованием SPB, как описано ранее (Nair et al., 2010 г.). Вкратце, ядра с одним SPB были отнесены к G1, ядра с одним SPB, который был вдвое больше интенсивности и размера, чем SPB G1, или с двумя соседними SPB, расположенными на расстоянии <0,5 мкм друг от друга, были отнесены к S / G2, а ядра с два SPB, которые находились на расстоянии> 0,5 мкм друг от друга на противоположных сторонах ядра, были отнесены к M.

FISH

Протокол FISH с одной молекулой РНК был использован для визуализации хромосомы, экспрессирующей ген CLN1 / 2 (Lee et al. , 2013).Этот транскрипт экспрессируется в> 90% ядер, и место экспрессии гена легко определяется как пятна, которые обычно ярче, чем интенсивность отдельных зрелых транскриптов в цитозоле. Поскольку все попытки ДНК-FISH были безуспешными, а протокол ДНК-FISH никогда не был установлен для Ashbya , мы использовали РНК-FISH транскрипции в качестве заместителя для числа хромосом. Клетки выращивали в течение 12–16 ч при 30 ° C при встряхивании и фиксировали в 3,7% -ном формальдегиде в течение 1 ч. Клетки промывали буфером B (1.2 M сорбит, 0,1 M фосфат калия, pH 7,5), сферопластировали с использованием зимолиазы (15 мкг / мл) и инкубировали при 37 ° C до темноты. Клетки дважды промывали промывочным буфером и смешивали с гибридизационным раствором (100 мкл гибридизационного буфера, 1,5 мкл зонда). Клетки инкубировали при 92 ° C в течение 3 минут, а затем в течение ночи при 37 ° C. Клетки дважды промывали промывочным буфером и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в 500 мкл промывочного буфера плюс 1 мкл Hoechst. Клетки еще дважды промывали, помещали в монтажную среду Prolong Gold (Life Technologies) и отображали.

Анализы прорастания и роста колоний

Для анализа прорастания споры помещали на планшеты Ashbya Full Media (AFM) с соответствующим отбором и позволяли прорастать при 30 ° C в течение 8 часов. Планшеты были визуализированы и оценены в ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд) на предмет прорастания спор. Для анализа роста колоний 10 мкл спор помещали в центр планшетов AFM с соответствующим отбором. Колонии росли при 30 ° C, и планшеты визуализировали ежедневно в течение 10 дней, используя молекулярный имидж-сканер Bio-Rad ChemiDoc XR5 с программным обеспечением ImageLab.Площадь и периметр колонии измеряли с помощью макроса, написанного в ImageJ, который «автоматически определял пороговые значения» изображений и определял площадь и периметр колонии.

Клеточные стресс-тесты

Споры A. gossypii проращивали в жидкой АСМ в присутствии ампициллина (100 мкг / мл), G418 (200 мкг / мл) и клоната (50 мкг / мл) в течение 10 часов, в то время как встряхивание в колбах с перегородками при 30 ° C. Клетки переносили в свежую среду с селекцией, содержащую 2 мМ кофеина (Sigma-Aldrich), 200 мМ NaCl (Fisher Scientific), 10 мМ ZnSO ₄ (Sigma-Aldrich) или 325 нМ флуконазол (Sigma-Aldrich), и возвращали в 30 ° C при встряхивании в течение дополнительных 6 часов.Подходящую концентрацию флуконазола определяли путем сравнения радиальных скоростей роста на планшетах для АСМ с ампициллином (100 мкг / мл) и 1,5% агарозой с добавлением флуконазола в различных концентрациях (Sigma-Aldrich). Контрольные и подвергнутые тепловому стрессу клетки также переносили в свежую среду через 10 часов и возвращали к 30 или 37 ° C соответственно на дополнительные 6 часов. Клетки центрифугировали при 300 об / мин в течение 5 мин, промывали 5 мл 2 × минимальной среды с низкой флуоресценцией и центрифугировали, как прежде. 10 мкл клеток брали непосредственно из осадка и наносили на предметные стекла для визуализации.

