Марина кортман: Центр стройности Марины Корпан — бодифлекс, оксисайз, стройная фигура, онлайн видеокурсы.

революционная система похудения от Марины Корпан, что такое оксиайз, отзывы, видео.

Какая проблема решается?
Тонус
Похудение

Для кого?

• Для новичков
• Для продвинутых
• Универсальная методика

Улучшает работу всех органов и систем организма, развивает гибкость, выносливость и помогает снизить аппетит.

Основа тренировки:
Без задержки дыхания (аэробное дыхание) с более силовыми упражнениями.

Противопоказания:

• Онкология
• Беременность
• Астма

Оксисайз – это революционная методика снижения веса, эффективность которой подтверждена научными исследованиями. Похудение основано на выполнении определенного комплекса дыхательных упражнений, с помощью которого кислород доставляется к проблемным местам. Кислород вступает в реакцию с жировыми отложениями, которые расщепляются на углекислый газ и воду. Положительные результаты не заставляют себя ждать: за короткое время живот, бока и бедра значительно уменьшаются в объемах. Оксисайз поможет вам не только похудеть, но и сформировать красивый мышечный рельеф.

Основоположником дыхательной гимнастики Оксисайз в России стала Марина Корпан. Если дыхательную гимнастику Бодифлекс в нашей стране кто-то и знал, то появлению Оксисайз мы полностью обязаны Марине Корпан. Произошло это 9 января 2009 года.

Основоположником в США является американка Джилл Джонсон. Марина Корпан предлагает занятия Оксисайзом не по американской версии, а по собственной методике, которую она разработала сама.

Как работает Оксисайз, объяснить не сложно. Во время занятий за счет особой техники дыхания и выполнения упражнений клетки тела получают повышенное количество кислорода. Его избыток включает режим окисления, то есть сжигания жиров, и ускоряет обмен веществ.

Особенности Оксисайза:

1. Был проведен ряд исследований уровня расхода калорий и потребления кислорода во время занятий. Дыхание Оксисайз, в сравнительной характеристике расходования калорий по отношению к традиционным видам физических нагрузок, показало ошеломляющие результаты – энергопотребление при выполнении дыхательной техники на 140% выше, чем энергопотребление при занятиях на велотренажере. 
2. Поскольку ткани лучше питаются кислородом, и вы даете телу щадящие физические нагрузки, за которые так ратуют медики, Оксисайз помогает не только похудеть. Он улучшает состояние организма в целом: активизирует кровообращение, налаживает работу органов пищеварительной и репродуктивной систем, тонизирует мышцы всего тела, развивает гибкость, помогает контролировать аппетит и противостоять стрессам. 
3. Основной принцип Оксисайза — диафрагмальное дыхание: оно полностью задействует легкие, брюшную полость и диафрагму. Ваша задача — дышать носом и животом. Чтобы техника дыхания и упражнения подействовали, нужно соблюдать определенные важнейшие правила. 

Марина Корпан — фото, биография, личная жизнь, новости, книги, упражнения 2021

Биография

Марина Корпан — популярный блогер и писательница, чьи книги расходятся многотысячными тиражами. Но бестселлеры, автором которых она выступает, — это не детективы или дамские романы, а сборники упражнений для похудения и оздоровления организма.

Детство и юность

Корпан неохотно делится ранними страницами биографии. Судя по тому, что в 2000 году девушка окончила московскую школу № 152 на 1-й Аэропортовской улице, детство Марины прошло в Москве. День рождения блогер празднует 20 июля.

Марина Корпан

В детстве и отрочестве Марина была «пышечкой». Похудеть не помогали ни аэробика, ни диеты. Втайне от родителей девочка в течение года почти ничего не ела. Это привело к плачевным результатам — Марина заболела и еще год восстанавливала здоровье.

Приобрести стройность (сейчас Корпан при росте 164 см весит 59 кг) девушка смогла, начав заниматься бодифлексом, разработанным американкой Грир Чайлдерс. Со временем Марина включила в занятия еще одну дыхательную гимнастику Oxycise, созданную Джиллой Джонсон. Всего Корпан похудела на 25 кг.

Читайте также7 звезд, которые в детстве страдали от лишнего веса

После окончания школы девушка поступила в Московский технический университет, готовящий профессионалов в радиотехнике и электронике. Но выучилась Марина не на инженера, а на менеджера и несколько лет проработала в банке.

Спорт и книги

Увидев, как постройнела Марина, за советами к девушке потянулись однокурсницы и подруги. Потом присоединились родственники приятелей и знакомые друзей. Поняв, что ее знания востребованы, Корпан начала брать в аренду залы в разных районах Москвы и проводить платные занятия. Затем девушка создала собственную студию, при руководстве которой ей помогли финансовые знания, полученные на экономическом факультете.

Фитнес-тренер Марина Корпан

В 2012 году Корпан получила второе высшее образование — окончила Российский университет физической культуры. Защита диплома совпала с выходом первой книги «Бодифлекс: дыши и худей». Читатели отмечают в пособиях Марины доступность изложения и их сильный мотивирующий эффект. Ложкой дегтя выступает только повторение из книги в книгу одинаковых советов и картинок.

Личная жизнь

Хотя у Корпан есть «Ютуб»-канал и страницы практически во всех социальных сетях — от «Инстаграма» до «Фейсбука», личную жизнь она предпочитает оставлять за кадром. Живет писательница преимущественно в Греции, приезжая в Россию для проведения курсов и тренингов.

Читайте также7 звезд, которые выбрали партнерские роды

Марина замужем, в 2008 году родила дочь Милану. За беременность Корпан набрала 17 кг. Послеродовая депрессия унесла 10 кг массы, но оставшиеся не желали уходить. Опыт борьбы с лишним весом помог Марине разработать уроки для молодых матерей и пополнить библиографию книгой «Моя стройная мама».

Милана с двух месяцев плавает в бассейне. С полутора лет девочка начала приобщаться к дыхательной гимнастике — увидела маму по телевизору и вместе с бабушкой стала повторять движения Марины.

Марина Корпан сейчас

У Корпан обширные планы на осень 2019 года. В октябре тренинги Марины проходят в Самаре и Казани, а в ноябре спортивный коуч приезжала в северную столицу России. Фото писательницы, наложенные на виды поволжских городов и Санкт-Петербурга, можно увидеть на страницах Корпан в соцсетях.

Марина Корпан в 2019 году

Ежедневно в конце августа 2019 года в интернете появлялись 10-минутные уроки экспресс-курса Марины «Худеем на одном дыхании». Интересно, что название дословно совпадает с заголовком книги Виктории Яковлевой, выпущенной в 2005 году изданием «Вектор».

Библиография

• 2012 — «Бодифлекс: дыши и худей»
• 2012 — «Оксисайз: худей без задержки дыхания»
• 2013 — «Бодифлекс для лица и тела»
• 2013 — «Бодифлекс 2-ной эффект: похудей и будь здорова»
• 2014 — «Как убрать живот»
• 2014 — «Как избавиться от боков, “ушей” и “галифе”»
• 2016 — «Моя стройная мама»
• 2017 — «Бодифлекс 2-ной эффект: твоя стройность и здоровье»

Марина Корпан бодифлекс — «Бодифлекс — минимум усилий и максимальный результат! Ссылки на ВИДЕО с Мариной Корпан.»

Укрепить иммунную систему, приобрести стройную фигуру, вернуть грацию и женское здоровье без изнурительных физических упражнений и голодных диет возможно! Занимаясь с программой Бодифлекс 15 минут в день все эти мечты станут реальностью! Каким образом Бодифлекс дает такие результаты- я расскажу далее.

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Вот я. С лишним весом боролась, борюсь и буду бороться

. Одно дело лишний вес, другое нужно приводить в порядок мышечный каркас. Мои параметры 90-70-90. У меня всегда проблема с широкой талией и все лишнее сразу откладывается на животе. Бодифлекс позволяет таким ленивым как и я уменьшить именно те участки тела, которые нужны, а те, которые ни в коем случае не должны сдуваться остануться на месте!!!

 

Знакомимся с МАРИНОЙ КОРПАН.

Марина Корпан

МАРИНА КОРПАН — Тренер канала ЖИВИ.

Она с успехом практикует занятия для похудения основываясь на аэробном дыхатении:

— Бодифлекс с Мариной Корпан: Упражнения для молодости лица

— Дыхательная гимнастика бодифлекс

— Дышите глубже — вы худеете!

-Худеем с Мариной Корпан. Экспресс-курс

Экспресс курс «Худеем с Мариной Корпан»

Так же на канале ЖИВИ найдете много полезных статей о Бодифлексе

— Без чего бодифлекс не приносит результатов

— Бодифлекс: умеете ли вы дышать?

Бодифлекс с Мариной Корпан

— Правила дыхания от Марины Корпан

— Марина Корпан о бодифлексе и женском здоровье

— Дыхательная гимнастика бодифлекс: дышите глубже — вы худеете!

— «Худеем с Мариной Корпан»

Худеем с Мариной Корпан

— Как правильно дышать, чтобы похудеть?

Как действует Бодифлекс(bodyflex)?

Кислород — активный окислитель. Под его воздействием расщепляется жир и тонизируется мышечная ткань. В организме улучшается лимфоток и ускоряется обмен веществ. Комплекс упражнений Бодифлекс состоит из статических упражений выполняемых при анаэробном дыхании. Дыхание обогащает кислородом кровь, а статичные упражнения целенаправленно активируют сжигание жира в нужных зонах. С Бодифлексом вы будите худеть только в тех зонах, в которых этого хотите!!! А там, где нужен объем, все останется без изменений.

Схема очень простая и от того еще труднее поверить в ее эффективность. Я считаю, что нужно все проверять на себе.

Такую схему, основанную на сложных механизмах происходящих в нашем организме изобрели не ученые, а обчная американская домохозяйка Грин Чайледерс.

Перед занятием Бодифлексом желательно не есть 2-3 часа и после около получаса. Поэтому самым оптимальным считается занятия рано утром натощак. Занятия Бодифлексом должны быть ежедневными.

Бодифлекс можно совмещать с другими фитнес-программами, но не заменяя, а лишь дополняя его.

Заниматься Бодифлексом можно самостоятельно. Все упражнения простые и их описания можно найти в интернете. Для упражнений не нужна специальная физическая подготовка. Но мне намного приятнее и удобнее заниматься с инструктором.

Канал ЖИВИ есть и на Ютубе, Выложены видео с тренировками.

 

На канале ЖИВИ( [ссылка] ) регулярные утренние трансляции Бодифлекса. Если время трансляции не устраивает, то можно купить онлайн абонемент(150руб) и просматривать в удобное время. Так же можно купить видео курс.

На мой взгляд — Бодифлекс это самый эффективный способ моделировать фигуру для таких ленивых, как я.

В заключении хочу заметить, хоть Бодифлекс и не требует строгих диет и физических упражнений, это не значит что теперь можно начинать обжорство.

 

Будьте здоровы и прекрасны.

Худеем эффективно и правильно с Диетой Елены Малышевой

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

 

Спасибо за внимание

Если отзыв был вам полезен — ставьте (◕‿◕) ДА (◕‿◕)

~ ❤~ ПОДПИСЫВАЙТЕСЬ НА ОТЗЫВЫ ~ ❤~

ЗЕЛЕНАЯ КНИГА КРАСОТЫ 2014 ( каталог )!!! ПОДРОБНЫЙ отзыв о всех подарках и бонусах от Ив Роше и мой опыт заказов.Скриншоты. Фото коллекции парфюмов!!! Коды бонусов обновлены 11,02,2014

~ ❤~ ~ ❤~ ~ ❤~ IRecommend.ru. ~ ❤~ ~ ❤~ ~ ❤~Какие отзывы самые доходные и сколько можно заработать? ~ ❤~ ~ ❤~ ~ ❤~

Все, о том как заказать, оплатить, получить скидку и ЗАРАБОТАТЬ на БИКЕ!!!!!! Фото моих покупок (Более 10 посылок).

Коллажи в отзывах делаю в программе Fotokomok

Стол заказов E5.RU — отзыв

Fix Price — сеть магазинов одной цены — отзыв

Paypal — отзыв

Электронный кошелек Webmoney — отзыв

Марина Корпан — книги автора, биография, фото, личная жизнь

Автор методик по коррекции фигуры Марина Корпан родилась в России, но детство провела с родителями в Перу. Всегда хорошо и с удовольствием училась в школе, сначала за границей, а затем в Москве. После школы закончила факультет экономики и управления Московского государственного технического университета.После окончания университета  выходит замуж и уезжает с мужем в военный городок на Кавказ. Вернувшись в Москву, несколько лет  работает в банке, затем открывает собственное дело — спортивный клуб в одном из районов Москвы. И снова учится, но уже в Российском государственном университете физкультуры и спорта. В 2012 году оканчивает факультет сложно-координационных видов физкультурно-спортивной  деятельности. Диплом защищала по дыхательной методике Бодифлекс.

Знакомство с дыхательными оздоровительными методиками перевернуло её жизнь. Все дело в том, что  в детстве Марина была достаточно пухленьким ребенком, в школе также не отличалась стройностью. Став студенткой, решает привести свой вес в норму. Для этого начинает весьма активные действия. Вначале пробует тренажерный зал и различные фитнес-программы с одновременным резким ограничением в питании. Затем начинает заниматься дома по дискам и собственным комплексам, по 2-3 часа в день, опять же — практически голодая. Все это заканчивается очень печально — полнейшее истощение организма, аменорея, начали выпадать волосы, а организм вообще отказался принимать пищу. Помочь Марине смогли только в больнице, проведя гормонотерапию и откровенно объяснив ей, чем она рискует.

Восстановив нормальную работу организма, девушка начала много читать и собирать информацию. Ей на глаза попалась дыхательная методика  «Бодифлекс», затем брошюрка с кратким описанием дыхания оксисайз. Хорошо изучив эти методики и разобравшись с  их внутренними механизмами, Марина решила донести свои знания женщинам и мужчинам, имеющим проблемы с лишним весом. Именно для этого она и открыла свой спортивный клуб и выпустила множество книг, имеющих прекрасные рецензии и отзывы благодарных читателей. Еще она является ведущей телевизионного курса по дыхательным методикам коррекции веса, участницей  множества ток-шоу и программ на разных телеканалах.Марина замужем, очень счастлива в браке, у супругов растет дочь.В нашем интернет-магазине Вы можете купить книги Марины Корпан или заказать их с доставкой по Киеву или в любой из городов Украины в любое удобное для Вас время.

Марина кортман — Диеты | Все для похудения

Результаты поиска по запросу:

.Россия Режиссер: Канал Живи ТВ Жанр: Обучающее видео Продолжительность: 8х00:51= 06:48:00 Год выпуска: 2009 В ролях: Марина Корпан, Светлана Губаренко, Марина Потапова. — Марина Портман. 26 лет, Москва, Россия. Её семья. вишинка-04 Здравствуйте, я занимаюсь боди флексом с Мариной Кортман с ноября, каждый день по утрам, результатов почти нет -3см за пол года. Инструктор Марина Кортман. Ну на сколько я знаю при физ нагрузках молоко перегорает ( не точная информация, просто где то слышала или читала), а эта штука уж очень эффективная. Худеем с мариной кортман! Но если вы приучите себя следовать им, то сделаете первый.
Отзывы о ТВ-передача Бодифлекс с Мариной Кортман (Живи). Присоединяйтесь к Facebook, чтобы связаться с Мариной Ермиловой и найти других друзей.
Olivia Wilde, Натали Портман, Джонни Депп. Wrong Марина Ермилова? Включаю камп.захожу в утюб или на одноклассники в поиск вбиваю бодифлекс с Мариной Кортмани делаю все вместе с ней! ledi2009 мама. Всем привет,всем спасибо! На канале ЖИВИ Марина Кортман ведет занятия по дыхательным практикам. Последний прием пищи перед занятиями должен быть необременительным (фрукты, овощи). СКАЧАТЬ видео Бодифлекс с Мариной Корпан (диф.изменения поджелудочной железы,Жировой гипатоз), ФГДС-( Гастрит )+еще появились головные боли и боли в шее. Чем лечить дисбактериоз у ребенка? Народные средства или. .пройти тест +на похудение бесплатно, лаптев похудение, упражнения +для похудения живота видео, хром +для похудения, китайские средства +для похудения
похудения, магазины товаров +для похудения, прыгалки +для похудения, безопасные средства +для похудения.

Бодифлекс с Мариной Корпан- суть, нюансы, техники » WomanMirror

Марина Корпан– писательница и опытный инструктор по техникам фитнеса и дыхательной гимнастики. Бодифлекс с Мариной Корпан оценили сегодня многие, особенно женщины с проблемами лишнего веса. Кроме того, адепты здорового образа жизни признают, что 15 минутный комплекс от “знаменитой гимнастки”, если выполнять все упражнения поэтапно и регулярно, дарит бодрость и силы на весь трудовой день.

С чего все начиналось?

О гуру похудения не так много данных, однако известно, что она выпускница высшего учебного заведения 2005 года, и сама в свое время столкнулась с проблемой лишнего веса. Пытаясь самостоятельно избавиться от килограммов, девушка многое перепробовала. Пока ее не заинтересовала авторская методика американки Грир Чайлдерс. Это был комплекс упражнений и аэробных нагрузок, дыхательной техники, направленный на коррекцию веса и силуэта. Таким образом, идея использовать бодифлекс для похудения принадлежит не нашей соотечественнице, она лишь адаптировала методику и на основании своих трудов записала видео уроки. Инструкция так понравилась пользователям Рунета, что Марина Корпан онлайн бьет рекорды по просмотрам.

Финансист по образованию, она сегодня востребованный личный тренер, ведет групповые занятия по бодифлексу и дыхательным практикам в г. Москва. А всемирная сеть предоставляет всем желающим отличную возможность практиковать бесплатный бодифлекс, не выходя из дома.

Книги под авторством Корпан

Путь к популярности среди множества женщин для Марины Корпан открыл комплекс бодифлекс, о сути и практике которого молодая женщина уже написала несколько книг. Среди них:

• «Бодифлекс: дыши и худей»- бестселлер о том, как в домашних условиях снизить вес на 10-20 кг, при этом не соблюдая жесткую диету. Книга стала такой популярной потому, что описанные в ней рецепты более чем доступны. Эти упражнения каждая из нас может проделывать самостоятельно, не прибегая к помощи инструктора и не используя оборудование спортивного зала. Кроме того, автор рекомендует тратить в сутки на специальные физические нагрузки не более 10-30 минут, что очень удобно для работающих леди;
• «Оксисайз: худей без задержки дыхания» – следующее доступное и популярное пособие, мотивирующее и указывающее людям путь к здоровью. Помочь самой себе, лишь корректируя процесс дыхания – звучит очень заманчиво;
• «Бодифлекс для лица: как выглядеть на 10 лет моложе. Дыши и молодей»- в данной книге рассказывается о том, как без хирургии и инъекций стать снова юной – нужно лишь пошагово проделывать несложные упражнения. Показана подробная схема работы мышц лица, даются пояснения, что и в какой последовательности выполнять. А также разъясняется возможный эффект– коррекция овала лица, уменьшение носогубных складок, борьба со «вторым подбородком».

Bodyflex: суть техники

Рассмотрим подробнее, в чем соль методики, и почему уроки Марины Корпан так популярны в наш век ЗОЖ.

Бодифлекс с Мариной Корпан включает три составляющих:

• Дыхание: пятиэтапное дыхание с участием диафрагмы – залог успеха. Здесь не обойтись без полноценного видео, в котором Марина Корпан бесплатно все расскажет и покажет;
• Аэробика, то есть сам комплекс упражнений. Отзывы последователей Корпан говорят о том, что видео уроки их наставницы очень наглядны и хорошо детализированы. Смотреть их одно удовольствие: трудно не понять, чего от нас хочет инструктор. Между тем, правильное выполнение упражнений – уже половина успеха на пути к стройности;
• Фитнес, то есть общая подготовленность и хорошая форма организма для адаптации к нагрузкам. Сюда же входит питание, ведь у гуру бодифлекса есть свое мнение о калориях и полезной еде.