Статистический анализ популяций клеточного стресса

Все попарные сравнения были выполнены между нестрессированными клетками и каждым стрессовым состоянием (0 хромосом [контроль] против 0 хромосом [экспериментальные], 1 хромосома [контроль] против 1 хромосомы [экспериментальные],… 5 хромосом [контроль] против 5 хромосом [экспериментальный]). p ₁ = доля ядер с данным количеством копий хромосомы (контроль) и p ₂ = доля ядер с таким же количеством копий хромосомы (экспериментальная), и n ₁ и n ₂ = количество подсчитанных ядер (контрольное и экспериментальное соответственно).Двухвыборочный тест на пропорции Z применялся к каждой популяции по сравнению с контрольной популяцией. Для p <0,05 значение Z должно быть> 1,96 или <-1,96. Штаммы считались значительно отличающимися от контроля, если две или более категории составляли p <0,05.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Дженнифер Фанг за использование микроскопа OMX в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и лабораторию Гладфельтера за полезное обсуждение.Мы благодарны MicroVideo Instruments и Nikon за поддержку наших инструментов в Морской биологической лаборатории в Вудс-Хоул, Массачусетс. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01-GM081506 (A.S.G.), стипендиями Леманна и Колвина (A.S.G.) Морской биологической лаборатории в Вудс-Хоул и премией Национальных институтов здравоохранения T32GM008704 (C.A.A.).

Используемое сокращение:

ССЫЛКИ

• Альбертин В., Марулло П. Полиплоидия грибов: эволюция после дупликации всего генома. Proc Biol Sci. 2012; 279: 2497–2509. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Андерсон CA, Eser U, Korndorf T, Borsuk ME, Skotheim JM, Gladfelter AS. Ядерное отталкивание обеспечивает автономность деления в единой цитоплазме. Curr Biol. 2013; 23: 1999–2010. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ayad-Durieux Y, Knechtle P, Goff S, Dietrich FS, Philippsen P.PAK-подобная протеинкиназа необходима для созревания молодых гиф и перегородки у нитчатого аскомицета Ashbya gossypii. J Cell Sci. 2000; 113 (Pt 24): 4563–4575. [PubMed] [Google Scholar]
• Бахум С.Ф., Комптон Д.А. Хромосомная нестабильность и рак: сложная взаимосвязь с терапевтическим потенциалом. J Clin Invest. 2012; 122: 1138–1143. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bennett RJ. Завершение парасексуального цикла у Candida albicans за счет индуцированной потери хромосом у тетраплоидных штаммов.EMBO J. 2003; 22: 2505–2515. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Беннетт Р.Дж., Форче А., Берман Дж. Быстрые механизмы создания разнообразия генома: сдвиги полной плоидности, анеуплоидия и потеря гетерозиготности. Колд Спринг Харб Перспект Мед 4, a019604. 2014 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bowring FJ, Yeadon PJ, Stainer RG, Catcheside DEA. Спаривание хромосом и мейотическая рекомбинация у мутантов Neurospora crassa spo11. Curr Genet. 2006. 50: 115–123. [PubMed] [Google Scholar]
• Бердс А.А., Лутум А.С., Соргер П.К.Создание хромосомной нестабильности за счет одновременной делеции Mad2 и p53. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 11296–11301. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Celerin M, Merino ST, Stone JE, Menzie AM, Zolan ME. Множественные роли Spo11 в поведении мейотических хромосом. EMBO J. 2000; 19: 2739–2750. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Деметер Дж., Ли С.Э., Хабер Дж. Э., Стернс Т. Сигнал контрольной точки повреждения ДНК у почкующихся дрожжей ограничен ядерно. Mol Cell.2000. 6: 487–492. [PubMed] [Google Scholar]
• Диаз Р.Л., Алсид А.Д., Бергер Дж. М., Кини С. Идентификация остатков дрожжевого Spo11p, критических для образования двухцепочечных разрывов мейотической ДНК. Mol Cell Biol. 2002; 22: 1106–1115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Дитрих Ф.С., Фогели С., Брахат С., Лерх А., Гейтс К., Штайнер С., Мор С., Пельманн Р., Луеди П., Чой С. и др. Геном Ashbya gossypii как инструмент для картирования древнего генома Saccharomyces cerevisiae. Наука. 2004. 304: 304–307.[PubMed] [Google Scholar]
• Дункан А.В., Тейлор М.Х., Хики Р.Д., Ньюэлл А.Е., Лензи М.Л., Олсон С.Б., Файнголд М.Дж., Громпе М. Конвейер плоидности зрелых гепатоцитов как источник генетической изменчивости. Природа. 2010; 467: 707–710. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Forche A, Alby K, Schaefer D, Johnson AD, Berman J, Bennett RJ. Парасексуальный цикл Candida albicans обеспечивает альтернативный мейоз путь образования рекомбинантных штаммов. PLoS Biol. 2008; 6: e110.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gerstein AC, Chun H-JE, Grant A, Otto SP. Геномная конвергенция к диплоидии у Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 2006; 2: e145. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gerstein AC, McBride RM, Otto SP. Снижение плоидности у Saccharomyces cerevisiae. Biol Lett. 2008; 4: 91–94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gibeaux R, Lang C, Politi AZ, Jaspersen SL, Philippsen P, Antony C. Электронная томография цитоскелета микротрубочек в многоядерных гифах Ashbya gossypii.J Cell Sci. 2012; 125: 5830–5839. [PubMed] [Google Scholar]
• Гладфельтер А.С., Хунгербюлер А.К., Филиппсен П. Циклы асинхронных ядерных делений в многоядерных клетках. J Cell Biol. 2006; 172: 347–362. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harrison BD, Hashemi J, Bibi M, Pulver R, Bavli D, Nahmias Y, Wellington M, Sapiro G, Berman J. Тетраплоидный промежуточный продукт предшествует образованию анеуплоида в дрожжах, подвергшихся воздействию к флуконазолу. PLoS Biol. 2014; 12: e1001815. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hull CM, Raisner RM, Johnson AD.Доказательства скрещивания «бесполых» дрожжей Candida albicans с млекопитающим-хозяином. Наука. 2000. 289: 307–310. [PubMed] [Google Scholar]
• Иднурм А. Тетрадный анализ гриба базидиомицетов Cryptococcus neoformans. Генетика. 2010; 185: 153–163. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Клапхольц С., Уодделл С.С., Эспозито РЭ. Роль гена SPO11 в мейотической рекомбинации у дрожжей. Генетика. 1985; 110: 187–216. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Krajcovic M, Johnson NB, Sun Q, Normand G, Hoover N, Yao E, Richardson AL, King RW, Cibas ES, Schnitt SJ, et al.Негенетический путь к анеуплоидии рака человека. Nat Cell Biol. 2011; 13: 324–330. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lee C, Zhang H, Baker AE, Occhipinti P, Borsuk ME, Gladfelter AS. Поведение агрегации белка регулирует локализацию транскрипта циклина и контроль клеточного цикла. Dev Cell. 2013; 25: 572–584. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Li M, Fang X, Baker DJ, Guo L, Gao X, Wei Z, Han S, van Deursen JM, Zhang P. Путь ATM-p53 подавляет анеуплоидию- индуцированный туморогенез.Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 14188–14193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лу Х, Канг Й. Слияние клеток как скрытая сила в развитии опухоли. Cancer Res. 2009; 69: 8536–8539. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Mayer VW, Aguilera A. Высокие уровни хромосомной нестабильности в полиплоидах Saccharomyces cerevisiae. Mutat Res. 1990; 231: 177–186. [PubMed] [Google Scholar]