Существуют условия, которые необходимо выполнять, чтобы бесплатный бодифлекс подействовал:

• Выполнение нагрузок только в утренние часы и только натощак. Если это невозможно, то нужно подождать не менее 3х часов с момента последнего приема пищи;
• Уроки Марины Корпан включают контролируемую задержку дыхания. Нельзя самовольно превышать рекомендуемое инструктором время, это может кончиться плохо. Сами же занятия не должны продолжаться более, чем 1 час в день; после того, как вес снижен до желаемой отметки, от ежедневных тренировок лучше перейти к занятиям 2-3 раза в неделю.

Знаменитые 8 шагов к совершенству

Какие же уроки включает бодифлекс для похудения? Это 8 уроков, которые у всех на слуху.

• Они направлены на проработку бедер и живота, мышц шеи, рук и (как ни парадоксально) лица. Давно существует культура фитнеса в России, всем известно: хочешь идеальную фигуру – правильно питайся и не ленись посещать зал.
• Однако, когда речь идет о лице, те, кому за 30, мгновенно вспоминают про ботокс, носогубный филлер и сыворотки красоты. И почти никто не думает о «физкультуре для щек». Нам повезло: Марина Корпан в режиме online охотно делится и этим секретом.
• Каждый из 8 уроков начинается со знакомства с системой и ее азами. Прорабатывается дыхание, а также инструктор на видео поправляет ошибки ассистенток. Приятно, что не требуется ни снарядов, ни спецодежды – только четверть часа свободного времени для себя любимой и совсем небольшой уголок в помещении.
• Каждый 15 минутный комплекс направлен на сжигание жира, он ведет к интенсивному выделению в кровь углекислого газа в процессе дыхания, и потому противопоказан людям с некоторыми хроническими состояниями. Кроме того, заниматься бодифлексом крайне не рекомендуется беременным женщинам.
• Смотреть видеоуроки, включающие комплекс bodyflex, можно в сети совершенно бесплатно. На самом деле, их гораздо больше, чем 8, но в эту знаменитую подборку включены лучшие и самые востребованные.
• Многие отзывы отмечают как огромный плюс возможность не выходить из своей зоны комфорта. Известно, что люди, считающие себя излишне полными, испытывают смущение, занимаясь в общих группах, совершая пробежку в парке или проделывая упражнения воркаут на виду у прохожих. Персональный тренер не всем по средствам, а вот выкроить полчаса ранним утром при желании может каждая из нас.

Стать здоровее, выглядеть моложе, иметь красивую упругую кожу – все это достижимо, если верить в успех и детально выполнять инструкции знаменитой бодифлексистки. Личным примером она мотивирует своих поклонниц: при росте 164 см. она весит 59 кг, ее лицо миловидно и без всяких признаков возрастных изменений. Кроме того, она просто излучает бодрость и позитив – что может быть приятнее! Такой женщине хочется подражать.

Видео: Марина Корпан- экспресс курс для быстрого похудения

Марина Корпан: личная жизнь (муж). Биография

Оглавление

Личная жизнь марины Корпан

Биография Марины Корпан

Марина Корпан – инструктор по бодифлексу и разным дыхательным гимнастикам. Как известно, она преподает в специальной студии, а также выезжает к клиентам на дом. Помимо всего, она является известным инструктором канала «ЖИВИ!». При этом совершенно невозможно поверить в то, что когда-то спортсменка имела проблемы с лишним весом. Именно бодифлекс оказал влияние на ее жизнь. При этом клиентов инструктора интересует не только ее биография, но и подробности ее личной жизни. Так, в данной статье можно найти ответы на следующие вопросы: кто муж Марины Корпан, есть ли у нее дети, как сложилась личная жизнь марины Корпан и т.д.

Личная жизнь марины Корпан

О своей личной жизни Марина Корпан предпочитает не распространяться. По ее словам, ее клиенткам не обязательно знать о подробностях ее семейной жизни. Так, публике достоверно неизвестно, есть ли муж у Марины Корпан. Также в свободном доступе нет никакой информации о наличии детей у инструктора.

На фото: инструктор по бодифлексу Марина Корпан

В свободное от работы время спортсменка предпочитает отдыхать с приятелями на природе. Время от времени на просторах Сети появляются персональные фото инструктора. Также она любит публиковать в интернете фотографии с тренировок.

Биография Марины Корпан

Как выяснилось, с самого детства Марина боролась с лишним весом. Скорее всего, из-за проблем с лишними килограммами она и решила связать свою жизнь со спортом, занявшись инструкторством.

Марина Корпан во время тренировки

«Я всегда была полненькой. Занималась разными видами фитнеса, но не могла избавиться от лишних килограммов. Я занималась и днем, и ночью. Помню, что даже от еды отказывалась. Правда, этот способ похудения оказался не самым лучшим – от результатов столь жестокого метода похудения я была вынуждена лечиться. Полноту я смогла победить благодаря бодифлексу. Тогда я смогла избавиться от 25 килограммов. Вы не представляете насколько я была счастлива. После этого я и решила, что буду помогать другим женщинам, которые имеют такие же проблемы», — рассказала Марина Корпан.

Как известно, в 2005 году Марина стала выпускницей Московского государственного технического университета радиотехники, электроники и автоматики. При этом по специальности она все же предпочла не работать. Также есть информация, что инструктор имеет огромные профессиональные надежды на дыхательную гимнастику, развитием которой активно занимается. На сегодняшний день все ее занятия проходят в комплексе, который она арендует в столице России.

Amazon.com: Übersetzbarkeit: Jalta. Positionen zur jüdischen Gegenwart 07 (немецкое издание), электронная книга: Бартал, Йоси, Беккер, Майкл, Ботч, Гидеон, Чебли, Савсан, Черновский, Марина, Куртман, Николас, Кубелик, Даниэль, Эрбен, Катарина, Фархари, Насрин, Кемпин, Даниэль , Кюне, Ян, Кулачатан, Мельтем, Ноймайер, Натали, Миротворец, Ханна, Рёселер, Дорин, Шойбле, Барбара, Шемоэлоф, Мати, Сойлу, Ясемин, Шпор, Йоханнес, Венцель, Мирьям, Зенели, Майла, Тхи, Сюзанна , Кэролайн, Брумлик, Миха, Черновский, Марина, Чоллек, Макс, Миротворец, Ханна, Шапиро, Анна, Воль фон Хазельберг, Леа: Kindle Store

«Siehe, Ein Volk ist es und Eine Sprache haben Alle, und das ist der Anfang ihres Tuns, und nun möchte ihnen nichts unzugänglich sein, von allem was sie gesonnen sind zu tun.Wohlan, lasset uns hinabsteigen, und dort verwirren ihre Sprache, daß sie nicht verstehen Einer die Sprache des Andern ». (Gen 11,6–7)

In Gen 11,1–9 wird erzählt, dass sich die Menschen der Gegend zusammenfanden , um einen Turm zu errichten, der bis zum Himmel reichen sollte. Damals hatte die ganze Erde «Eine Sprache und einerlei Worte» (Gen 11,1). Als Gott das sah, verwirrte er ihre Sprache und brachte das Projekt des Turmbaus zu Damit zum Erliegen. Eine Interpretation der Erzählung könnte lauten, dass die einheitliche Sprache, von der in der Thora die Rede ist, die Fähigkeit der Menschen meint, kollektiv zu handeln.Die sprichwörtliche babylonische Sprachverwirrung beschriebe demnach den Verlust der Fähigkeit, die Differenz der Menschen zu verstehen und für ein gemeinsames gesellschaftliches Projekt einzusetzen.

Die siebte Ausgabe von Jalta versammelt Perspektiven auf Übersetzbarkeit als zentrale Frage einer radikal vielfältigen Gesellschaft. Был braucht es, um Sprachen zu übersetzen? Wo finden noch Übersetzungsprozesse statt? Auf welche Weise kann Übersetzung ein Akt der Aneignung sein, der die Besonderheit der Differenz nivelliert und ihr eine Funktion zuweist? Был ли bedeutet Unübersetzbarkeit? Wie können Störungen in Übersetzungsprozessen produktiv gemacht werden? Welche Potentiale haben neue kollektive Sprachschöpfungen?

9783958082595: bersetzbarkeit: Jalta.Positionen zur jdischen Gegenwart 07 — AbeBooks

Йоси Бартал, Даниэль Кемпин, Ян Кхне,

Изменить номинал Neofelis Verlag GmbH, Германия (2020)

ISBN 10: 3958082599 ISBN 13: 9783958082595

Neuf Мягкая обложка Доступное количество: 1

Описание du livre Мягкая обложка.Etat: Новое. Язык: немецкий. Совершенно новая книга. «Siehe, Ein Volk ist es und Eine Sprache haben Alle, und das ist der Anfang ihres Tuns, und nun mchte ihnen nichts unzugnglich sein, von allem was sie gesonnen sind zu tun. Wohlan, lasset uns hinabsteircheren, und dort verwragen da sie nicht verstehen Einer die Sprache des Andern ». (Быт. 11,6-7) В Быт. 11,1-9 wird erzhlt, dass sich die Menschen der Gegend zusammenfanden, um einen Turm zu errichten, der bis zum Himmel reichen sollte. Damals hatte die ganze Erde «Eine Sprache und einerlei Worte» (Gen 11,1).Als Gott das sah, verwirrte er ihre Sprache und brachte das Projekt des Turmbaus zu Babel damit zum Erliegen. Eine Interpretation der Erzhlung knnte lauten, dass die einheitliche Sprache, von der in der Thora die Rede ist, die Fhigkeit der Menschen meint, kollektiv zu handeln. Die sprichwrtliche babylonische Sprachverwirrung beschriebe demnach den Verlust der Fhigkeit, die Differenz der Menschen zu verstehen und fr ein gemeinsames gesellschaftliches Projekt einzusetzen.Был braucht es, um Sprachen zu bersetzen? Wo finden noch bersetzungsprozesse statt? Auf welche Weise kann bersetzung ein Akt der Aneignung sein, der die Besonderheit der Differenz nivelliert und ihr eine Funktion zuweist? Был ли bedeutet Unbersetzbarkeit? Wie knnen Strungen in bersetzungsprozessen produktiv gemacht werden? Welche Potentiale haben neue kollektive Sprachschpfungen ?. N de rf. du Vendeur LIB9783958082595

Plus d’informations sur ce vendeur | Contacter le Vendeur

Übersetzbarkeit von Yossi Bartal, Daniel Kempin, Jan Kühne, Meltem Kulaçatan, Nathalie Neumaier, Hannah Peaceman, Doreen Röseler, Barbara Schäuble, Mati Shemoelof, Yasemin Soylu, Johannes Spohr, Michael Beckerne, Mirjamne , Gideon Botsch, Sawsan Chebli, Marina Chernivsky, Nicholas Courtman, Danijel Cubelic, Katharina Erben, Nasrin Farkhari

«Siehe, Ein Volk ist es und Eine Sprache haben Alle, und das ist der Anfang ihres Tuns, und nunen münchen sein, von allem was sie gesonnen sind zu tun.Wohlan, lasset uns hinabsteigen, und dort verwirren ihre Sprache, daß sie nicht verstehen Einer die Sprache des Andern. «(Gen 11,6-7) В Gen 11,1-9 wird erzählt, dass sich die Menschen der Gegend zusammenfanden, um einen Turm zu errichten, der bis zum Himmel reichen sollte. Damals hatte die ganze Erde «Eine Sprache und einerlei Worte» (Gen 11,1). Als Gott das sah, verwirrte er ihre Sprache und brachte das Projekt des Turmbaus zu Babel Erliegen. Eine Interpretation der Erzählung könnte lauten, dass die einheitliche Sprache, von der in der Thora die Rede ist, die Fähigkeit der Menschen meint, kollektiv zu handeln.Die sprichwörtliche babylonische Sprachverwirrung beschriebe demnach den Verlust der Fähigkeit, die Differenz der Menschen zu verstehen und für ein gemeinsames gesellschaftliches Projekt einzusetzen. Die siebte Ausgabe von Jalta versammelt Perspektiven auf Übersetzbarkeit als zentrale Frage einer radikal vielfältigen Gesellschaft. Был braucht es, um Sprachen zu übersetzen? Wo finden noch Übersetzungsprozesse statt? Auf welche Weise kann Übersetzung ein Akt der Aneignung sein, der die Besonderheit der Differenz nivelliert und ihr eine Funktion zuweist? Был ли bedeutet Unübersetzbarkeit? Wie können Störungen in Übersetzungsprozessen produktiv gemacht werden? Welche Potentiale haben neue kollektive Sprachschöpfungen?

Миха Брумлик, почетный профессор Института немецкой швейной промышленности Гёте во Франкфурте-на-Майне, с 2013 г. Старший профессор Центра юстиции Берлина / Бранденбурга.Er ist Mitherausgeber der Blätter für deutsche und internationale Politik sowie Autor und regelmäßiger Kolumnist der taz. Brumlik ist Träger der Buber-Rosenzweig-Medaille. Студия Марины Черновского в Израиле и Берлине Psychologie, Soziologie, Verhaltenswissenschaften und Verhaltenstherapie. Sie leitet das von ihr initiierte Kompetenzzentrum für Prävention und Empowerment in der Trägerschaft der Zentralwohlfahrtsstelle der Juden in Deutschland и arbeitet als Lehrbeauftragte sowie Beraterin unter anderem zu Diversitämität — Migration, Migration,Sie ist im Vorstand von AMCHA Deutschland, Deutsche Soccer Liga e.V., Dachverband für transkulturelle Psychiatrie, Psychotherapie und Psychosomatik (DTPPP e.V.) и ist Mitglied im zweiten unabhängigen Expertenkreis Antisemitismus des Deutschen Bundestismages. Max Czollek studierte Politikwissenschaften in Berlin und promovierte in London und Berlin zur interdisziplinären Antisemitismusforschung (ZFA, TU Berlin, 2016). Während seines Studiums представлял собой Mitglied des Lyrikkollektivs G13 и инициировал проект «Babelsprech, Junge deutschsprachige Lyrik», начиная с 2013 года как deutscher Kurator betreut.Im Mai 2016 Organisierte er zusammen mit Sasha Marianna Salzmann «Desintegration. Ein Kongress zeitgenössischer jüdischer Positionen» в Театре Максима Горького, Студия. Czollek ist Mitherausgeber der Anthologie Lyrik von Jetzt 3. Babelsprech (Wallstein 2015) und veröffentlichte die Gedichtbände Druckkammern (Frank 2012) und Jubeljahre (Frank 2015). Ханна Писеман, родилась в 1991 году, изучается философия, политическая и гендерная наука в Марбурге, Лондоне, Франкфурте и Йене. Sie promoviert am Max-Weber-Kolleg in Erfurt zu dem Thema «Jüdische politische Philosophie in der deutschsprachigen Diaspora vom 19.Jahrhundert und bis zur Shoah «. Von 2010 — 2016 war sie Stipendiatin des Ernst-Ludwig-Ehrlich Studienwerks (ELES). Anna Schapiro studierte Bildende Kunst an der HfBK Dresden bei Ulrike Grossarth, bei der sie auch derzeitium Universidade do Porto, Португалия. Sie arbeitete unter anderem am Hamburger Bahnhof — Museum für Gegenwart, Berlin, im Rahmen der Ausstellung Black Mountain: Ein interdisziplinäres Experiment 1933–1957 (Spector 2015). Im Wintersemester 2016/17 lehrt sie an der Muthesius.Ihr Interesse gilt sowohl bildnerischen als auch gesellschaftlichen Transformationsprozessen. Ihre Arbeiten хранится в андереме в Kunsthaus Dresden, dem Museum für zeitgenössische Kunst Wroclaw sowie dem Museum da Vilha Vela, Villa Real, Portugal, zu sehen. Sie war Stipendiatin des Landes Sachsen-Anhalt am Kunstverein Röderhof sowie Stipendiatin am Neuberg College — Verein für Übersetzung der Gesellschaft, Neuberg a. d. Мюрц (Австрия). Derzeit ist sie Stipendatin des Ernst Ludwig Ehrlich Studienwerks.Леа Воль фон Хазельберг в театре, кино и СМИ во Франкфурте-на-Майне Studiert und an der Universität Hamburg im Bereich Medienwissenschaften mit Und nach dem Holocaust? (Neofelis 2016) промовирт. Sie forscht und schreibt zu zeitgenössischen jüdischen Themen in Deutschland, zu Erinnerungskultur und Film.

Рекеллюляризация хорошо сохранившегося бесклеточного каркаса почек с использованием эмбриональных стволовых клеток

Abstract

При хронических заболеваниях почек маловероятно, что подавляющее большинство населения мира будет иметь доступ к заместительной почечной терапии с диализом или трансплантацией.Тканевая инженерия поможет устранить этот недостаток путем регенерации поврежденной почки с использованием естественных каркасов, засеянных клетками-предшественниками почек. Цели настоящего исследования заключались в оптимизации производства трехмерных (3D) каркасов цельной почки крысы путем сокращения продолжительности процесса децеллюляризации органов с использованием детергентов, которые избегают неионных соединений, для исследования целостности структуры внеклеточного матрикса (ЕСМ) и повысить эффективность клеточной обработки каркаса с помощью метода физиологической перфузии.Интактные почки крысы были успешно децеллюляризованы после 17-часовой перфузии додецилсульфатом натрия. Каркасы цельной почки сохранили трехмерную архитектуру кровеносных сосудов, клубочков и канальцев, как показали трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия. Микрокомпьютерная томография (микро-КТ) подтвердила целостность, проходимость и связь сосудистой сети. Окрашивание децеллюляризованных каркасов коллагеном IV, ламинином и фибронектином было аналогично окрашиванию нативных тканей почек. После инфузии цельнопочечных каркасов с мышиными эмбриональными стволовыми (mES) клетками через почечную артерию и перфузии под контролем давления с рециркулирующей клеточной средой в течение 24 и 72 часов засеянные клетки почти полностью задерживались в органе и равномерно распределялись в сосуде. сеть и клубочковые капилляры без серьезных признаков апоптоза.Иногда клетки mES достигают перитубулярных капилляров и канальцев. Мы наблюдали потерю клеточной плюрипотентности и начало дифференцировки в направлении мезоэнтодермального происхождения. Наши результаты показывают, что с предлагаемым оптимизированным протоколом почки крысы могут быть эффективно децеллюляризованы для образования почечных каркасов внеклеточного матрикса за относительно короткое время и быстрой рецеллюляризации сосудистых структур и клубочков. Эта экспериментальная установка может открыть возможность получения дифференцировки стволовых клеток с длительной перфузией in vitro и .

Введение

Хроническая болезнь почек (ХБП) — это прогрессирующее заболевание, характеризующееся ухудшением функции почек с течением времени. В конечном итоге наступает терминальная стадия почечной недостаточности, и требуется заместительная почечная терапия с диализом и / или трансплантацией почки. ¹ Пациенты с некоторой степенью ХБП составляют не менее 8% (~ 40 миллионов человек) европейского населения с прогрессирующей тенденцией к увеличению с каждым годом. ¹ Чтобы справиться с этим увеличением, национальные правительства могут рассчитывать на расходы почти 3–5% своих годовых бюджетов на здравоохранение на заместительную почечную терапию.Хотя эти методы лечения все еще доступны в промышленно развитых странах, у подавляющего большинства населения мира мало шансов получить доступ ни к диализу, ни к трансплантации. ² Более того, пока нет адекватной альтернативы с лечебной целью, чем трансплантация почки, но подход серьезно затрудняется из-за в конечном итоге ограниченной выживаемости трансплантата и недостаточного количества доноров.

Технологии тканевой инженерии для регенерации поврежденной почки помогут одновременно преодолеть ограниченный доступ к диализу, потребность в органах для трансплантации и избежать воздействия на пациентов иммунодепрессантов.Идея заключается в использовании каркаса для выращивания клеток-предшественников почек и получения нового шаблона для трансплантации почки. Из-за сложности каркаса, необходимого для конструирования целого органа, естественный каркас, сделанный из децеллюляризованного внеклеточного матрикса почек (ВКМ), является ключевым шагом для этого регенеративного подхода. ³ Каркас должен сохранять нетронутой трехмерную (3D) структуру органа, включая сосудистую сеть и врожденные компоненты матрикса, необходимые для стимулирования адгезии, миграции, пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников.

Децеллюляризация биологических тканей для инженерного подхода традиционно ограничивалась тонкими тканевыми структурами, такими как кишечник, ⁴ клапана сердца, ⁵ и кровеносные сосуды. ^6,7 Однако в последнее время сложные органы грызунов, такие как сердце, печень и легкие, также были успешно использованы для создания биоскаффолдов путем децеллюляризации, чтобы сохранить неповрежденную структурную организацию органа. ^8–12

Росс и соавторы ¹³ впервые расширили этот подход на регенерацию почек и сообщили о возможности получения бесклеточного каркаса ECM из почки крысы.5-дневный протокол поэтапной децеллюляризации позволил постепенно удалить клетки из всей почки с использованием неионных и ионных детергентов и ферментативной деградации материала ядерных клеток. Однако неионные детергенты могут травмировать ткань и нарушать структуру коллагена ECM. Затем плюрипотентные мышиные эмбриональные стволовые (mES) клетки вводили вручную через почечную артерию и мочеточник, чтобы засеять цельнопочечный каркас. Тем не менее, пролиферация и дифференцировка mES-клеток в основном оценивалась с помощью in vitro культуры тонких срезов каркаса в статических условиях, и были опубликованы только предварительные технико-экономические исследования интактных почек, подвергшихся пульсирующей перфузии среды для роста. ¹³ Таким образом, этот подход не обеспечивает надежных доказательств посева и пролиферации клеток в условиях, которые более точно имитируют воздействие in vivo и на врожденный каркас ECM с почечными предшественниками. Совсем недавно почечные каркасы ECM были также успешно получены из почек свиней, ¹⁴ почек обезьян ¹⁵ и человека ¹⁶ в качестве платформы для исследований почечной биоинженерии, но попытки повторно заселить каркасы целых почек клетками не предпринимались. это расследование.

Целью нашего настоящего исследования было усовершенствовать протокол получения децеллюляризованных каркасов внеклеточного матрикса крысы и репопуляции их mES-клетками в физиологических условиях перфузии in vitro и . В частности, наши усилия были сосредоточены на сокращении времени процесса децеллюляризации почек с использованием более щадящих детергентов, исследовании целостности компонентов внеклеточного матрикса и структуры органов и, наконец, проверке пригодности и эффективности метода динамической перфузии для посева и повторного заселения всей почки. каркас и индуцировать дифференцировку стволовых клеток.

Материалы и методы

Извлечение почек

Использовали 24 взрослых крыс-самцов Sprague-Dawley (Charles River Laboratories International, Inc., Уилмингтон, Массачусетс) массой 250–400 г. После анестезии изофлураном был сделан продольный разрез брюшной полости и идентифицированы левая почка, аорта, полая вена и мочеточник. Почка была освобождена от окружающего жира и мобилизована. Затем в левую почечную артерию канюлировали катетер PE50 и фиксировали шелковой нитью 4/0.Затем почку перфузировали физиологическим раствором (NaCl 0,9%; SALF SpA, Бергамо, Италия), содержащим сосудорасширяющее средство (нитропруссид, 10 ^-4 M; Sigma-Aldrich Co. LLC, Сент-Луис, Миссури) для удаления крови. . После бланширования почку собирали и поддерживали погруженной в физиологический раствор до обработки. Уход за животными и их лечение проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, в соответствии с национальными (DL n. 116/1992, Circ. 8/1994) и международными (EEC Dir. 86/609, OJL 358, декабрь 1987; NIH Guide for Закон об уходе за лабораторными животными и их использовании, NRC США, 1996 г.).

Децеллюляризация органа

Устройство ad hoc было разработано и сконструировано для перфузии почек в контролируемых условиях с использованием различных растворов для процесса децеллюляризации. Устройство состоит из стеклянной камеры для удержания почки, подключенной к перфузионной системе, предназначенной для минимизации захвата воздуха. Почку переносили при комнатной температуре в камеру, содержащую раствор, используемый для децеллюляризации органа. Канюля, ранее введенная в почечную артерию, была подключена к перистальтическому насосу.Почки перфузировали 1% раствором додецилсульфата натрия (SDS; Sigma-Aldrich Co. LLC) в PBS в течение 17 часов при скорости потока 0,4 мл / мин. Гидравлическое давление непрерывно регистрировалось датчиком давления (WPI, Inc., Сарасота, Флорида), системой сбора цифровых данных MP150 и программным обеспечением AcqKnowledge (BIOPAC Systems, Inc., Голета, Калифорния). Давление перфузии поддерживалось в физиологическом диапазоне (от 62 ± 16 до 107 ± 23 мм рт. Ст.) На протяжении всего процесса децеллюляризации. В контуре использовалась податливость, чтобы гасить колебания давления, создаваемые насосом, и избегать циркуляции воздуха в контуре.Наконец, почка была перфузирована дистиллированной водой, чтобы вымыть детергент. Децеллюляризованные каркасы почек использовали либо для гистологического исследования, либо для экспериментов по рецеллюляризации.

Характеристика биопокрытия всей почки

Децеллюляризованные почки ( n = 11) были разрезаны на шесть поперечных срезов, три были сохранены в фиксаторе Duboscq-Brazil (Diapath SpA, Бергамо, Италия) в течение ночи, обезвожены в возрастающих концентрациях алкоголя. и заключили в парафин для гистологического анализа.Для каждого парафинированного блока ткани получали срезы размером 3 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином для оценки морфологии матрикса. Три других поперечных среза фиксировали в периодат (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) -лизин (Sigma-Aldrich Co. LLC) -параформальдегид (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) фиксатор (PLP) при 4 ° C в течение ночи, погружая в 30% сахарозы в течение ночи, замораживают в жидком азоте и разрезают на срезы 3 мкм. Замороженные срезы окрашивали флуоресцеином агглютинином зародышей пшеницы (разведенный 1: 400; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) и DAPI 1 мкг / мл (Sigma-Aldrich Co. LLC) для оценки как морфологии матрицы, так и отсутствия остаточных ядер в каркасе. Иммунофлуоресцентное окрашивание на коллаген IV, фибронектин и ламинин проводили на замороженных срезах для оценки состава матрикса децеллюляризованной почки. Срезы инкубировали с кроличьим поликлональным антиколлагеном IV (разведенный 1:50; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс), кроличьим поликлональным анти-фибронектином крысы (разведенный 1:40; Chemicon International, Inc., Billerica, MA) или кроличий антимаминин (разведение 1: 100; Sigma-Aldrich Co. LLC). Вторичные антитела представляли собой конъюгат козьего анти-кроличьего IgG FITC (разведенный 1:25; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Саффолк, Великобритания) для коллагена IV и фибронектин и конъюгат антикроличьего IgG Cy3 (разведенный 1:50; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. ) для ламинина. Контрастное окрашивание DAPI 1 мкг / мл в течение 20 мин при 37 ° C проводили для окрашивания ядер клеток. Наконец, срезы были промыты и закреплены с использованием флуоресцентной монтажной среды DAKO (Dako Italia S.p.A., Милан, Италия). Затем образцы исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, Inc., Геттинген, Германия). Два образца, зафиксированные в 2,5% глутаральдеиде (Sigma-Aldrich Co. LLC), анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с использованием ранее описанных методов. ¹⁷ Образцы коры и мозгового вещества децеллюляризованной почки наблюдались в ПЭМ с использованием электронного микроскопа Morgagni FP5005 (FEI Company, Эйндховен, Нидерланды) и в СЭМ с использованием сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией (1540 EsB; Carl Zeiss GmbH, Оберкохен, Германия) ).

Микрокомпьютерная томография сосудов.

Для исследования структурной целостности сосудистого дерева, две децеллюляризованные почки были визуализированы с помощью микрокомпьютерной томографии (micro-CT 1076; Skyscan, Kontich, Бельгия) во время артериальной перфузии с контрастным веществом. . Вкратце, в конце процесса децеллюляризации почка была помещена на столик микро-КТ и рентгеноконтрастный раствор (Microfil, MV-122; Flow Tech., Carver, MA) был введен через почечную артерию с помощью шприцевого насоса (Harvard Apparatus. , Холлистон, Массачусетс) по ставке 0.2 мл / мин. Проецируемые изображения снимались каждую секунду с разрешением 18 мкм / пиксель (2000 × 1336 пикселей) с использованием фильтра Al. Когда Microfil вытек из почечной вены, и вена, и артерия были закрыты, и полимеризация смолы продолжалась в течение 3 часов. Затем почку снова поместили на столик микро-КТ, и сканирование было выполнено с использованием алюминиевого фильтра (толщина 0,5 мм), шаг поворота 0,4 ° и разрешение изображения 9 мкм / воксель. Затем проекционные изображения были реконструированы с помощью программного обеспечения NRecon (Skyscan) и визуализированы с помощью программного обеспечения CTvox (Skyscan).

R1 mES-культура клеток

Плюрипотентные mES-клетки R1 ¹⁸ были получены по соглашению MTA из лаборатории A. Nagy в Институте Mount Sinai, Торонто, Канада. Клетки R1 mES культивировали и пассировали каждые два дня на митотически инактивированных эмбриональных фибробластах мыши (MEF; E13.5; штамм 129) в среде для пролиферации DMEM с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 100 мкМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 100 мкМ. Ед / мл пенициллин – 100 мкг / мл стрептомицина, 0,1 мМ β-меркаптоэтанол, 10% FBS, квалифицированный на ES-клетки (все продукты были получены от Life Technologies Italia, Монца, Италия) и 1000 Ед / мл фактора ингибирования лейкемии (LIF ESGRO; Merck Millipore, Биллерика, Массачусетс).При необходимости культуры клеток R1 mES обрабатывали 2 мг / мл коллагеназы IV (Life Technologies Italia) в течение 10 мин при 37 ° C, чтобы избежать присутствия MEF.

Рецеллюляризация каркасов почек с помощью mES-клеток

Одиннадцать бесклеточных каркасов почек использовали для экспериментов по рецеллюляризации. Перед посевом клеток каркас промывали в открытом цикле 1% (об. / Об.) Пенициллин / стрептомицин (Life Technologies Italia) в PBS в течение 2 часов. Почки перфузировали той же средой, которая использовалась для культуры клеток, лишенной LIF, при 37 ° C в течение 30 минут, чтобы обеспечить питательными веществами и установить правильный pH в каркасе.Для посева клеток 12 × 10 ⁶ mES-клеток вводили антеградно через артериальную канюлю, подсоединенную к шприцевому насосу (Harvard Apparatus) со скоростью 0,2 мл / мин. Засеянный каркас перфузировали рециркулирующей средой в течение 24 или 72 часов. Условия культивирования поддерживали, поместив всю систему в инкубатор.

Гистологическая и гистохимическая характеристика

В конце перфузии рецеллюляризованная почка была обработана для гистологического и иммунофлуоресцентного анализа, как описано ранее.Срезы тканей, окрашенные гематоксилином и эозином, исследовали на световом микроскопе Axiovision (Zeiss, Jena, Germany). Для каждого участка отбора проб область сканировалась с помощью 20-кратного объектива с использованием программы MosaiX. Анализ был проведен на полученных изображениях с помощью программы анализа изображений ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MI). Репопуляция клеток в каждом клубочке оценивалась путем оценки уровня рецеллюляризации (0 = нет клеток, 1 = клетки, покрывающие 25% площади пучка, 2 = клетки, покрывающие 50% площади пучка, и 3 = клетки, покрывающие 100% площади пучка) .Иммуногистохимический анализ проводили на парафиновых срезах для окрашивания пролиферирующих клеток с использованием антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA). Фиксированные, залитые в парафин срезы Dubosq-Brazil (3 мкм) депарафинизировали, гидратировали и инкубировали с 0,3% H ₂ O ₂ в метаноле для гашения эндогенной пероксидазы. Извлечение антигена проводили кипячением срезов с использованием микроволн (дважды в течение 5 мин в цитратном буфере 10 мМ, pH 6,0, рабочая частота 2450 МГц и выходная мощность 600 Вт).Затем срезы инкубировали с мышиным моноклональным антителом против PCNA (разведенным 1: 250; Sigma-Aldrich Co. LLC). После инкубации с лошадиным биотинилированным антимышиным IgG (разведенным 1: 200; Vector Laboratories, Inc.) окрашивание проявляли раствором субстрата диаминобензидина (DAB; Merck KGaA). Слайды контрастировали гематоксилином, дегидратировали в спиртах с различной степенью очистки, закрывали покровными стеклами и наблюдали с помощью световой микроскопии. Иммунофлуоресцентное окрашивание на расщепленную каспазу-3, октамер-связывающий фактор транскрипции-4 (Oct-4), молекулу адгезии нейрональных клеток (NCAM), Tie-2 и CD31 проводили на замороженных срезах для оценки апоптоза и экспрессии маркеров дифференцировки клетки повторно заселяют каркасы через 24 и 72 часа после перфузии.Срезы инкубировали с кроличьими моноклональными анти-каспазой-3 (разведенными 1: 200; Cell Signaling Technology, Inc., Данверс, Массачусетс), мышиными моноклональными анти-Oct-3/4 (разведенными 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Dallas, TX), кроличьи поликлональные анти-NCAM (разведенные 1: 100; Millipore Corporation, Billerica, MA), козьи поликлональные анти-Tie-2 (разведенные 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и кроличьи поликлональные антитела. -CD31 (разбавленный 1: 100; Abcam plc, Кембридж, Великобритания). Вторичные антитела представляли собой конъюгат козьих антител против кроличьего IgG Cy3 (разведение 1:50; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.), коньюгат ослиного антимышиного IgG Cy3 (разведенный 1: 100; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.) и кроличий конъюгат против козьего IgG Cy3 (разбавленный 1:50; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Контрастное окрашивание DAPI 1 мкг / мл проводили для окрашивания ядер клеток. Срезы тканей исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, Inc.)

Результаты

Децеллюляризация почек

Децеллюляризация всего органа была достигнута артериальной перфузией с SDS, анионным детергентом, который лизирует клетки и солюбилизирует цитоплазматические компоненты.Перфузия моющим средством и промывание почки крысы поддерживали при физиологическом перфузионном давлении в течение 17 часов. Зарегистрированное давление составляло от 62 до 107 мм рт.ст. на протяжении всего процесса децеллюляризации. В конце перфузии был получен белый бесклеточный каркас, который сохранил общую форму и макроскопическую структуру почки (). Гистологическая оценка с окрашиванием гематоксилином и эозином показала розовое окрашивание эозинофилов, типичное для коллагена, в то время как не наблюдалось базофильного окрашивания, типичного для клеточного ядерного материала (), по сравнению с нормальным окрашиванием почек крысы ().Более того, микроструктура кортикального внеклеточного матрикса полностью сохранилась. Сходные результаты были получены с использованием флуоресцеина агглютинина зародышей пшеницы и DAPI, что свидетельствует о полном отсутствии ядер клеток (). Строение сосудов, клубочков и канальцев сохранилось.

Перфузионная децеллюляризация целых почек крысы и сохранение архитектуры почечного матрикса. Фотография почки крысы в ​​начале (A) и после (B) протокол децеллюляризации. Окрашивание гематоксилином и эозином срезов коры почек до (C, исходное увеличение 20 × ) и после (D, исходное увеличение 20 × и E, исходное увеличение 40 × ) Децеллюляризация SDS показывает отсутствие любого клеточного содержимого и целостности архитектуры клубочковых и трубчатых структур внутри каркаса.Окрашивание децеллюляризованной почки WGA-агглютинином и DAPI (F, , исходное увеличение 40 × ) . Окрашивание в синий цвет не привело к получению каркаса, что является косвенным доказательством полного клиренса клеток. SDS, додецилсульфат натрия.

Чтобы оценить, сохранилась ли ультраструктура каркаса после процесса децеллюляризации, каркасы почек фиксировали в глутаралдхейде и исследовали с помощью ПЭМ и СЭМ. ПЭМ-анализ подтвердил полное удаление клеточных компонентов и равномерное сохранение целостности базальной мембраны ().Трехмерную ультраструктуру клубочков и канальцевого матрикса после децеллюляризации оценивали с помощью SEM. Было подтверждено, что каркасы всей почки были полностью лишены клеток с непрерывной трехмерной микроструктурой ECM клубочковых капилляров, включая сегменты капилляров и капсулу Боумена (). Интегральная ультраструктура наблюдалась также для трубчатой ​​базальной мембраны и сосудистых структур ().

Ультраструктурный анализ бесклеточного биокаффолда. (A, B) Изображения децеллюляризованной почки, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, демонстрирующие отсутствие клеточных компонентов и сохранение целостности базальных мембран.Изображения (C – F) скаффолда, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии, подтверждают полное удаление клеточного материала и сохранение хорошо организованной трехмерной архитектуры матрикса почки. Стрелка указывает на базальную мембрану клубочка, а звездочки указывают на просвет капилляров клубочка. 3D, трехмерный.

Сохранение и проходимость сосудистой архитектуры

Чтобы оценить целостность и проходимость сосудистых сегментов и всей сосудистой сети, мы получили рентгеновскую проекцию децеллюляризованной почки с помощью микро-КТ во время инфузии контрастного вещества (Microfil).Представленная последовательность изображений показывает равномерное распределение контрастного вещества по иерархическим разветвленным структурам от почечной артерии до междольковых артерий, дугообразных артерий и мелких артериол без экстравазации в окружающие ткани. После артериальной фазы контрастное вещество проявилось позже в венозной стороне почечной сосудистой сети () и, наконец, в почечной вене (). Эти данные подтвердили целостность сосудистой сети, ее проходимость и связь артериального дерева с венозным деревом, которая должна проходить через клубочковые и перитубулярные капилляры.Как показывает трехмерная цифровая реконструкция, и артериальная, и венозная системы хорошо сохранились, и они должны иметь связь через микроциркуляцию.

Последовательность микро-КТ типичного бесклеточного каркаса почки крысы во время инфузии Microfil (A – D) и трехмерная цифровая реконструкция каркаса после инфузии Microfil (E – F) , демонстрирующая однородное соединение почечной артерии с почечная вена через капиллярное русло. Черная стрелка на панели A указывает почечную артерию.Серая стрелка на панели D указала на почечную вену.

Локализация белков ECM каркаса

Чтобы оценить степень сохранности ECM почек, мы сравнили распределение специфических белков ECM в каркасе и в нативной ткани почек крысы. Коллаген IV типа, ламинин и фибронектин демонстрируют сходные паттерны экспрессии в децеллюляризованной почке и нативной почечной ткани (). Иммунофлуоресцентное окрашивание показало полностью непрерывную сеть коллагена IV и ламинина в канальцах и базальной мембране клубочков (), в то время как экспрессия фибронектина была интенсивной в клубочках, но почти отсутствовала в канальцах ().

Иммуногистохимия белков внеклеточного матрикса в контроле (A, C, E, , исходное увеличение 20 × ) и децеллюляризованная почка (B, D, F, исходное увеличение 20 × ) . Децеллюляризованные ткани обнаруживают сходное распределение коллагена IV (B) и ламинина (D) в базальных мембранах канальцев и клубочков, как и в контроле (A, C) . Окрашивание фибронектином показывает интенсивный сигнал в клубочках контроля (E) и децеллюляризованной ткани (F) .

Рецеллюляризация каркаса mES-клетками

mES-клетки вводили через почечную артерию с помощью шприцевого насоса с постоянной скоростью перфузии. Предварительные эксперименты с 4 и 8 × 10 ⁶ mES-клетками привели к низкой репопуляции каркаса цельной почки (данные не показаны). Однако значительное улучшение было достигнуто путем инфузии 12 × 10 ⁶ mES клеток. Таким образом, все эксперименты в настоящем исследовании проводились с таким количеством mES-клеток, введенных в объеме 6 мл в течение 30 минут.Приблизительно 2,5% из 12 миллионов клеток были восстановлены в культуральной среде после 30-минутной инфузии, что указывает на то, что большинство mES-клеток были засеяны в бесклеточный каркас всего органа. После посева перфузионную систему с рецеллюляризованным каркасом переносили в инкубатор, и почки перфузировали в течение 24 или 72 часов рециркулирующей средой. Следует отметить, что в конце времени перфузии количество mES-клеток в циркулирующей среде составляло только 2,5% от начальных 12 миллионов, что позволяет предположить, что засеянный каркас сохранял большую часть клеток даже после длительного воздействия связанного с перфузией напряжения сдвига.