• Morrow CA, Fraser JA. Вариация плоидности как приспособительный механизм патогенных грибов человека.Semin Cell Dev Biol. 2013; 24: 339–346. [PubMed] [Google Scholar]
• Nair DR, D’Ausilio CA, Occhipinti P, Borsuk ME, Gladfelter AS. Консервативная регуляторная цепь G₁ способствует асинхронному поведению ядер, разделяющих общую цитоплазму. Клеточный цикл. 2010; 9: 3771–3779. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Oromendia AB, Dodgson SE, Amon A. Анеуплоидия вызывает протеотоксический стресс у дрожжей. Genes Dev. 2012; 26: 2696–2708. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Pavelka N, Rancati G, Zhu J, Bradford WD, Saraf A, Florens L, Sanderson BW, Hattem GL, Li R.Анеуплоидия вызывает количественные протеомные изменения и фенотипические вариации у почкующихся дрожжей. Природа. 2010; 468: 321–325. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Пирсон К.Г., Мэддокс П.С., Салмон Э.Д., Блум К. Структура и динамика хромосом почкующихся дрожжей во время митоза. J Cell Biol. 2001; 152: 1255–1266. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Querol A, Bond U. Сложные и динамические геномы промышленных дрожжей. FEMS Microbiol Lett. 2009; 293: 1–10. [PubMed] [Google Scholar]
• Ридер К.Л., Ходжаков А., Палиулис Л.В., Фортье TM, Коул Р.В., Слудер Г.Митоз в соматических клетках позвоночных с двумя веретенами: значение для контрольной точки перехода метафаза / анафаза и расщепления. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 5107–5112. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ропер М., Эллисон С., Тейлор Дж. У., Гласс Н.Л. Ядерная и геномная динамика многоядерных грибов-аскомицетов. Curr Biol. 2011; 21: R786 – R793. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шонфельдер К.П., Монтегю Р.А., Парамор С.В., Леннокс А.Л., Маховальд А.П., Фокс Д.Т. Незаменимые премитотические эндоциклы способствуют анеуплоидии прямой кишки дрозофилы.Разработка. 2014; 141: 3551–3560. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сельмеки А., Форче А., Берман Дж. Геномная пластичность грибкового патогена человека Candida albicans. Эукариотическая клетка. 2010; 9: 991–1008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Semighini CP, Averette AF, Perfect JR, Heitman J. Делеция Cryptococcus neoformans Ортолог AIF способствует анеуплоидии хромосом и устойчивости к флуконазолу независимым от метакаспаз образом. PLoS Pathog. 2011; 7: e1002364.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сторчова З., Бренеман А., Канде Дж., Данн Дж., Бербанк К., О’Тул Э., Пеллман Д. Геномный генетический анализ полиплоидии дрожжей. Природа. 2006; 443: 541–547. [PubMed] [Google Scholar]
• Сторлацци А., Тессе С., Гаргано С., Джеймс Ф., Клекнер Н., Циклер Д. Двухцепочечные разрывы мейоза на стыке движения хромосом, ремоделирования хромосом и редукционного деления. Genes Dev. 2003. 17: 2675–2687. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Straight AF, Marshall WF, Sedat JW, Murray AW.Митоз у живых почкующихся дрожжей: анафаза А, но без метафазной пластинки. Наука. 1997. 277: 574–578. [PubMed] [Google Scholar]
• Thompson SL, Compton DA. Пролиферация анеуплоидных клеток человека ограничивается p53-зависимым механизмом. J Cell Biol. 2010. 188: 369–381. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Thorburn RR, Gonzalez C, Brar GA, Christen S, Carlile TM, Ingolia NT, Sauer U, Weissman JS, Amon A. Штаммы анеуплоидных дрожжей проявляют дефекты роста клеток и переход через СТАРТ.Mol Biol Cell. 2013; 24: 1274–1289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Торрес Е.М., Сокольски Т., Такер С.М., Чан Л.Я., Бозелли М., Данхэм М.Дж., Амон А. Влияние анеуплоидии на физиологию клеток и деление клеток у гаплоидных дрожжей. Наука. 2007; 317: 916–924. [PubMed] [Google Scholar]
• Вассерстром Л., Ленгелер К. Б., Вальтер А., Вендланд Дж. Молекулярные детерминанты споруляции у Ashbya gossypii. Генетика. 2013; 195: 87–99. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Weaver BA, Cleveland DW.Вызывает ли анеуплоидия рак. Curr Opin Cell Biol. 2006. 18: 658–667. [PubMed] [Google Scholar]
• Вайнштейн Б., Соломон Ф. Фенотипические последствия перепроизводства тубулина у Saccharomyces cerevisiae: различия между альфа-тубулином и бета-тубулином. Mol Cell Biol. 1990; 10: 5295–5304. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wendland J, Ayad-Durieux Y, Knechtle P, Rebischung C, Philippsen P. Нацеливание на гены на основе ПЦР в мицелиальных грибах Ashbya gossypii. Ген. 2000; 242: 381–391.[PubMed] [Google Scholar]
• Yona AH, Manor YS, Herbst RH, Romano GH, Mitchell A, Kupiec M, Pilpel Y, Dahan O. Хромосомная дупликация — временное эволюционное решение стресса. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 21010–21015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhu J, Pavelka N, Bradford WD, Rancati G, Li R. Кариотипические детерминанты хромосомной нестабильности у анеуплоидных почкующихся дрожжей. PLoS Genet. 2012; 8: e1002719. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Космос, Санкт-Петербург бронирование и карта