Гистологическое окрашивание гематоксилином и эозином показало однородный характер распределения клеток в сосудистой сети и в клубочках через 24 часа () и 72 часа (). Равномерное распределение клеток на уровне клубочков было подтверждено окрашиванием флуоресцеином зародышей пшеницы, агглютинином и DAPI, которое документировало клеточные ядра в каркасе (). Поперечное сечение рецеллюляризованного каркаса всего органа дополнительно продемонстрировало почти полную репопуляцию клеток клубочков во всей коре почек (19).Полуколичественный анализ отдельных клубочков показал, что mES-клетки покрывали всю площадь пучка (оценка 3) в 61% клубочков и более половины этой площади (оценка 2) в 25% клубочков. В нескольких клубочках (9%) клетки были локализованы только в более чем 25% площади пучка (оценка 1), в то время как в оставшихся 5% клубочков клетки не подсчитывались (оценка 0). Более того, несмотря на большое количество засеянных клеток, большинство капилляров клубочков проходимы. Интересно, что в мозговом веществе некоторые mES-клетки располагались в перитубулярном капилляре ().Более конкретная локализация этих клеток представлена ​​в. Как показано на серийных срезах (толщиной 3 мкм), инфузированные клетки повторно заселили перитубулярные капилляры, которые кажутся вставленными между соседними канальцами.

Повторное заселение каркасов почек mES-клетками. Окрашивание гематоксилином и эозином через 24 часа (A, C, E) и 72 часа (B, D, F) и иммуногистохимия на агглютинин WGA и DAPI через 24 часа (G) и 72 часа (H) каркаса почек, засеянного mES-клетками, демонстрируют гомогенное распределение клеток в клубочках, сосудистых структурах, перитубулярных капиллярах и канальцах.mES, эмбриональный ствол мыши.

Мозаичный вид поперечного сечения рецеллюляризованной почки, окрашенной гематоксилином и эозином (A) , демонстрирующий гомогенную репопуляцию клубочков mES-клетками. Последовательность изображений гематоксилина и эозина на серийных срезах рецеллюляризованных почек (B – E) , показывающая, что клетки mES расположены в перитубулярных капиллярах между соседними почечными канальцами. Единственная трубчатая петля вокруг аперитубулярного капилляра отмечена звездочками.

Иммуногистохимический анализ рецеллюляризованной почки

По оценке окрашивания PCNA, большинство mES-клеток, посеянных в каркасы, по-видимому, пролиферировали по крайней мере через 72 часа перфузии с рециркулирующей культуральной средой (). Средний процент профилирующих клеток (полученных при подсчете от 2300 до 3400 клеток) составлял 77,0 ± 7,9% и 86,0 ± 7,5% через 24 и 72 часа, соответственно. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, мы исследовали апоптоз клеток. Как показано в, мы наблюдали несколько апоптотических клеток как через 24, так и через 72 часа после перфузии.Средний процент апоптотических клеток (полученный при подсчете от 1000 до 1200 клеток) составлял 3,2% ± 2,7% и 1,3% ± 1,3% через 24 и 72 часа соответственно. Эти результаты предполагают, что каркас поддерживает компоненты врожденного матрикса, которые способствуют жизнеспособности клеток-предшественников.

Иммуногистохимия PCNA через 24 часа (A, исходное увеличение 20 × ) и 72 часа (C, исходное увеличение 20 × ) , mES-клеток в каркасе почек. Положительные иммунореактивные клетки окрашены в коричневый цвет.Иммунофлуоресценция каспазы-3 через 24 часа (B, исходное увеличение 20 × ) и 72 часа (D, исходное увеличение 20 × ) клеток mES в каркасе почек. Положительные апоптотические клетки окрашены в красный цвет. PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток.

Чтобы исследовать, претерпевают ли mES клетки дифференцировку при посеве в каркас почек, мы проанализировали экспрессию плюрипотентности и маркеров предшественников эндотелия, происходящих из мезодермы. Мы изучали в разные моменты времени клеточной перфузии экспрессию Oct-4, маркера эмбриональной стволовости, NCAM, маркера предшественников мезодермы, и маркеров эндотелиальных клеток Tie-2 и CD31.Как показано на фиг.4, культивируемые клетки mES экспрессировали высокие уровни Oct-4 перед перфузией. Через 24 часа клетки показали снижение экспрессии Oct-4, которое почти полностью исчезло через 72 часа, что указывает на прогрессирующее отсутствие плюрипотентности клеток в это время.

Иммунофлуоресцентное окрашивание на Oct-4, NCAM, Tie-2 и CD31 (исходное увеличение 40 ×) в клетках mES в культуре и поддерживаемых в каркасах почек в течение 24 и 72 часов (масштабные полосы представляют 20 мкм). NCAM, молекула адгезии нервных клеток; Oct-4, октамер-связывающий фактор транскрипции-4.

NCAM, отсутствующий в культивируемых клетках mES, незначительно экспрессировался через 24 часа и заметно экспрессировался через 72 часа, что позволяет предположить, что контакт клеток с трехмерным почечным матриксом индуцировал прогрессивную дифференцировку клеток в направлении предшественников эндотелия, происходящих из мезодермы. Мембранные маркеры Tie-2 и CD31 экспрессировались в клетках в капиллярах клубочков уже через 24 часа, и окрашивание сохранялось для Tie-2 и увеличивалось для CD31 через 72 часа. Окрашивание этих маркеров было отрицательным в культивируемых клетках перед перфузией в почечный каркас.

Обсуждение

Недавние достижения в тканевой инженерии привели к производству простых тканей, таких как сосуды, уретры, трахеи и мочевые пузыри, ^19–21 , где тонкий слой клеток и поддерживающий каркас могут быть имплантированы без восстановления притока сосудистая сеть. ²² В этих сконструированных тканях обычно происходит инфильтрация клеток-хозяев. Однако восстановление более сложных органов требует каркаса с полной сосудистой сетью, чтобы обеспечить питательными веществами и кислородом для поддержания клеточного компартмента, ^22,23 и возможность репопуляции различных клеточных популяций по всей структуре органа.Несмотря на эти трудности, были предприняты некоторые многообещающие попытки инженерии целых органов ²⁴ и, в частности, инженерии почек. Некоторые аспекты отличают наш нынешний подход от ранее опубликованных исследований. ^13,25,26 Мы упростили настройку децеллюляризации с использованием только одного детергента (SDS), который поддерживает трехмерную структуру и состав ECM, избегая токсичности из-за длительного использования других химикатов. Мы сократили время, необходимое для удаления клеток (17 ч), что лучше сохранило целостность почечного матрикса.Наши перфузионные эксперименты позволяют получить эффективное и равномерное приживление клеток внутри почки, достигаемое за счет контролируемых условий перфузии. В отличие от предыдущих сообщений, мы использовали ES-клетки для повторного заселения почечного матрикса и получили доказательства дифференцировки эмбриональных клеток в направлении сосудистого фенотипа.

Наше настоящее исследование основано на ранее описанных методах производства почечного каркаса внеклеточного матрикса из почек крысы. ¹³ Здесь мы показываем, что клеточный компартмент почек крысы был полностью удален, оставив после себя бесклеточный каркас ECM, который сохраняет свою сложную трехмерную структуру, путем перфузии органа только анионным детергентом SDS вместо комбинации ионного и неионного такие вещества, как Triton X-100, как в ранее опубликованных протоколах. ¹³ По сравнению с 5-дневным протоколом, о котором ранее сообщалось, ¹³ наша более короткая инфузия детергента SDS в условиях физиологического давления позволила полностью удалить клетки. SDS — это анионный детергент, который позволяет быстро разрушать клетки и очищать ядерные и цитоплазматические остатки. ^25,27 Аналогично, Triton X-100 использовался для солюбилизации гидрофобных клеточных мембран, лизирования клеток и удаления цитоплазматического содержимого, ^8,13 , но он также может повредить структуру коллагена. ²⁸ Действительно, есть свидетельства того, что обработка сухожилий крысы Triton X-100 разрушает структуру коллагена, эффект, не наблюдаемый при SDS. ²⁸ Более того, SDS удалял больше клеток, чем Triton X-100. ²⁸ Эти результаты, однако, не совпадают с результатами, полученными при лечении тритоном тканей перикарда и сердечного клапана ^29,30 , а также печени и почек животных в исследованиях децеллюляризации органов. ^13,31,32 Похоже, что эффекты, наблюдаемые при использовании протоколов децеллюляризации с Тритоном, зависят от типа ткани.Тем не менее, наши результаты показывают, что полная децеллюляризация почек крыс может быть безопасно достигнута с использованием одного SDS в качестве детергента, что подтверждено гистологическими и иммунофлуоресцентными данными, которые подтвердили полное удаление клеток без потери структурных белков ЕСМ.

Мы перфузировали почки с помощью перистальтического насоса и контролировали условия перфузии в течение всего процесса децеллюляризации, чтобы обеспечить мониторинг перфузионного давления. Этот подход отличается от гравитационной перфузионной системы, принятой Ross et al., ¹³ и в конечном итоге, возможно, способствовали более быстрому удалению клеток. Процедура децеллюляризации, основанная на контролируемой перфузии, также эффективна в поддержании архитектуры почек. Об этом свидетельствуют данные об интактной, хорошо организованной и однородной структуре и ультраструктуре клубочковых и трубчатых базальных мембран при ПЭМ и СЭМ. Кроме того, как показано на микро-компьютерной томографии децеллюляризованных почек, полученной во время инфузии Microfil, бесклеточный каркас сохранял целостность почечной сосудистой сети.Фактически, артериальный компартмент был связан с венозными сосудами сохранившимся капиллярным руслом, и это основное требование для успешной клеточности органа.

Врожденная структура каркаса ECM считается критической для прямого посева клеток и восстановления клеточного компартмента и, в конечном итоге, регенерации органов. ²⁴ Можно ожидать, что сохранение неповрежденных клубочковых, канальцевых и сосудистых структур внутри почечного каркаса ВКМ с нативными химическими сигналами будет способствовать распознаванию клетками-предшественниками их естественной ниши вдоль нефрона и сосудистых сегментов во время процесса рецеллюляризации. .Таким образом, другой целью нашего исследования было оценить способность полученного каркаса почечного ECM управлять правильным посевом и адаптацией репопулирующих клеток. Учитывая сложность структуры почек, которая включает более тридцати различных типов клеток, мы использовали ES-клетки для засева целых каркасов почек. ES-клетки доступны в виде установленных клеточных линий; они обладают способностью неограниченно расти при сохранении плюрипотентности, и они имеют потенциал развиваться и формировать любой эмбриональный орган in vivo . ^18,33 Более того, ES-клетки являются потенциальным источником почечных клеток для регенеративной терапии благодаря их способности дифференцироваться в любой из почечных клеток взрослого типа. ³⁴ Высокая эффективность внутрипочечного приживления клеток была достигнута путем инфузии mES-клеток через почечную артерию при низком давлении. В отличие от предыдущих протоколов репопуляции каркаса в статических условиях культивирования, ¹³ мы решили поддерживать клеточные каркасы в условиях перфузии с контролем давления с рециркулирующей клеточной средой, что в конечном итоге обеспечивает более адекватную доставку кислорода во весь объем каркаса и предотвращает вступление клеток в процесс апоптоза. .С помощью этого подхода мы смогли получить равномерное распределение засеянных клеток mES в сосудистой сети вплоть до капилляров клубочков, что подтверждено морфометрическим анализом клеток, засеянных внутри отдельных клубочков, при этом некоторые клетки достигли локализации перитубулярных капилляров. Несмотря на массовое присутствие клеток, просвет сегментов капилляров все еще оставался открытым, а перфузия питательных сред позволяла адекватную доставку питательных веществ и удаление продуктов метаболизма. Равномерное распределение mES-клеток в каркасах почек достигалось в течение 24 часов и сохранялось до 72 часов перфузии.Пролиферация mES-клеток наблюдалась в течение 72 ч перфузии каркаса. Эти находки дополнительно подтверждают целостность лежащих в основе почечных каркасов ECM, так как для функционирования клеток они должны поддерживаться должным образом, имея контакт с соседними клетками и ECM. Наши результаты подтверждают возможность ускорения репопуляции клеток каркаса всей почки с использованием контролируемых условий перфузии.

Иногда мы наблюдали клетки mES также в трубчатом отделении каркасов, особенно в перитубулярных капиллярах, что позволяет предположить, что потенциальная репопуляция сегментов канальцев нефрона может эффективно происходить даже при перфузии клеток через почечную артерию и только через 72 часа.Поскольку известно, что клетки реагируют на механические и биохимические изменения в ECM через перекрестные помехи между интегринами и актиновым цитоскелетом, ³⁵ существует возможность того, что перфузионное давление, поддерживаемое в перитубулярном капилляре во время процесса рецеллюляризации, может способствовать взаимодействию mES-клеток и ECM. , вызывая изменения формы и подвижности клеток и, в конечном итоге, миграцию для повторного заселения перитубулярного капиллярного ложа.

Хорошо известно, что взаимодействие клетка-ЕСМ и трехмерное микроокружение играют роль в морфологии, миграции, пролиферации и дифференцировке клеток.Было показано, что матрица базальной мембраны, которая лежит в основе эпителиальных и эндотелиальных клеток, способствует дифференцировке и формированию тканеподобных структур многих типов клеток. Как показано Cortiella et al. ³⁶ Бесклеточное легкое позволило лучше удерживать клетки с большей дифференцировкой мЭСК в эпителиальные и эндотелиальные клоны. ³⁷ Кроме того, было показано, что 3D-культуры улучшают дифференцировку ES клеток за счет увеличения межклеточной ассоциации и матриксной ассоциации. ³⁸ Культивируемые клетки mES в трехмерном каркасе могут достигать более высокой гемопоэтической эффективности дифференцировки, чем традиционные двумерные суспензионные культуры. ³⁹ Здесь мы задокументировали, что эмбриональные стволовые клетки при перфузии в децеллюляризованном почечном сосудистом компартменте были индуцированы 3D ECM, чтобы изменить их фенотип и дифференцироваться в мезо-энтодермальный клон. Результаты нашего иммуногистохимического анализа показывают, что mES-клетки, введенные в почечный каркас, постепенно теряли свою стволовость с течением времени.Более того, мы продемонстрировали увеличение клубочкового мечения для NCAM, адгезивной молекулы, которая представляет собой маркер мезодермальных почечных предшественников и эндотелиальных предшественников. ⁴⁰ Положительное окрашивание на Tie-2 и CD31, маркеры эндотелиального происхождения, также наблюдалось после инфузии в почечный каркас. В совокупности эти данные предполагают положительную роль сигналов, содержащихся в почечном ECM и трехмерной структуре, в влиянии на приверженность инфузированных клеток.

Совсем недавно Сонг и соавторы ²⁶ сообщили, что перфузия дифференцированными клетками, эндотелиальными клетками и клетками неонатальной почки децеллюляризованного почечного матрикса приводила к рецеллюляризации почечного каркаса, очень похожей на то, что получено в наших настоящих экспериментах. .Интересно, что эти авторы перфузировали клетки в почечном каркасе не только через почечную артерию, но также посредством мочеточника, поддерживая во время перфузии клеток отрицательное давление вне почки. Несмотря на двойную инфузию, даже после нескольких дней культивирования большинство клеток наблюдались, как и в нашем настоящем исследовании, на уровне клубочковых капилляров; очень мало клеток было обнаружено в трубчатом отсеке. В целом, эти результаты предполагают, что полное репопуляция почек — это процесс, который еще предстоит улучшить.Путь к достижению этой важной цели, вероятно, может зависеть от использования плюрипотентных стволовых клеток в сочетании с более благоприятным распределением давления и потока вдоль сложной структуры почечного матрикса.

В заключение мы показали, что реализованный нами протокол децеллюляризации успешно удалил все клеточные компоненты из почек крысы за короткое время, сохранил ECM, архитектуру сосудистой сети, клубочковые капилляры и трубчатую мембрану. Успешная быстрая рецеллюляризация сосудистых структур, клубочковых капилляров и иногда перитубулярных капилляров с динамической перфузией при физиологическом давлении бесклеточных каркасов создает основу для более обширных экспериментальных исследований с длительным культивированием для достижения однородной клеточности в канальцевых компартментах целого каркаса почки. , и это, возможно, индуцирует дифференцировку эмбриональных клеток в почечные соматические клетки.

Дом, милый дом для Марины — Monterey Herald

ПРИХОДИТСЯ…

Баскетбольная команда мальчиков школы Стивенсона будет представлена ​​в воскресном выпуске. Чтобы прочитать больше обзоров баскетбола, перейдите по ссылке: MONTEREYHERALD. COM / SPORTS
МАРИНА — За 13 лет Марина все свои баскетбольные матчи играла на выезде. Практики проводились везде, где был доступен сайт. Иногда это означало даже на открытом воздухе.

Не идеально. Больше не проблема.

У Mariners есть собственный тренажерный зал, новая достопримечательность кампуса.

«Мы очень благодарны за наш тренажерный зал», — сказал тренер Марины Рон Пауэлл. «Это было долгое ожидание. Но мы наконец-то играем на территории кампуса. Все сообщество в восторге ».

«Моряки» в прошлом сезоне боролись в дивизионе Санта-Лючия, выиграв только одну игру в лиге.

Всего с одним возвращающимся стартером и тремя игроками, которые видели время на твердой древесине в прошлом году, Марина будет в стадии разработки, поскольку она надеется показать прошлый сезон в зеркале заднего вида.

«Мы будем созревать с течением времени», — сказал Пауэлл. «Мы провели предсезонку, сосредоточившись на хорошей защите наполовину корте».

Пауэллу есть, с чем можно поиграть, начиная с младшего защитника Майкла Барреры, плеймейкера, который умеет стрелять и созидать с ведения.

Майкл Агилар — один из четырех юниоров, которые, как ожидается, выйдут на старт регулярного сезона для «Моряков», что создает для них еще одну угрозу на периметре, наряду с упорной защитой.

«Два Майкла, вероятно, приведут нас к результату», — сказал Пауэлл.«Но все пятеро моих игроков в стартовом составе могут стрелять и будут вносить свой вклад в концовке атаки. В прошлом году у нас не было такого баланса ».

Результатом стал сезон с двумя победами. Этой зимой Марина уже сравняла это количество.

Только один старший, Элайджа Норлунд, выйдет за Марину. Норлунд финишировал среди лидеров футбольной команды по приемам и отборам.

Ожидается, что состав юниоров Омара Мартинеса и Даррена Габо пополнят, что обеспечит «Морякам» быстрый и спортивный отряд, но не больших размеров.

«У нас все будет хорошо, если мы будем дисциплинированы и будем заботиться о баскетболе», — сказал Пауэлл, чья команда остается в дивизионе Санта-Лючия.

Защита была в центре внимания в предсезонке, так как Марина много давила и толкала мяч вверх и вниз по площадке.

«У нас есть несколько игроков, которые могут стрелять тройкой», — сказал Пауэлл.

Это включает более глубокую скамью, поскольку у Пауэлла будет возможность нанести удар своим стартерам, увеличивая темп в течение 32 минут.

«У меня есть игроки со скамейки запасных, которые понимают игру, — сказал Пауэлл. «Они добавят немного больше результативного удара. У нас есть некоторая универсальность. И у нас есть дом ».

Рекордные реквизиты Джона Винсента Даунса

Товар добавлен в корзину

Оформить заказ или продолжить поиск и добавить другие продукты в корзину.

Проверить Вернуться к поиску

1. • Регистрация рождения:

   • Джон Винсент Даунс

3. • Имя матери:
   • Агнес Бриджит Анджела Глинн
4. • Имя отца / родителей:
   • Альфред Даунс
5. • Реквизиты для регистрации:
   • 1920 / C / 9330
6. 
   После оформления заказа используйте ссылку на странице квитанции, чтобы загрузить изображение.

7. Приобретая эти товары, вы соглашаетесь с Условия и положения.

   Исторические записи, доступные для покупки на этом сайте, включают копии неотредактированных исторических документов первичных источников. Некоторые слова или термины, использованные в этих записях, отражают использование времени и теперь могут быть оскорбительными, бесчувственными, неуместными или оскорбительными. См. Раздел «Обязательства и возмещение ущерба» в Условиях использования.

8. Если вы захотите вернуться к этой записи позже, вы можете добавить эту страницу в закладки.

Эти дополнительные продукты для Джона Винсента Даунса доступны для покупки.

Принимаемых карт

Вестник семейной истории

Это бесплатный электронный информационный бюллетень.Вы можете подписаться, указав свое имя и адрес электронной почты.

Вы также можете изменить свои данные и отказаться от подписки, если больше не желаете получать бюллетень по семейной истории.

морских препаратов | Бесплатный полнотекстовый | Стратегии максимального использования потенциала морских биоматериалов в качестве платформы для клеточной терапии

2.1. Альгинат

Альгинат представляет собой полисахарид природного происхождения, содержащий блоки (1-4) -связанных мономеров β-d-маннуроновой кислоты (M) и α-l-гулуроновой кислоты (G), как показано на рисунке 2, и является одним из наиболее часто синтезируемых. природные материалы как структурный компонент морских бурых водорослей (Phaeophyceae), включая ламинарию гиперборейскую, ламинарию цифровую, ламинарию японскую, Ascophyllum nodosum и Macrocystis pyrifera [38,39].В общем, блоки состоят из трех различных форм полимерного сегмента: последовательных остатков M, последовательных остатков G и чередующихся остатков MG [38]. Соотношение остатка M и остатка G варьируется в зависимости от природного источника [6]. Длина каждого блока также может быть разной согласно источникам [40].

Рисунок 2. Химическая структура альгината. «M» и «n» обозначают количество остатков α-1-глюкуроновой кислоты и β-d-маннуроновой кислоты соответственно.

Рисунок 2. Химическая структура альгината. «M» и «n» обозначают количество остатков α-1-глюкуроновой кислоты и β-d-маннуроновой кислоты соответственно.

Полисахарид широко используется для множества применений в качестве биоматериала, в частности, в качестве поддерживающей матрицы или систем доставки для восстановления и регенерации тканей, поскольку он обладает желательными свойствами, включая биосовместимость, биоразлагаемость, неантигенность и способность к образованию гидрогелей от водный раствор в мягких условиях.Альгинат мгновенно образует гидрогели при pH> 6 путем ионотропного гелеобразования с двухвалентными катионами, такими как ионы кальция, бария или цинка. Для процедуры гелеобразования альгината только G-блоки участвуют в межмолекулярном сшивании с двухвалентными катионами. Следовательно, соотношение остатков M и G, последовательность, длина G-блоков и молекулярная масса полимера влияют на физические свойства получаемых гидрогелей [41]. По этой причине важно учитывать источник альгината и его химический состав, чтобы правильно использовать полимер для каждой цели, поскольку физические свойства альгината значительно влияют на фенотип и функцию клеток, засеянных альгинатными гидрогелями.С другой стороны, альгинатные гидрогели также могут быть получены путем снижения pH водных растворов альгината до уровня ниже, чем pK _a остатков уроновой кислоты с контролируемой скоростью [42]. Посредством этой процедуры водородные связи могут быть образованы между молекулами альгината в основном за счет протонированных карбоксильных групп с последующей межмолекулярной стабилизацией альгинатов. Полученный гель часто называют альгинатно-кислотными гелями, и они обеспечивают большую стабильность, чем альгинатные гидрогели, сшитые ионным путем.Более высокая стабильность гелевых структур, демонстрируемая кислыми гелями, объясняется тем фактом, что механизм образования геля кислых гелей не зависит в первую очередь от сшивающих агентов, таких как ионы кальция, которые могут просачиваться в водную среду. Однако альгинатные кислые гели обычно демонстрируют более хрупкие свойства по сравнению с альгинатными гелями, сшитыми ионным путем. Таким образом, можно рассмотреть, какие типы механизмов гелеобразования могут быть полезными для конкретных целей исследования.Стоит отметить, что альгинат является полимером, одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), и это делает его важным биоматериалом для различных применений, таких как тканевая инженерия и регенерация [43,44]. Поскольку его легко перерабатывать в различные формы / структуры, альгинат и его производные широко используются для изготовления основных форм биоматериалов, например, гидрогелей, микросфер, пористых каркасов и нановолокон [38]. Благодаря этим преимуществам альгината, он широко изучался как типичный морской биоматериал для применения в клеточной терапии, и было разработано множество стратегий для максимизации потенциала альгината.Эти стратегии подробно обсуждаются ниже.

2.1.1. Стратегии разработки систем на основе альгинатов для приложений клеточной терапии

Повышение адгезивности клеток с помощью пептидов RGD

Морские биоматериалы были модифицированы для взаимодействия с клеточными рецепторами путем конъюгации с ними соответствующих лигандов. В частности, эта стратегия широко применялась к альгинату, поскольку отрицательно заряженный морской биоматериал в состоянии водного раствора по своей природе не обладает клеточной адгезией.Наиболее часто используемый лиганд для закрепления клеток — это последовательности аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (Arg-Gly-Asp, RGD). Эти аминокислотные последовательности RGD могут быть химически связаны с альгинатом с использованием химии водорастворимых карбодиимидов [45,46,47]. Последовательность RGD является одним из наиболее физиологически распространенных связывающих лигандов, происходящих из белков ЕСМ, включая фибронектин, коллаген и ламинин [48,49]. Клеточные интегрины распознают последовательность RGD и связывают внутриклеточный цитоскелет с ECM.Благодаря этому процессу клетки получают сигналы, необходимые для выживания и пролиферации клеток. Кроме того, последовательность RGD предотвращает апоптоз клеток. Известно, что сигналы, распространяющиеся от адгезии клетка-матрица, активируют различные сигнальные пути, способствующие подавлению апоптоза. Без этих сигналов может происходить anoikis, форма запрограммированной гибели клеток, индуцированная отсоединением зависимых от закрепления клеток от окружающего матрикса [50,51]. Таким образом, наличие таких последовательностей для клеточной адгезии к окружающим матрицам важно для жизнеспособности и активности клеток.Существует множество исследовательских статей о применении стратегии клеточного кросслинкинга в системах доставки клеток или каркасах, состоящих из альгината, для применения в клеточной терапии. Например, Shachar et al. исследовали влияние иммобилизованного пептида RGD в альгинатных каркасах для тканевой инженерии сердца [10]. Они иммобилизовали пептид RGD на альгинате натрия с использованием водной химии карбодиимида с последующим посевом кардиомиоцитов внутри каркасов. Было обнаружено, что присутствие пептидной последовательности RGD способствует регенерации сердечной ткани in vitro и демонстрирует лучшее сохранение сформированной ткани.Кардиомиоциты, засеянные внутри каркасов, были способны реорганизовать свои миофибриллы и реконструировать миофибриллы с типичным пучком миофибрилл с экспрессией соответствующих белков, таких как α-актинин, N-кадгерин и коннксин-43. Кроме того, немиоцитные клетки, посеянные внутри каркасов вместе с кардиомиоцитами, имели растянутую звездообразную морфологию, что подразумевает успешное закрепление и распространение. Напротив, клетки, культивируемые в немодифицированных альгинатных каркасах, имели округлую форму, не имели типичной исчерченности ткани сердечной мышцы и демонстрировали пониженные уровни экспрессии белка, что подтверждает важность существования последовательностей RGD.Совсем недавно об альгинате с привитой пептидной последовательностью RGD и в то же время с модифицированным составом сообщили Sandvig et al. [11]. В исследовании доля M- и G-последовательностей в химической структуре альгината контролировалась, чтобы адаптировать его физические свойства наряду с приданием биоматериала клеточной адгезии с использованием пептида RGD. Они соединили маннуронан, поли-β- (1 → 4) -d-маннуронат, с пептидной последовательностью RGD, используя карбодиимидную химию, и эпимеризовали связанные с пептидом маннуронаны с маннуронановыми эпимеразами C-5, тем самым вводя G- и MG- блоки в их химическую структуру.Таким образом, пептидная последовательность, связанная с M-единицами, не мешает G-блокам, которые в первую очередь вносят вклад в образование гидрогеля. Затем они иммобилизовали обонятельные обволакивающие клетки (OEC), многообещающий тип клеток-кандидатов в опосредованном трансплантатом восстановлении ЦНС, на гидрогели и микрогранулы, состоящие из модифицированного альгината, описанного выше. Как следствие, авторы смогли получить альгинатные гидрогели с различным содержанием G-блоков и в результате с различными физическими свойствами, и подтвердили, что OECs, засеянные внутри альгинатных гелей, образуют большие кластеры округлых клеток с биполярными выступами.Клетки также показали более высокую жизнеспособность, чем клетки, культивируемые в немодифицированных альгинатных гидрогелях. Эти исследования вместе показывают, что введение пептидных последовательностей для клеточной адгезии является многообещающей стратегией для максимального увеличения потенциала альгината в качестве биоматериала для приложений тканевой инженерии.

Контроль структурной однородности путем изменения плотности сшивания

Морские ионные биополимеры, такие как альгинат (анионный) и хитозан (катионный), могут быть физически сшиты с использованием ионных сшивающих агентов.Наиболее заметным преимуществом метода ионного сшивания для получения альгинатных гидрогелей является то, что этот метод сшивания не требует каких-либо органических растворителей, а процесс сшивания выполняется в мягких условиях для захваченных терапевтических клеток [52]. Что касается альгината, наиболее распространенным методом изготовления гидрогелей является сшивание альгината двухвалентными катионами. Двухвалентные катионы взаимодействуют с блоками G-мономеров альгината с образованием ионных мостиков, образуя структуру «яичный ящик» и приводя к гелеобразованию альгината [39].Среди катионов, используемых в качестве ионного сшивающего агента для гелеобразования альгината, такого как ионы кальция, магния и бария, наиболее широко используются ионы кальция. [52,53]. В частности, хлорид кальция наиболее часто используется в качестве ионного сшивающего агента в методах внешнего гелеобразования для получения альгинатных гидрогелей, поскольку процесс сшивания альгината с использованием кальциевой соли очень прост и обеспечивает немедленное и нетоксичное улавливание клеток [6]. На практике этот метод гелеобразования широко используется в тканевой инженерии, например.g., кость, хрящ, межпозвонковый диск и жировая ткань [54,55,56,57]. Тем не менее, из-за слишком высокой скорости реакции сшивания, может возникнуть несбалансированная плотность сшивания через образующиеся альгинатные гидрогели и градиент концентрации полимера в геле [52]. Эта неоднородная плотность сшивания может ограничивать применимость альгинатных гидрогелей для применений в клеточной терапии, поскольку она не обеспечивает структурной однородности гидрогелей, что существенно важно для равномерного распределения клеток и хорошо контролируемых механических свойств.Кроме того, быстрый процесс гелеобразования хлоридом кальция ограничивает применение альгината в инъекционных системах доставки клеток или каркасе. В этом контексте Kuo et al. разработали метод внутреннего гелеобразования, который более точно контролирует процесс гелеобразования, используя соли кальция с низкой растворимостью в воде, такие как карбонат кальция [52]. Карбонат кальция проявляет низкую растворимость в чистой воде при нейтральном pH, но растворим в кислых условиях, что обеспечивает его гомогенное распределение в растворе альгината до гелеобразования [52,58].Затем свободные ионы кальция высвобождаются из солей кальция за счет снижения pH, обычно с использованием глюконо-δ-лактона (GDL), тем самым вызывая постепенное гелеобразование. Действительно, они продемонстрировали, что альгинатные гидрогели с однородной плотностью сшивания и однородными механическими свойствами могут быть изготовлены методом гелеобразования с использованием карбоната кальция. Кроме того, механические свойства альгинатных гидрогелей, полученных с использованием карбоната кальция, были сильнее, чем у гидрогелей, изготовленных только с использованием сульфата кальция, и были более растворимы в водной среде, чем карбонат кальция.Процесс гелеобразования также можно ускорить за счет комбинированного использования карбоната кальция и сульфата кальция, поддерживающего однородную плотность сшивки и механические характеристики. Гистологические эксперименты исследования показали, что клетки были равномерно распределены в альгинатных гидрогелях, приготовленных с использованием карбоната кальция в качестве сшивающего агента. Таким образом, метод ионного сшивания с использованием соли кальция с низкой растворимостью в воде является многообещающей стратегией получения альгинатных гидрогелей с гомогенными свойствами.Хотя метод внутреннего гелеобразования не был широко исследован по сравнению с методом внешнего гелеобразования, в последнее время он все больше изучается для получения систем доставки альгинатных клеток для тканевой инженерии [59, 60, 61].

Регулирование и оптимизация физических свойств и биоразлагаемости

Гидрогели, полученные с альгинатом с высокой молекулярной массой (HMW), демонстрируют более сильные и полезные механические свойства, чем гидрогели, полученные с биоматериалом с низкой молекулярной массой (LMW). Однако растворы полимера HMW могут быть слишком вязкими, и это явление часто проблематично с точки зрения распределения ячеек в растворах [62].Терапевтические клетки, суспендированные в вязких полимерных растворах, также, вероятно, повреждаются высокими усилиями сдвига, возникающими во время процессов смешивания и инъекции, что приводит к снижению терапевтической эффективности клеток [63]. Таким образом, возникла потребность в разделении взаимосвязи между механическими свойствами и вязкостью альгинатных растворов для установления оптимальных физических свойств альгинатных гидрогелей и одновременного включения терапевтических клеток без нежелательного воздействия на них.Чтобы добиться прорыва в решении этой проблемы, Kong et al. Разработали стратегию манипулирования молекулярной массой альгината и его распределением. [23]. Они использовали HMW-альгинат, богатый GG-блоками, и (LMW) альгинат, полученный γ-облучением HMW-полимера. Длина GG-блоков LMW-альгината поддерживалась как длина HMW-альгината, поскольку γ-облучение могло избирательно разрушать MG-блоки и MM-блоки из-за более низкой жесткости блоков, чем у GG-блоков [64 ]. Альгинат HMW способствует в основном увеличению вязкости раствора полимера, поскольку они переплетаются друг с другом, тем самым увеличивая релаксацию.Напротив, низкомолекулярный альгинат может избежать сильных физических взаимодействий, происходящих между молекулами высокомолекулярного альгината, и, соответственно, не приводит к значительному увеличению вязкости раствора. Однако гидрогели, полученные с использованием LMW альгината, могут обладать подходящими механическими свойствами, поскольку LMW альгинат сохраняет способность образовывать механически прочные гидрогели из-за сохраненных GG-блоков после процесса γ-облучения. В соответствии с этими принципами растворы альгината демонстрируют низкую вязкость перед гелеобразованием, что способствует равномерному распределению клеток без значительного физического повреждения клеток, а приготовленные с их помощью гидрогели обладают надлежащими механическими характеристиками.Таким образом, эта стратегия может быть полезна для независимого контроля вязкости растворов альгината и механических свойств его гидрогеля. Что касается биоразлагаемости альгината, он по своей природе не поддается биоразложению у млекопитающих, поскольку у них отсутствуют ферменты, расщепляющие полимерные цепи. Хотя альгинатные гидрогели, сшитые катионами кальция, могут быть растворены путем обмена двухвалентных ионов на одновалентные ионы, присутствующие в окружающей среде, многие коммерчески доступные альгинаты не могут быть полностью удалены из организма.Причина этого в том, что молекулярные размеры альгинатов превышают пределы молекулярной массы почечного клиренса [65]. Таким образом, скорость растворения альгинатных гидрогелей обычно контролируется изменением концентраций и молекулярных масс используемого биоматериала. Однако оба фактора значительно влияют на механические свойства альгинатных гидрогелей, тем самым ограничивая возможность контроля скорости растворения гидрогелей. В качестве стратегии по превращению альгината в биоразлагаемый альгинаты были частично окислены.Периодат натрия обычно используется для окисления альгината. Окисление периодатом натрия расщепляет углерод-углеродную связь цис-диольной группы в остатке мочи, тем самым обеспечивая разложение окисленного альгината [6]. Окисление альгината не ухудшает способность полимера образовывать гели в присутствии двухвалентных катионов [6]. Таким образом, гидрогели, приготовленные из окисленных альгинатов, продемонстрировали свою перспективность в качестве систем доставки клеток и каркасов для различных применений клеточной терапии.Помимо превращения альгината в биоразлагаемый, было предпринято много усилий, чтобы отделить взаимозависимость между биоразлагаемостью и механическими свойствами альгинатных гидрогелей [24,25,26]. Например, Ли и др. были приготовлены гидрогели с поли (альдегидгулуронатом) (ПАГ), состоящим только из остатков β-d-гулуроната, ковалентно сшитых с использованием дигидразида адипиновой кислоты (AAD) [24]. В результате реакции сшивания образуются гидразоновые связи, лабильные к гидролизу. В исследовании, несмотря на LMW PAG (5700 Да) и низкую плотность сшивки, гидрогели показали замедленное разложение, несмотря на их низкую плотность сшивания.Это свойство гидрогелей PAG противоречит общему соотношению между скоростью разложения и плотностью сшивания полимерных гидрогелей. Механизм этого заключался в том, что большое количество односторонних молекул ADD, вызванное высокой концентрацией ADD, позволяло повторно сшивать цепь PAG, когда гидразиновые связи в сшитых полимерах были гидролизованы, тем самым замедляя их разрушение. Эти результаты продемонстрировали возможность того, что альгинатные гидрогели со слабыми механическими свойствами могут обладать медленными скоростями биоразложения.Есть еще одно исследование альгинатных гидрогелей, механические свойства и скорость разложения которых контролируются независимо [25]. В ходе исследования были исследованы альгинатные гидрогели, состоящие из двух частично окисленных альгинатов, имеющих двукратную разницу в молекулярной массе. Альгинат LMW был получен из альгината HMW с использованием метода, который не изменяет длину G-блоков, которые исключительно способствуют гелеобразованию альгината. При приготовлении альгинатных гидрогелей с использованием только HMW альгината, несмотря на то, что гидролитический разрыв цепи произошел, это не привело к полному разделению цепей из-за внутренней химической структуры HMW альгината.Напротив, для гидрогелей, изготовленных как с HMW, так и с LMW альгинатами, полный разрыв цепи был достигнут быстро, потому что присутствие LMW альгината в гидрогелях облегчало разделение полимерных цепей. Кроме того, G-блоки низкомолекулярного альгината, имеющие такую ​​же длину, как и у высокомолекулярного альгината, способствовали сохранению механических свойств гидрогелей. Аналогичным образом, в исследовании in vivo бинарные окисленные гели, введенные мышам, разлагались быстрее, чем гели, приготовленные только с альгинатом с высокой молекулярной массой, что приводило к более успешному образованию костной ткани, которая характеризовалась большим количеством клеток, матрикса и ткани, напоминающей кость. срезы тканей.В другом сообщении предложена другая стратегия использования альгинатов с разной длиной G-блоков в полимерных цепях [26]. Из-за разницы в длине G-блоков возникает несоответствие размеров между ионно сшивающими блоками в полимерных цепях, и это явление способствует процессу обмена между двухвалентными катионами и одновалентными катионами, присутствующими в окружающей среде. Вероятно, это происходит из-за сшивающего соединения, образованного в вышеуказанном геле, которое препятствует участию карбоновых кислот в сшивании, тем самым увеличивая гидрофильность соединения.В этой ситуации одновалентные катионы могут заменять двухвалентные катионы, более легко поддерживая состояние сшивки полимерных цепей, что приводит к диссоциации между G-блоками. Однако значительного уменьшения модуля упругости и коэффициента набухания не наблюдалось, что указывает на несоответствие размеров между G-блоками в полимерных цепях не сильно влияло на механические свойства. Они также показали улучшенное образование хрящевой ткани in vivo с альгинатом, имеющим разную длину G-блоков.Эти исследования вместе показывают, что альгинатные гидрогели, способные независимо контролировать скорость их биоразложения и механические свойства, являются многообещающими для получения лучших результатов клеточной терапии.

2.1.2. Стимулирующие альгинатные системы для применения в клеточной терапии

Стимулирующие полимерные системы указывают на составы на основе полимеров, которые могут реагировать на небольшие изменения в окружающей среде, такие как pH, температура, магнитные или электрические сигналы, тем самым изменяя свои свойства во многих направлениях. .Такая чувствительность к внешним раздражителям заставляет системы на основе полимерных материалов справляться с различными ситуациями, эффективно достигая своей конечной цели. Благодаря своей универсальности полимеры, реагирующие на раздражители, все чаще используются в биомедицине. В частности, многие исследователи в области клеточной терапии использовали биосовместимые материалы и реагирующие на раздражители полимеры в совокупности, поскольку такие подходы обеспечивают выдающуюся производительность без нежелательного воздействия на клетки или хозяина.В этом контексте в качестве биосовместимых и биологически активных материалов активно исследуются морские биоматериалы, такие как альгинат и хитозан, с полимерами, реагирующими на раздражители, для применения в клеточной терапии. В этом разделе обсуждаются некоторые важные примеры систем, реагирующих на стимулы на основе альгината, которые показали успешные результаты в области клеточной терапии.

Термочувствительные альгинатные системы

Термочувствительные полимеры могут быть химически привиты к морским биополимерам или физически смешаны с полимерами, такими как альгинат и хитозан, тем самым придавая термочувствительность морским биополимерам или гидрогелям, состоящим из полимеров [27]. .Существуют два термочувствительных полимера, которые в первую очередь предпочтительны для целей клеточной терапии: поли (N-изопропилакриламид) (PNIPAAm) и Pluronic F127. PNIPAAm — хорошо известный термочувствительный полимер. Гелеобразование этого полимерного раствора происходит при повышении температуры выше нижней критической температуры раствора (НКТР) [66]. Механизм фазового перехода PNIPAAm при изменении температуры основан на термически индуцированном высвобождении молекул воды, связанных с изопропильными боковыми группами структуры полимера выше его НКТР, что приводит к усилению гидрофобных взаимодействий между изопропильными группами [28,67].Pluronic F127 также используется для создания термочувствительных морских биополимерных гидрогелей. Pluronic F127 представляет собой термочувствительный трехблочный сополимер, состоящий из центрального гидрофобного блока полипропиленоксида (PPO), разделенного двумя гидрофильными блоками полиэтиленоксида (PEO). Таким образом, он является гидрофильным и может использоваться в качестве неионного поверхностно-активного вещества. Термочувствительность этого полимера зависит от его молекулярной массы и соотношения между PEO и PPO [68]. Подобно PNIPAAm, температурно-зависимое изменение структуры воды, окружающей блоки PPO, способствует гелеобразованию Pluronic F127 [69,70].Было показано, что плюроник F127 не вызывает раздражения и цитосовместим с различными типами клеток [71,72]. Полимер считается безопасным и одним из очень немногих синтетических полимеров, одобренных FDA для клинического применения [73,74]. Термочувствительные гидрогели можно использовать в качестве инъекционных гидрогелей и платформ для культивирования клеток. Что касается инъекционных гидрогелей, они могут вводиться в организм с минимальной инвазивностью и обладают такими преимуществами, как введение в конкретное место, экономическая эффективность и удобство для пациента [75,76].С другой стороны, при использовании систем культивирования клеток, состоящих из морских биополимеров, модифицированных термочувствительными полимерами, культивируемые клетки можно собирать в неповрежденном состоянии, то есть поддерживая ЕСМ, поскольку обработка трипсином не требуется во время процесса сбора [67 ]. Комбинируя преимущества морских биополимеров, такие как биосовместимость, биоразлагаемость и различные биохимические активности, а также термочувствительные полимеры, можно изготавливать каркасы или системы-переносчики клеток с многообещающими функциями для культивирования и доставки клеток.Например, Абди и др. модифицированный альгинат с Pluronic F127 для инъекций клеток [27]. Они разработали смешанный гидрогель, состоящий из альгината, плюроника F127 и гиалуроновой кислоты, чтобы объединить преимущества природных биоматериалов и термочувствительного полимера. Путем смешивания полимеров одновременно были достигнуты характеристики in situ и естественное микроокружение для поддержания функций клеток. Гидрогели были приготовлены с использованием водных растворителей в мягких температурных условиях, что сводило к минимуму нежелательные воздействия на функции и жизнеспособность заключенных внутри клеток скелетных мышц.Композитные гидрогели проявляли текучесть при нефизиологической температуре (22 ° C) и образовывали гели при физиологической температуре (37 ° C). Когда клетки скелетных мышц культивировали на гидрогелях Pluronic F127, было достигнуто 60% жизнеспособности. Однако в гидрогелях, состоящих из плюроника F127 и альгината, жизнеспособность клеток была увеличена до 80%, вероятно, из-за биохимических сигналов альгината, воздействующих на культивируемые клетки. Кроме того, в случае гидрогелей, приготовленных с Pluronic F127, альгинатом и гиалуроновой кислотой, они продемонстрировали превосходную биосовместимость с почти 100% жизнеспособностью клеток.Причина этого может быть в том, что гиалуроновая кислота, основной компонент ЕСМ, обеспечивает более благоприятную среду для клеток, тем самым поддерживая рост и пролиферацию клеток [77,78]. Когда смесь полимер – клетки вводили мышам BALB / c nu / nu, образование геля четко наблюдалось на коже каждой голой мыши. Кроме того, также наблюдались подобная мышечной ткани масса и некоторые признаки васкуляризации, что указывает на то, что био-функциональность гидрогелей может способствовать клеточной активности.Окрашивание H&E также продемонстрировало адгезию и распространение клеток внутри гидрогелей. Tan et al. также были разработаны термочувствительные инъекционные гидрогели на основе альгината [29]. Они синтезировали термочувствительный гребенчатый полимер с альгинатом в качестве основной цепи и PNIPAAm в качестве боковой группы путем связывания PNIPAAm с концевыми карбоксильными группами с аминированным альгинатом через амидные связи с целью улучшения управляемости скорости разложения и разработки цитосовместимых и инъекционных гидрогелей для клеток. терапевтические приложения.В результате гидрогели, состоящие из аминированного альгинат-g-PNIPAAm (AAlg-g-PNIPAAm), проявляли поведение фазового перехода золь-гель при их реологической оценке. Вязкость гидрогелей снижалась при повышении температуры с 25 до 37 ° C. В частности, от 34 до 36 ° C вязкость гидрогелей резко возрастает, поскольку водный раствор AAlg-g-PNIPAAm превращается в эластичные гидрогели. Гидрогели AAlg-g-PNIPAAm также показали контролируемую скорость разложения. Скорость разложения гидрогелей увеличивается с увеличением доли PNIPAAm, привитой при 37 ° C, что означает, что модификация PNIPAAm может быть использована для улучшения управляемости альгинатных гидрогелей.Что касается распределения клеток и цитосовместимости в гидрогелях AAlg-g-PNIPAAm, костные мезенхимальные стволовые клетки человека (hBMSC) могут быть равномерно распределены, хорошо выжить и пролиферировать в гидрогелях в течение периода культивирования. Более того, термочувствительные альгинатные гидрогели лучше сохраняли жизнеспособность клеток, чем немодифицированный альгинатный гидрогель. Причина этого может заключаться в том, что микроструктура и высокое содержание воды гидрогелей AAlg-g-PNIPAAm были очень похожи на естественный ECM тканей, тем самым поддерживая выживание и пролиферацию клеток.В совокупности исследования показывают, что термочувствительные альгинатные гидрогели обладают большим потенциалом для применения в клеточной терапии.

Магнитно-чувствительные альгинатные системы

Хотя клеточные системы доставки, состоящие из морских биоматериалов, были тщательно изучены, в большинстве случаев высвобождение клеток и доставка из этих систем зависели только от пассивной диффузии клеток, естественной миграции клеток и деградации биоматериалов. Таким образом вряд ли можно достичь высвобождения клеток по требованию или доставки клеток в определенные места.По этой причине все чаще разрабатываются новые стратегии активной доставки клеток. Среди недавно разработанных стратегий эффективного клеточного транспорта большие перспективы показали магнитные клеточные системы доставки.

В течение последних нескольких лет гидрогели, состоящие из частиц альгината и оксида железа, называемые также феррогелями, были исследованы для целей доставки клеток по требованию [30,31]. Феррогели представляют собой гидрогели, реагирующие на магнитное поле, и обычно состоят из полимерной матрицы, включающей частицы оксида железа, обычно магнетита или маггемита.Гидрогели можно деформировать дистанционно под действием неоднородного внешнего магнитного поля, тем самым высвобождая лекарство, биоактивные материалы и клетки неинвазивным образом и точно по времени. Например, Zhao et al. разработали деформируемые феррогели под действием магнитного поля, высвобождая терапевтические клетки, заключенные в гелях [30]. Они изготовили макропористые альгинатные гидрогели, модифицированные RGD, содержащие магнитные частицы. Под действием неоднородного внешнего магнитного поля к феррогелям прикладывается объемная сила, пропорциональная градиенту магнитной силы, что приводит к деформации гелей [79,80].Терапевтические клетки, заключенные в феррогелях, затем высвобождаются из гелей, вероятно, за счет конвекции воды и связанных с ней сил сдвига, возникающих во время процедуры деформации трехмерной структуры гелей. Действительно, они высевали фибробласты кожи человека в феррогели, приготовленные в ходе исследования, и было обнаружено, что магнитная стимуляция успешно способствует высвобождению клеток из гелей как в моделях in vitro, так и in vivo. Кроме того, высвобождение клеток можно контролировать, варьируя плотность RGD на поверхности феррогелей.Более низкие плотности RGD обеспечивают более слабую адгезию клеток к феррогелям, что приводит к более легкому отрыву клеток и приводит к быстрому высвобождению из гелей [81]. Высвобождение клеток также можно контролировать с помощью других параметров, таких как сила приложенного магнитного поля, количество магнитных циклов и частота магнитной стимуляции. Что касается жизнеспособности и функциональности клеток, захваченных и высвобожденных из магнитных гидрогелей, было обнаружено, что более 95% высвобожденных клеток были жизнеспособными и успешно пролиферировали до конфлюэнтного состояния.Таким образом, они продемонстрировали перспективность гидрогелей на основе альгината, включающих магнитные частицы и модифицированных аминокислотными последовательностями клеточной адгезии для обеспечения активной доставки клеток по требованию. В этих условиях сложно добиться деформации гелей, достаточной для высвобождения терапевтических клеток, из-за: (i) уменьшенного количества доступных частиц оксида железа; (ii) пониженный градиент магнитного поля, приложенный к магнитным частицам; и (iii) уменьшенный размер пор, связанный с уменьшением масштаба феррогелей.Таким образом, чтобы значительно деформировать феррогели с меньшими размерами, необходимо увеличить содержание оксида железа в гелях. В этом случае, однако, также увеличивается риск токсичности, создаваемой частицами оксида железа, что нежелательно для целей доставки клеток [82]. Более того, повышенное количество частиц оксида железа может сделать феррогели более жесткими, чем предполагалось, что потенциально может привести к нежелательным изменениям в судьбе клеток [83,84]. Для решения этих проблем Cezar et al. разработали двухфазные феррогели, в которых частицы оксида железа распределены на одной стороне гелей [31].Для приготовления двухфазных феррогелей раствор альгината, содержащий частицы оксида железа, подвергали воздействию вертикального градиента магнитного поля во время процедуры полимеризации. Поскольку полученные двухфазные феррогели обладают макропористой структурой и одновременно достаточным количеством частиц оксида железа, чтобы вызвать деформацию гелей, они могут высвобождать захваченные в них клетки и сохранять мягкость. Фактически, двухфазные феррогели продемонстрировали повышенную деформацию в 2,4 раза по сравнению с монофазными феррогелями, содержащими такое же количество частиц оксида железа.Таким образом, проблемы, возникающие при миниатюризации феррогелей, могут быть решены. С другой стороны, частицы альгинатного гидрогеля Janus были разработаны Zhao et al. для уменьшения нежелательных взаимодействий между терапевтическими клетками и магнитными частицами, инкапсулированными в инкапсулированном состоянии [32]. Частицы Януса — это анизотропные частицы, имеющие различный состав в каждом полушарии [85,86]. Можно придать частицам Януса разнообразные функции, изменив свойство асимметрии. В исследовании клетки и магнитные наночастицы могут быть инкапсулированы в каждом полушарии частиц альгинатных гидрогелей Януса с использованием микрофлюидного метода.Они продемонстрировали возможность дистанционного управления частицами альгината Януса при приложении внешнего магнитного поля с помощью микрочипа с никелевым массивом. Кроме того, частицы альгината Janus показали незначительную токсичность для инкапсулированных клеток с примерно на 10% меньшей жизнеспособностью, чем частицы в обычных листах альгинатного гидрогеля. Таким образом, альгинатные частицы Януса могут быть потенциально использованы в качестве носителя терапевтических клеток для различных применений, таких как адресная доставка на основе магнитного контроля.Таким образом, магниточувствительный альгинат является многообещающим кандидатом для активной и целевой доставки клеток.

2.1.3. Платформы для доставки клеток и тканевой инженерии

Гидрогели

Гидрогели обычно состоят из гидрофильных полимеров с трехмерно сшитыми сетками и высоким содержанием воды [66,78]. Гидрогели широко используются в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, поскольку они обладают различными полезными свойствами для включения терапевтических клеток.Гидрогели обычно можно получить в мягких условиях обработки и создать благоприятную для клеток среду для инкапсулированных клеток. Кроме того, они обладают высоким содержанием воды, мягкими и вязкоупругими свойствами, а также функциональным и структурным сходством с ECM тканей человека [66,87]. В частности, гидрогели, состоящие из природных биополимеров, могут распознаваться биологической средой как биологические макромолекулы [88]. В последние десятилетия альгинат широко использовался для приготовления гидрогелей для применения в клеточной терапии, поскольку биоматериал является биосовместимым и может быть преобразован в гидрогели в процессе мягкого гелеобразования.Тем не менее, обычные альгинатные гидрогели не удовлетворяют всем условиям, необходимым для успешной доставки клеток и регенерации тканей. В этом контексте было разработано множество подходов для максимального увеличения потенциала альгинатных гидрогелей для клеточной терапии. Например, альгинатные гидрогели были модифицированы для инъекций. Как правило, инъецируемые гидрогелевые композиции находятся в состоянии растворов перед введением и имплантацией в организм, в то время как обычные гидрогелевые композиции предварительно желатинизируются перед использованием.Инъекционные гидрогели обладают рядом преимуществ перед подходами на основе готовых гидрогелей для клинического применения. Инъекционные гидрогелевые системы находятся в жидком состоянии перед инъекцией в организм человека, но они становятся гидрогелями в физиологической среде. Таким образом, они могут быть перенесены в организм с помощью минимально инвазивных методов, тем самым повышая комфорт пациента и приводя к более быстрому выздоровлению и снижению затрат на здравоохранение [89]. Помимо этих характеристик, инъекционные гидрогелевые системы обеспечивают несколько дополнительных преимуществ: (i) легкое распределение терапевтических клеток внутри гидрогелей; (ii) простая процедура инъекции в тело; (iii) адаптируемое заполнение дефектов, присутствующих в интересующих тканях; (iv) сайт-специфическая доставка клеток [90,91,92,93].Благодаря этим преимуществам инъекционные гидрогели широко изучались в качестве носителей клеток для тканевой инженерии in vivo, а также рассматривались как одна из самых идеальных систем доставки клеток для клинического применения. На сегодняшний день полимеры природного происхождения широко изучаются в качестве основных материалов. для приготовления инъекционных гидрогелей для применения в клеточной терапии, поскольку их химическая структура аналогична природному ECM, тем самым обеспечивая благоприятную для клеток среду с различными биохимическими сигналами.Понятно, что морские биоматериалы, такие как альгинат, использовались для изготовления инъекционных гидрогелей, поскольку они также обеспечивают биологические сигналы, необходимые для поддержания нормальной клеточной активности. Благодаря этим преимуществам морских биополимеров, они широко изучались в качестве основных материалов для приготовления инъекционных гидрогелей для применения в клеточной терапии. Например, для альгината Kim et al. продемонстрировали инъекционные гидрогели как подходящую систему доставки стволовых клеток, полученных из жировой ткани (hADSC), для создания жировой ткани [94].Исследование было проведено для преодоления препятствия, заключающегося в том, что адипоциты, дифференцированные от hADSC, могут легко распространяться из реципиентного участка, что предотвращает организацию и построение жировой ткани из клеток, если не используется соответствующий клеточный носитель. Для изготовления инъекционных альгинатных гидрогелей для инженерии жировой ткани была использована стратегия внутреннего гелеобразования [52,59]. Они использовали альгинат HMW и альгинат LMW, полученные путем γ-облучения альгината HMW. Затем два типа альгината окисляли обработкой периодатом натрия для придания полисахаридам способности к биоразложению ферментами с последующим конъюгированием пептидных последовательностей для клеточной адгезии с использованием химии карбодиимида.Модифицированные растворы альгината, содержащие предварительно дифференцированные клетки из hADSC, успешно желировались водной суспензией сульфата кальция после инъекции в брюшную полость каждого самца голых мышей. Как следствие, образовавшийся гель не мигрировал от места инъекции и не вторгался в близлежащие ткани. Никаких нежелательных симптомов, таких как воспаление, отек или покраснение, не было. Во время сбора новообразованной ткани наблюдали хорошо организованную жировую ткань с признаками неоваскуляризации, тогда как клетки, введенные без гелевого носителя (контроль), не показали образования ткани при умерщвлении.Кроме того, была обнаружена экспрессия маркеров жировой ткани, таких как гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, и адипонектин. Таким образом, инъекционные альгинатные гидрогели продемонстрировали потенциал для конструирования жировых тканей с их внутренними характеристиками. Bidarra et al. также изучали инъекционные альгинатные гидрогели для доставки эндотелиальных клеток [93]. Они также приготовили альгинатную матрицу для инъекций, используя HMW и LMW альгинат, окисленный периодатом натрия и привитый пептидными последовательностями для клеточной адгезии.Карбонат кальция использовали для гелеобразования модифицированного раствора альгината, и процесс гелеобразования запускался добавлением глюконо-δ-лактона для снижения pH, тем самым вызывая растворение карбоната кальция в исследуемых смоделированных физиологических условиях. Затем эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) культивировали в альгинатных гидрогелях. В результате альгинатные гидрогели продемонстрировали приспособляемость к контуру при отливке в различных формах. Альгинатная матрица, модифицированная последовательностями RGD, также показала лучшую цитосовместимость по сравнению с немодифицированными альгинатными гидрогелями.Кроме того, экспрессия ангиопоэтина-2, семейства ангиогенных модуляторов, почти исключительно продуцируемых эндотелиальными клетками, была обнаружена с помощью анализа RT-qPCR, подтверждающего функциональность культивируемых клеток. Комбинируя эти результаты, было обнаружено, что инъекционный альгинатный гидрогель является многообещающим средством для применения в терапии на основе сосудистых клеток. В отличие от вышеупомянутых инъекционных альгинатных гидрогелей, полученных методами внутреннего гелеобразования с использованием катионов кальция для сшивания альгината, ковалентно сшитых альгинатных гидрогелей с памятью формы также были разработаны в виде инъекционных гидрогелевых систем для клеточной терапии [95,96].Торнтон и др. продемонстрировали потенциал запоминающих форму альгинатных гидрогелей в качестве наполнителя, который можно вводить с минимальной инвазивностью [95]. Гидрогели получали стандартным химическим методом карбодиимида с использованием 1-этил- (диметиламинопропил) карбодиимида, 1-гидроксибензотриазола и бифункционального сшивающего агента AAD [97]. Им можно было придать различные трехмерные формы, такие как диск, прямоугольник и треугольник, и эти формы сохраняли свою геометрию после процесса лиофилизации. Лиофилизированные гидрогели затем физически прессовали до цилиндрической формы и восстанавливали свою первоначальную форму после воздействия воды с PBS, что указывает на их способность к запоминанию формы.Эти характеристики запоминания формы гидрогелей также наблюдались в исследовании in vivo. При извлечении каркасов с запоминанием формы они показали высокую точность в отношении восстановления и сохранения формы in vivo. Напротив, альгинатные имплантаты, сшитые ионами кальция, имели неправильную форму. Что касается инфильтрации клеток в каркас и пролиферации, в инъекционной альгинатной матрице наблюдали зрелую фиброзную ткань, демонстрирующую фибробласты, ECM и ново-сосудистые ткани.Однако миграция клеток наблюдалась только между фрагментами геля альгината кальция, и клетки не проникали в гель. Объединив эти результаты вместе, ковалентно сшитые альгинатные гидрогели, обладающие способностью сохранять форму, имеют потенциал в качестве каркасов гидрогеля для инъекций, поскольку они обеспечивают адекватную трехмерную среду для клеток для проникновения в гели и организации тканей за счет сохранения их формы и пористой структуры, а также их процедура доставки минимально инвазивным способом.Совсем недавно Wang et al. сообщили о передовых альгинатных системах с памятью формы для доставки клеток и факторов роста [96]. В дополнение к способности восстанавливать форму их инъекционные альгинатные каркасы были разработаны для обеспечения биоразлагаемости, которую можно регулировать в соответствии с теми же временными рамками, что и образование новой ткани, поверхностной структуры для поддержки оптимального сродства засеянных клеток и способности высвобождать факторы роста к способствовать регенерации тканей. Для достижения этих характеристик они использовали LMW и HMW альгинат, окисленный для увеличения восприимчивости к гидролизу и модифицированный последовательностями RGD для изготовления инъекционных альгинатных каркасов, а затем включили инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) в каркасы.Альгинатные каркасы после регидратации демонстрировали хорошую способность к запоминанию формы, оцениваемую по коэффициенту набухания и пористости. Более того, было обнаружено, что миобласты мыши, используемые в качестве модельных клеток, располагаются не только на поверхности каркаса, но и внутри каркаса на глубине не менее 100 мкм, а также образуют кластеры клеток, подразумевая, что каркасы обеспечивают надлежащую трехмерную структуру для инфильтрации клеток в матрикс. и распространение. Что касается скорости биоразложения, ее можно контролировать в зависимости от степени окисления альгината.Инкорпорированный IGF-1 также наблюдался устойчивым высвобождением из каркасов в течение приблизительно двух недель. В целом, это исследование продемонстрировало потенциал многофункционального инъекционного каркаса для применения в тканевой инженерии.

Нанофиброзные матрицы

Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса и имеет волокнистую структуру с фибриллами различного диаметра (50–500 нм). Этот компонент ECM влияет на поведение клеток, облегчая прикрепление клеток к матрице волокнистых структур и стимулируя клеточную активность.Клетки, прикрепленные к матрице, могут сохранять свой нормальный фенотип и расти вдоль ориентации волокон. Более того, фибриллы коллагена способствуют сохранению механического сопротивления некоторых тканей, включая кожу. Таким образом, наличие волокнистой структуры внеклеточного матрикса имеет решающее значение для нормальной клеточной активности, такой как сборка и пролиферация клеток, а также для механических свойств тканей [98]. Чтобы моделировать эту волокнистую структуру ECM, в последние годы все чаще разрабатываются нановолоконные каркасы.Было разработано несколько методов изготовления нановолокон, таких как электроспиннинг, самосборка, разделение фаз и матричный синтез. Среди них электроспиннинг считается эффективным и устоявшимся методом, позволяющим производить нановолокна путем электрического заряда суспендированной капли расплава или раствора полимера. С помощью этого метода можно из одного полимера синтетического или природного происхождения изготавливать нановолоконные каркасы, а также композитные полимеры. Морские биоматериалы были изготовлены в виде нановолоконных матриц многими исследователями и исследованы для различных приложений тканевой инженерии, таких как кости, регенерация хрящевой ткани и кожной ткани.Альгинат — один из лучших кандидатов для изготовления нановолоконных матриц для тканевой инженерии. Jeong et al. продемонстрировали перспективность электропряденых альгинатных нановолокон с определенной наноразмерной архитектурой и адгезионными свойствами клеток для приложений регенерации тканей [14]. Они ковалентно связали альгинат с пептидами, имеющими клеточную адгезивную последовательность, поскольку сам альгинат не адгезивен к клеткам. При приготовлении альгинатных нановолокон они смешивали альгинат с PEO, поскольку морской биополимер не может быть электроспряден в одиночку из-за отсутствия переплетений цепей [99].Кожные фибробласты человека, засеянные внутри альгинатного нановолокна, модифицированного последовательностями RGD, демонстрируют распространение на нановолокне, что указывает на то, что клетки могут хорошо прилипать к каркасам, в то время как немногие клетки, связанные с немодифицированными альгинатными нановолокнами, имели круглую форму и не прикреплялись или не распространялись по нановолокну. нановолокна. Кроме того, окрашивание живых / мертвых клеток показало, что клетки, засеянные на модифицированные альгинатные нановолокна, сильно пролиферировали, и почти все клетки были жизнеспособными. Альгинат также был изготовлен для нановолоконных матриц ядро-оболочка для приложений тканевой инженерии Ma et al.[15]. Нановолокна «ядро-оболочка» являются многообещающими с точки зрения их способности включать лекарственные препараты или биоактивные молекулы в волокна [100]. Эту особенность нановолокон ядро-оболочка можно использовать для более предсказуемого управления поведением клеток. Полученные ими ПЭМ-изображения показали, что альгинатные нановолокна были должным образом обернуты материалом оболочки ПЭО. Фибробласты, засеянные внутри нановолокон из альгината ядро-оболочка / ПЭО, прикрепленных к мембранам из нановолокон, имели удлиненную и веретенообразную морфологию. Причина этого результата может быть связана с коротким расстоянием между нановолокнами и высокой поверхностной плотностью нановолокон, которые способствуют адгезии клеток и их распространению по соседним нановолокнам [101].Клетки также могли сохранять свою жизнеспособность в нановолоконных каркасах, что указывает на нецитотоксичность нановолокон ядро-оболочка. Сочетание биосовместимости альгината и физической структуры нановолокон, моделирующей ECM, нановолокна на основе альгината, таким образом, показали большой потенциал для приложений тканевой инженерии.

Многослойные микрокапсулы

Во время процессов культивирования клеток для клеточной терапии терапевтические клетки не часто сохраняют свою жизнеспособность и функцию. Даже если клетки были успешно преобразованы в ткани, ткани могут быть легко повреждены во время процедур трансплантации.Кроме того, это большая проблема — правильно контролировать клетки, имплантированные внутри тела. Таким образом, потребность в эффективных стратегиях преодоления таких препятствий возрастает.

Одним из наиболее многообещающих подходов к решению этих проблем является использование систем доставки клеток или каркасов, состоящих из биополимеров, имеющих сходство с природным ЕСМ. Как описано выше, ЕСМ содержит различные белки, включая белки адгезии и небольшие биоактивные молекулы. ECM также влияет на всю нормальную деятельность клеток, такую ​​как движение, развитие, восстановление и регенерация.Таким образом, существование ECM чрезвычайно важно для клеток.

Хотя многочисленные системы доставки клеток и каркасы продемонстрировали улучшенные результаты, они часто были изготовлены в условиях, недопустимых для терапевтических клеток, и не могли эффективно приспособить клетки во время процедур подготовки или посева клеток. Более того, из-за своей объемной природы обычные системы доставки клеток или каркасы не применялись должным образом в некоторых ситуациях. В частности, при применении систем доставки клеток или каркасов на основе биоматериалов в клинической практике такие дефекты могут быть более проблематичными.

В этом контексте стратегии многослойных микрокапсул вызывают все больший интерес как альтернатива традиционным платформам для доставки клеток и тканевой инженерии. Используя подход с использованием многослойных микрокапсул, терапевтические клетки могут быть безопасно инкапсулированы очень тонкими оболочками на основе биоматериала, имитирующими свойства естественного внеклеточного матрикса, такие как физическая прочность, вязкоупругость, пористость и биоактивность. Кроме того, объем клеток, многослойных с биополимерными оболочками, намного меньше, чем у обычных гидрогелей и систем микрочастиц, включающих клетки, тем самым обеспечивая гладкую диффузионную среду для газов и питательных веществ и большую возможность для применения в клинической практике.Альгинат

был использован в стратегиях создания многослойных микрокапсул из-за его хорошей биосовместимости и способности образовывать многослойные материалы с другими полимерными материалами, проявляющими положительный заряд в водных условиях. Miura et al. сообщили о новом подходе к микрокапсулированию островков с помощью послойной техники с использованием альгината натрия и поли (l-лизина) [18]. Сначала они модифицировали поверхностные свойства каждой клетки, используя конъюгаты поли (этиленгликоль) -фосфолипид (ПЭГ-липид) для закрепления белка.Цепи ПЭГ, ориентированные за пределы клеток, имели положительный заряд. Они добавили раствор альгината натрия, имеющего отрицательный заряд, к суспензии островков, модифицированных ПЭГ-липидами, чтобы сформировать первый слой на поверхности островков. Затем островки подвергали воздействию раствора поли (1-лизина), имеющего положительный заряд, для образования второго слоя. Эти процедуры повторяли для создания мультислоев, состоящих из ионных полимерных материалов на поверхности островков. Было обнаружено, что многослойные микрокапсулы успешно формируются без снижения жизнеспособности клеток и значительного увеличения объема.Тест на стимуляцию глюкозой также подтвердил, что способность островков секретировать инсулин сохранилась после многослойного процесса. Помимо этого исследования, подходы с использованием многослойных микрокапсул с использованием альгината были исследованы для различных применений, таких как устройства для трансплантации, иммунная защита и терапия стволовыми клетками [102,103]. Значение подходов с использованием многослойных микрокапсул для применения в клеточной терапии, вероятно, будет больше в будущем из-за их уникальных преимуществ, таких как обеспечение минимально объемного свойства, гладкой диффузной среды для клеток и способности точно воссоздавать клеточную нишу.

2.2. Хитозан

Хитозан представляет собой сополимер β- (1 → 4) -связанной 2-ацетамидо-2-дезокси-d-глюкопиранозы и 2-амино-2-дезокси-d-глюкопиранозы, как показано на рисунке 3. Морской полисахарид не является широко присутствует в природе, но может быть получен путем деацетилирования встречающегося в природе хитина, экстрагированного из экзоскелета морских организмов, в основном крабов и креветок [104]. Отличительное различие между хитином и хитозаном состоит в том, что последний может образовывать полиэлектролитные комплексы из-за своей высокой катионности (по крайней мере, степень деацетилирования 60%) [105,106,107].Присутствие аминогрупп остатков d-глюкозамина в химической структуре хитозана, образующегося в процессе деацетилирования, делает хитозан положительно заряженным в разбавленных кислых водных растворах (ph208). Это полезное свойство, поскольку механические свойства доставки клеток на основе хитозана системы могут быть улучшены путем комплексообразования полиэлектролитов в терапевтических клетках в мягких условиях.Действительно, хитозан — единственный полисахарид, полученный из природных источников, который может быть положительно заряженным [109].Кроме того, аминогруппы остатков d-глюкозамина хитозана могут реагировать с альдегидными группами других молекул посредством восстановительного аминирования [110]. Эта реакционная способность хитозана позволяет морскому полисахариду образовывать стабильные ковалентные связи с другими молекулами, особенно с сшивающими агентами, такими как генипин и глутаральдегид, используемыми для модификации его физико-химических свойств [111].

Рисунок 3. Химическая структура хитозана. DA указывает степень N-ацетилирования хитозана.

Рисунок 3. Химическая структура хитозана. DA указывает степень N-ацетилирования хитозана.

Хитозан также может быть легко изготовлен с различными микроморфологиями, такими как микросферы, волокна и пленки из его кислых водных растворов [112]. Превосходная способность образовывать пористые структуры путем простого замораживания и лиофилизации его растворов также делает хитозан универсальным биополимером для тканевой инженерии, особенно в ортопедии для хрящевой ткани [113] и регенерации костей [114].Помимо этих преимуществ, хитозан обладает и другими примечательными свойствами, такими как антибактериальная активность [115, 116], мукоадгезивная [117], анальгезирующая [118] и кровоостанавливающая [119]. Скорость биодеградации хитозана также можно просто контролировать, варьируя его молекулярную массу и степень деацетилирования [120,121]. Продуктами распада хитозана являются N-ацетилглюкозамин и глюкозамин, естественные составляющие человеческого тела и, следовательно, биоабсорбируемые [122, 123]. Хитозан показал хорошую биосовместимость [124] и был одобрен FDA для использования в перевязочных материалах для ран [125].Все эти явные преимущества в совокупности указывают на то, что хитозан является одним из самых замечательных кандидатов для применения в клеточной терапии. Однако, как и в случае с другими биоматериалами, в большинстве случаев требования для применения в клеточной терапии не могут быть выполнены одним хитозаном. Следовательно, необходимы многогранные стратегии, чтобы максимально использовать хитозан как ключевой биоматериал для достижения удовлетворительных результатов клеточной терапии.

2.2.1. Стратегии разработки систем на основе хитозана для приложений клеточной терапии

Повышение адгезивности клеток с помощью пептидов RGD

Хотя хитозан обладает хорошей биосовместимостью и биоразлагаемостью, ему также не хватает биоактивных сигналов для прикрепления, роста и дифференциации клеток.Чтобы преодолеть этот недостаток, хитозан необходимо конъюгировать с пептидами, связывающимися с клеткой. По этой причине хитозан также был конъюгирован с аминокислотными последовательностями RGD. Цай и др. исследовали RGD-модифицированные трехмерные сшитые хитозановые каркасы для инженерии костной ткани [12]. Чтобы изготовить хитозановые каркасы, в которых пептиды равномерно распределены, они использовали смеси немодифицированного хитозана и двух производных хитозана: одно содержит фотореактивные азидогруппы для УФ-сшивания, а другое конъюгировано с пептидами RGD.Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), культивируемые в полученных RGD-конъюгированных хитозановых каркасах, имели удлиненную и распределенную морфологию, указывающую на то, что они прикреплялись и хорошо распределялись в каркасах, в то время как наблюдали прикрепление и распространение нескольких клеток на немодифицированных хитозановых каркасах. Кроме того, МСК, культивированные в RGD-конъюгированных хитозановых каркасах, показали более высокую скорость пролиферации и более улучшенную остеогенную дифференцировку, что подтверждается несколькими ранними и поздними остеогенными маркерами, такими как щелочная фосфатаза [126], Runx2 [127] и остеокальцин [128]. чем те, что культивируются в контрольных каркасах.Хитозан, модифицированный RGD, также использовался для применения в инженерии костной ткани [13]. Каркасы для инженерии костной ткани были приготовлены с использованием хитозана и гидроксиапатита (ГА), природной минеральной формы, предпочтительной для стимуляции прорастания костной ткани. Затем пептиды RGD физически адсорбировались на каркасах путем погружения каркасов в растворы RGD. Было обнаружено, что стромальные клетки костного мозга хорошо прилипают к каркасам хитозан / НА, модифицированных RGD, демонстрируя скорость клеточной адгезии около 80% в течение 4 часов.Этот результат указывает на то, что модификация RGD увеличила сродство клеток к каркасам. Анализ живых / мертвых клеток показал, что клетки были полностью жизнеспособными и равномерно распределены на каркасах, что указывает на высокую цитосовместимость каркасов, модифицированных RGD. Клетки также имели уплощенную многоугольную форму и псевдоподии и образовывали ECM. Повышенные уровни активности щелочной фосфатазы были подтверждены на клетках на каркасах хитозан / НА, модифицированных RGD, что означает, что клетки дифференцировались по остеогенному фенотипу.На моделях кроликов с дефектами лучевой кости образование костной ткани после восьми недель имплантации каркасов, модифицированных RGD, наблюдали с помощью рентгеновской томографии. Эти исследования вместе показывают, что модификация RGD усиливает взаимодействия клетка-каркас и способствует адгезии клеток к каркасу, а также пролиферации и дифференцировке.

Оптимизация механических характеристик

Хотя хитозан является потенциальным биоматериалом для различных применений клеточной терапии из-за его преимуществ, таких как биосовместимость, биоразлагаемость, биологическая активность и легкость манипуляции с различными морфологиями, одним из основных недостатков систем доставки клеток на основе хитозана или каркасы — это их слабые механические свойства [129].Химические модификации привлекли большое внимание как инструмент для улучшения механических свойств систем на основе хитозана для клеточной терапии. В общем, подходы к химической модификации осуществляются с использованием способов хитозана с многочисленными боковыми аминогруппами и гидроксильными группами. Изменяя экспериментальные настройки, можно надлежащим образом регулировать механические свойства систем на основе хитозана. Однако сообщалось, что некоторые реагенты, используемые для химических модификаций хитозана, проявляют цитотоксичность [130], и результаты иногда не были успешными [131].Таким образом, потребовались альтернативные стратегии усиления механических свойств систем на основе хитозана. Недавно были исследованы хитозановые волокна для улучшения механических свойств систем на основе хитозана для применения в клеточной терапии. Хитозановые волокна с регулярным молекулярным расположением и высокой степенью ориентации обычно обладают превосходной прочностью на разрыв и коэффициентом удлинения при разрушении [132]. Таким образом, механические свойства систем доставки клеток или каркасов могут быть усилены включением хитозановых волокон.Например, механические свойства трубчатых хитозановых каркасов для инженерии тканей кишечника были улучшены за счет выравнивания по окружности хитозановых волокон вокруг каркасов Zakhem et al. [133]. Они изготовили трубчатые хитозановые каркасы с внутренними и / или внешними волокнами, используя технику форм. В результате хитозановые каркасы, включающие хитозановые волокна, проявляли улучшенные механические свойства, такие как прочность на разрыв, модуль Юнга, удлинение при разрыве и прочность на разрыв.Каждое значение параметров механических свойств было значительно ниже в случае трубчатых хитозановых каркасов без присутствующих хитозановых волокон по сравнению с таковыми из нативного кишечника. Напротив, хитозановые каркасы, на которых волокна хитозана были выровнены по окружности, показали механическую прочность, аналогичную нативному кишечнику. Гладкомышечные клетки, выровненные вдоль хитозановых каркасов с хитозановыми волокнами, успешно сформировали гладкие мышечные листы. Актин α-гладких мышц также был положительно окрашен из клеток, что указывает на сохранение фенотипа гладких мышц.В другом исследовании переменные, влияющие на механические свойства хитозановых волокон, были исследованы Albanna et al. [134]. Они охарактеризовали влияние концентрации уксусной кислоты в растворе хитозана, pH коагуляционной ванны и температуры отжига на механические свойства и кристалличность полученных волокон хитозана. Когда для приготовления растворов хитозана использовали 2% уксусную кислоту, диаметр получаемых хитозановых волокон уменьшался, а механические свойства значительно улучшались.Причина этого может быть связана с полным растворением порошков хитозана в растворе, поскольку полное растворение приводит к образованию волокон хитозана с компактной и преобладающей кристаллической структурой. Однако избыточное количество уксусной кислоты вызывает усиление водородных связей и, как следствие, рыхлую и вытянутую структуру волокон хитозана. Повышение pH коагуляционной ванны также привело к компактной и кристаллической структуре хитозановых волокон, что усилило их механические свойства.При регулировании температуры отжига примерно до температуры стеклования хитозана механическая прочность полученных хитозановых волокон повышалась, поскольку кристаллизация хитозана происходила преимущественно в температурных условиях. Исследование прикрепления и жизнеспособности клеток продемонстрировало, что обработка для увеличения механической прочности хитозановых волоконных каркасов не влияет на их свойства совместимости с клетками. Таким образом, хитозановые волокна, полученные в соответствующих условиях, могут быть использованы для усиления присущих слабым механическим свойствам систем на основе хитозана для применений в клеточной терапии.

Контроль пористых структур

Наличие пористых свойств в биоразлагаемых системах доставки клеток или каркасах чрезвычайно важно, поскольку они облегчают диффузию питательных веществ и газов внутри и снаружи клеток, включенных в матрицу [135], и влияют на прорастание клеток и эффективность посева в биоразлагаемый субстрат [136]. По этой причине необходимы эффективные стратегии создания пористой структуры в системах доставки клеток или каркасах на основе хитозана. В случае хитозана сублимационная сушка была использована как один из самых простых и эффективных методов для получения таких пористых систем на основе хитозана [137].Во время процедуры сублимационной сушки в растворе хитозана происходит разделение фаз из-за разницы между растворимостью хитозана в замороженной и незамороженной области. После полной сублимации растворителя поры образуются в пространстве, в котором растворитель существовал до стадии сублимации. Например, Fang et al. приготовили пористые микросферы на основе хитозана для регенерации хряща методом сублимационной сушки [19]. Пористость и средний размер пор могут быть увеличены за счет увеличения температуры замерзания.Это может быть связано с тем, что скорость массопереноса различна при каждой температуре, и явление разделения фаз происходило по-разному [138]. При -20 ° C микросферы хитозана показали средний диаметр пор около 47 мкм, что находится в оптимальном диапазоне диаметров пор для посева клеток и роста в микроносителях [139, 140]. В исследовании in vitro было обнаружено, что хондроциты мышей засеваются и хорошо инфильтрируются внутри микросфер хитозана. Клетки могли сохранять свою жизнеспособность без значительного снижения и успешно пролиферировать, показывая значительно увеличенное количество клеток через семь и 14 дней после посева.Таким образом, сублимационная сушка может быть с успехом использована в качестве метода создания пористой структуры для приложений клеточной терапии. Однако ограничительная пористая микроструктура, созданная с помощью методов сублимационной сушки, иногда не идеальна для приложений клеточной терапии, таких как тканевая инженерия [141, 142, 143]. Помимо метода сублимационной сушки, хотя были разработаны различные методы приготовления пористых биоразлагаемых систем для применения в клеточной терапии, такие как газообразование [144], разделение фаз [145] и 3D-печать [146], они не подходят для применяется к кислым растворам хитозана [20].В качестве пригодных альтернатив для создания пористой структуры в системах на основе хитозана для применений в клеточной терапии широко используются методы литья в растворитель и выщелачивания частиц. При обычном литье из растворителя и некоторых процессах выщелачивания полимер растворяют в органическом растворителе и затем к раствору добавляют частицы, обычно соли, определенных размеров и форм. Раствор, содержащий соли, обычно помещают в форму для придания окончательной формы. После испарения растворителя соли внутри затвердевшей полимерной матрицы растворяются, оставляя после себя пористую структуру.Основным преимуществом этого метода является то, что пористость и размер пор можно легко контролировать с помощью соотношения полимер / соль и размера частиц соли [147]. Однако, если размеры и форма частиц, выщелачиваемых из биоразлагаемых матриц, неоднородны, трудно получить предсказуемые размеры и форму пор, что нежелательно для воспроизводимых результатов посева клеток, инфильтрации и регенерации тканей. соль с низкой степенью ионизации в разбавленном кислотном растворе может использоваться только для создания пористой структуры, поскольку растворителем для растворения полисахарида является вода.Например, есть исследование, в котором ацетат натрия с относительно низким pK _a (уксусная кислота = 4,76) использовался в качестве порогена для изготовления пористых хитозановых каркасов [20]. Изготовленные хитозановые каркасы показали однородную структуру пор и хорошую взаимосвязь до 90%. Пористость и взаимосвязь можно регулировать, варьируя соотношение добавляемого ацетата натрия. Наблюдалась адгезия клеток на пористых хитозановых каркасах, и клетки могли успешно пролиферировать. Кроме того, хитозановые каркасы с пористой структурой показали хорошие механические свойства с точки зрения механической прочности, удлинения при разрыве и эластичности.

Таким образом, метод литья из растворителя и выщелачивания частиц может применяться для создания пористой структуры в системах на основе хитозана. Тем не менее, этот подход также имеет недостатки, такие как длительность процедуры и ограниченная возможность управления размером и формой пор. Следовательно, все еще существует необходимость в разработке стратегий изготовления пористых хитозановых систем с более простыми процедурами и контролируемыми пористыми свойствами.

2.2.2. Стимулирующие хитозановые системы для применения в клеточной терапии

Термочувствительные хитозановые системы

Как описано в разделе 2.1.2, системы на основе термочувствительных биоматериалов успешно используются для изготовления инъекционных гидрогелей и платформ для культивирования клеток. Благодаря преимуществам хитозана в качестве биоматериала для применения в клеточной терапии, морской биоматериал был использован для приготовления термочувствительных систем. Wang et al. разработали термочувствительные гидрогели с использованием сополимеризованных полимеров, состоящих из дериватизированного акриловой кислоты хитозана (CSA) и NIPAAm (поли (NIPAAm-co-CSA) [67]). Гидрогели, состоящие из поли (NIPAAm-co-CSA), были разработаны для добиться улучшенного прикрепления и роста клеток и гораздо более быстрого отрыва клеточного слоя для легкого сбора культивируемых клеток.В результате степень клеточной адгезии и распространения культивируемых модельных клеток была выше на сополимеризованных гидрогелях, чем на гидрогелях, полученных из гидрогелей PNIPAAm без хитозана. Гидрогели поли (NIPAAm-co-CSA) показали, что гораздо больше клеток, прикрепленных к субстрату, оценивается гемоцитометром, наблюдением SEM и анализом МТТ. Кроме того, при повышении температуры с 20 ° C до 37 ° C культивируемые клетки быстрее отделялись от гидрогелей поли (NIPAAm-co-CSA), чем гидрогели PNIPAAm, поскольку гидрофильные поверхностные свойства CSA ослабляли клеточную адгезию к субстрату.Более того, даже будучи отделенными от гидрогелей, клетки оставались живыми и демонстрировали свойства, аналогичные состоянию прикрепления. Термочувствительный хитозан также можно использовать для изготовления инъекционных систем доставки клеток [28]. Chen et al. подготовлены гидрогели хитозан-трансплантат-PNIPAAm для применения при образовании хрящевой ткани. Они синтезировали сополимер путем конъюгирования группы карбоновой кислоты PNIPAAm с аминогруппой хитозана и получили термочувствительные гидрогели с гребенчатой ​​структурой с использованием сополимера.Полученные гидрогели имели температуру гелеобразования и температуру плавления геля 29,8 ° C и 28,3 ° C соответственно. Гелеобразование завершилось за 3 мин. Такая быстрая скорость образования геля может быть полезной для равномерного распределения клеток в гидрогелях. Кроме того, это свойство желательно для инъекций гидрогеля. Они высевали суставные хондроциты кролика в гидрогели и оценили их биосовместимость и пролиферацию клеток с использованием набора для анализа живых / мертвых клеток и анализа MTS.В результате не наблюдали значительной разницы в выживаемости клеток между гидрогелями хитозан-трансплантат-PNIPAAm и контрольными полистирольными чашками для культивирования тканей. Причиной этого результата может быть структурное сходство хитозана с гликозаминогликаном, основным компонентом ECM хондроцитов, обеспечивающим соответствующие биологические сигналы клеткам, засеянным внутри гидрогелей. При наблюдении с помощью SEM, хондроциты были встроены в секретируемый ECM и проявляли свой фенотип округлой формы клеток, что указывает на то, что они могут поддерживать свои функции и состояние дифференцировки.В совокупности термочувствительные системы на основе хитозана полезны для культивирования клеток и быстрого сбора тканей, не оказывая нежелательного воздействия на созданные ткани, и могут использоваться в качестве потенциального инъекционного гидрогеля для применений в клеточной терапии.

Электроактивные системы хитозана

Электроактивные биоматериалы — один из недавно разработанных биоматериалов, реагирующих на стимулы, позволяющих электрическую или электрохимическую стимуляцию клеток, включенных в системы на основе биоматериалов [148, 149].Среди множества электроактивных биоматериалов проводящие полимеры продемонстрировали превосходный контроль электрического стимула, хорошие электрические и оптические свойства, высокое соотношение проводимость / вес, биосовместимость и биоразлагаемость [148, 150, 151]. Кроме того, химические, электрические и физические характеристики проводящих полимеров можно регулировать в соответствии с требованиями конкретных приложений [148,152,153]. Учитывая эти новые свойства проводящих полимеров, у них есть безграничные возможности революционизировать область клеточной терапии.Например, проводящие полимеры могут быть использованы для управления функциями клеток путем электрической стимуляции клеток, особенно электрически возбудимых клеток, включая нейрональные или мышечные клетки [154,155]. Более того, бесчисленное множество исследований показали, что рост нейритов и распространение клеток может быть значительно усилено за счет электрической стимуляции клеток с помощью проводящих полимеров [154,156]. В качестве проводящего полимера для таких применений полипиррол (PPy) недавно был исследован для применения в клеточной терапии из-за их хорошей стабильности и высокой проводимости [157].Однако сами по себе проводящие полимеры не могут удовлетворять требованиям для приложений клеточной терапии, таких как микросреда, поддерживающая адгезию, распространение, пролиферацию и дифференциацию клеток. В этом контексте хитозан и проводящие полимеры были совместно использованы для приготовления электрически чувствительных систем на основе биоматериалов в области клеточной терапии. Например, хитозан / полипропиленовые мембраны были исследованы в качестве системы культивирования клеток Шванна Хуангом и др. [158]. Они приготовили хитозан / полипропиленовые мембраны путем физического смешивания хитозана (97.5%) и PPy (2,5%) в разбавленном кислотном растворе с последующей сушкой смеси. После культивирования шванновских клеток на мембране, подготовленной до 95% слияния, они применили латеральный постоянный градиент потенциала (100 мВ / мм, 4 ч) к шванновским клеткам через хитозановую / полипропиленовую мембрану с использованием специально созданной системы для культивирования электрических клеток. В результате мембрана хитозан / PPy способствовала адгезии, распространению и пролиферации клеток с электростимуляцией или без нее. При электрическом стимулировании клеток их жизнеспособность значительно повышалась, что было подтверждено наблюдением SEM, окрашиванием DAPI и анализом МТТ.Кроме того, электрическая стимуляция через мембрану увеличивала экспрессию и секрецию фактора роста нервов и нейротрофического фактора мозга, оцениваемого с помощью анализа RT-PCR и вестерн-блоттинга, по сравнению с контрольными клетками без электрической стимуляции. Пентамер (AP), сшивающий хитозан (AP-c-CS), был использован для изготовления электрически чувствительных каркасов для регенерации нервной ткани [159]. Пентамер анилина (ПП) был использован в качестве проводящего материала из-за его хорошей электроактивности и способности к биоразложению [160].AP-c-CS был синтезирован методом конденсационной полимеризации. Каркасы, приготовленные с AP-c-CS, и клетки нейрональной феохромоцитомы крысы PC-12 засевали в каркасы. Клетки, засеянные в каркасы AP-c-CS, показали лучшую скорость клеточной адгезии и пролиферации, чем чистые каркасы AP или CS, из-за комбинированного эффекта цитосовместимости хитозана и электрически активного AP. Каркасы AP-c-CS также способствовали дифференцировке нейронов в значительной степени за счет их электрической стимуляции.В процессе дифференцировки морфология клеток PC-12 постепенно изменялась от округлой формы до нейронального фенотипа. Однако в случае каркасов, изготовленных из чистого CS, немногие клетки продуцировали нейриты, что указывает на то, что один природный биоматериал не может способствовать дифференцировке клеток. Таким образом, комбинаторное использование преимуществ морских биоматериалов, таких как хитозан и проводящие полимеры, является многообещающим для приложений клеточной терапии, включая инженерию нервных тканей.

2.2.3. Платформы для доставки клеток и тканевой инженерии

Гидрогели

Как описано в разделе 2.1.3, гидрогели являются одними из наиболее подходящих составов для применения в клеточной терапии из-за их уникальных преимуществ. Подобно альгинату, хитозан также широко исследовался в качестве основного материала для приготовления гидрогелей для доставки клеток и тканевой инженерии. Гидрогели хитозана продемонстрировали выдающуюся биосовместимость, ферментно-опосредованную биоразлагаемость и нетоксичность даже в отношении продуктов их разложения.

Хотя хитозановые гидрогели обладают такими преимуществами, они не приводят к успешным результатам из-за их недостатков, таких как отсутствие контроля над временем его гелеобразования, недостаточная биологическая активность, неспособность регулировать их механические свойства и растворимость тканей при физиологическом pH в определенных ситуациях. . Многие исследователи разработали множество стратегий для решения таких проблем.

Например, в случае хитозановых гидрогелей, изготовленных методами химического сшивания, цитотоксичность сшивающих агентов может быть проблематичной.Таким образом, терапевтические клетки необходимо включить в гидрогели хитозана после процесса приготовления. Однако в этом случае силы сдвига для распределения клеток внутри гидрогелей могут снизить жизнеспособность и функцию клеток. Отсутствие способности заполнять пустоты, образовавшиеся в результате травмы, также является недостатком химически сшитых гидрогелей хитозана. В этом контексте были разработаны фото-сшиваемые гидрогели на основе хитозана. Например, Valmikinathan et al. синтезировал фото- сшиваемый хитозан, модифицированный метакрилатом, для инженерии нервной ткани [161].Гидрогели из метакрилата хитозана готовили при УФ-облучении в течение 3–5 мин. Гидрогели хитозана образовывались через 3 мин после УФ-излучения, демонстрируя способность к гелеобразованию in situ. Гидрогели также показали контролируемые реологические свойства при различной концентрации хитозана, демонстрируя образование плотной сети из-за высокой доступности метакрилатных групп в хитозане. Когда человеческие МСК инкубировали в хитозановых гидрогелях, не было обнаружено значительных изменений жизнеспособности и морфологии клеток, а количество клеток было таким же, как у клеток, инкубированных в лунках планшета для тканевых культур, исследованных в качестве контроля.Кроме того, клетки, культивированные в фото-сшитых гидрогелях хитозана, показали значительно усиленный рост нейритов, в то время как гидрогель на основе агарозы не приводил к росту нейронов в той же степени, что и гидрогель хитозана. факторы или природные полимеры, обладающие биоактивными свойствами, были применены к гидрогелям хитозана. Эти материалы могут стимулировать различные клеточные активности, включая рост, пролиферацию, функцию и дифференцировку клеток.Например, коллаген и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) были применены к гидрогелям хитозана для облегчения инженерии хрящевой ткани за счет усиления хондрогенной дифференцировки Kim et al. [162,163,164]. В ходе исследования хитозан и коллаген, конъюгированные с TGF-β, были преобразованы в гидрогели с использованием метода фотополимеризации. Из-за присутствия TGF-β и коллагена в гидрогелях хитозана МСК, полученные из синовиальной оболочки человека, размножались лучше, чем гидрогели без биоактивных материалов.Хондрогенную дифференцировку клеток in vitro также исследовали с помощью гистологии (окрашивание H & E и сафранин-O) и иммуногистохимии (окрашивание коллагена). Инкапсулированные клетки имеют округлую форму с окружающими лакунами, что указывает на хондрогенную дифференцировку. Кроме того, повышенное накопление гликозаминогликана и экспрессия коллагена были обнаружены в клетках, культивированных на гидрогелях на основе хитозана, пропитанных коллагеном, конъюгированных с TGF-β. Клетки также показали повышенный уровень экспрессии маркеров хондрогенных генов, таких как Sox 9, аггрекан и коллаген типа II.Помимо этих подходов, существует множество возможных стратегий для максимизации потенциала хитозановых гидрогелей для применения в клеточной терапии, таких как модификация пептидов [165] и применение термочувствительных полимеров для введения инъекционных гидрогелей [166]. Полезность хитозановых гидрогелей в качестве систем доставки клеток и каркасов может быть увеличена с помощью новых стратегий, которые будут разработаны в будущем.

Нановолокнистые матрицы

Наряду с альгинатом хитозан является одним из наиболее широко исследованных морских биоматериалов для изготовления нановолоконных матриц для приложений клеточной терапии.Хотя хитозан не подходит для изготовления нановолокон с использованием методов электроспиннинга из-за вязкой природы его раствора и сильных водородных связей, образующихся внутри полимерной сети, препятствующих перемещению полимерных цепей под воздействием электрического поля [167,168], эта проблема была решена путем смешивания хитозан с синтетическими полимерами, включая поливиниловый спирт (ПВС) и ПЭО [169]. Нановолокна на основе хитозана показали замечательные результаты в различных приложениях тканевой инженерии благодаря объединенным преимуществам хитозана и нановолокон, как упомянуто выше.Например, нановолокнистые матрицы на основе хитозана были исследованы для регенерации кожной ткани. Хитозан является многообещающим биоматериалом для регенерации тканей кожи, поскольку он активирует пролиферацию фибробластов и способствует отложению коллагена, секретируя N-ацетил-β-глюкозамин [170, 171]. Кроме того, полисахарид стимулирует процесс заживления ран, индуцируя высокий уровень гиалуроновой кислоты в месте расположения раны [172]. Нанофиброзные матрицы также являются отличным кандидатом в качестве перевязочного материала для ран, поскольку их пористая структура полезна для посева клеток и диффузии питательных веществ, кислорода и отходов [173], и они могут абсорбировать экссудат раны, предотвращая чрезмерное обезвоживание и бактериальную инфекцию раны. [173,174].Кроме того, известно, что нановолокнистые матрицы, приготовленные из биоматериалов, активируют фибробласты, выделяющие основные составляющие внеклеточного матрикса, для заживления поврежденной ткани [175]. В исследовании были изготовлены нановолоконные хитозановые матрицы с использованием техники электроспиннинга [16]. Их влияние на морфологию, пролиферацию и дифференцировку клеток, связанных с тканью кожи (фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток), сравнивали с пленками и губками, приготовленными с хитозаном, с последующим анализом заживления ран на мышиной модели.При наблюдении за клетками, засеянными после периода культивирования, губки показали несколько недостатков, таких как плохое прикрепление клеток, невозможность получения монослоев и низкое количество засеянных клеток. Что касается хитозановых пленок, то инкубированные клетки не смогли полностью разрастись и перестали быстро размножаться. Однако клетки, посеянные на нановолоконных матрицах хитозана из электроспрядника, полностью распределяются по субстратам и хорошо размножаются со временем, тем самым формируя клеточные кластеры из плоских клеток, плотно соединенных друг с другом.Кроме того, кератиноциты, засеянные на каркасы, успешно дифференцировались, показывая экспрессию маркеров дифференцировки, таких как кератин 14 и инволюкрин. Нановолоконные матрицы хитозана также продемонстрировали свою превосходную биосовместимость, демонстрируя восстановление полнослойных ран in vivo. Нановолокнистые матрицы хитозана также привлекли огромное внимание в области инженерии костной ткани. Сам по себе хитозан перспективен для инженерии костной ткани, в основном из-за его биосовместимости и структурного сходства с костным внеклеточным матриксом [176, 177].Нановолоконная архитектура также может быть полезной для инженерии костной ткани, поскольку она способствует пролиферации, дифференцировке и минерализации клеток-остеопрогениторов [178]. Включение биоактивных веществ, способствующих прорастанию костной ткани, в нановолокна хитозана может максимально увеличить потенциал способности нановолоконных матриц регенерировать костные ткани [179,180]. Frohbergh et al. исследовали этот подход для инженерии костной ткани [17]. Они приготовили HA-содержащие нановолокнистые матрицы хитозана, сшитые генипином.Нановолокнистые матрицы хитозана, содержащие ГК, получали путем электроспиннинга раствора хитозана, в котором наночастицы ГК были предварительно диспергированы. Сшивание хитозана с использованием генипина сделало полученные нановолокнистые матрицы хитозана более похожими на естественные кости с точки зрения механических свойств. Следует отметить, что нановолоконные матрицы хитозана были изготовлены без использования волокнообразующего агента, такого как ПЭО. Контролируя различные условия, такие как влажность, температура окружающей среды, а также концентрация и степень деацетилирования хитозана, они могли производить нановолокнистые матрицы хитозана, используя только хитозан и ГК в качестве компонентов волокон.Через 7 дней после посева остеобласты показали четко определенные филоподии, отходящие от ламеллиподий, что указывает на то, что клетки могут взаимодействовать с нановолоконными матрицами хитозана. Кроме того, клетки образовывали сливающиеся монослои и шероховатую текстуру на нановолоконном каркасе, что указывает на продолжающуюся пролиферацию и повышенное созревание остеобластов. Клетки также продемонстрировали высокую экспрессию щелочной фосфатазы, индикатора остеогенной дифференцировки [181]. Благодаря многообещающим характеристикам нановолоконных матриц хитозана, они также были использованы для других целей тканевой инженерии, включая регенерацию сердечной ткани [182].В будущем будет разработано гораздо больше стратегий для повышения полезности нановолоконных матриц хитозана для приложений тканевой инженерии, и, как таковые, диапазон их применения будет расширяться.

Многослойные микрокапсулы

Как было сказано в разделе 2.1.3, многослойные микрокапсулы, состоящие из ионных полимеров, являются очень многообещающими платформами для различных приложений клеточной терапии из-за их способности создавать микроокружения, имитирующие ECM, для клеток и их минимальный объемный характер.Эта стратегия также успешно применялась к клеточной терапии, высвобождающей биологические молекулы в течение длительного времени [183], и для предотвращения иммунного отторжения хозяев против терапевтических клеток, полученных из аллогенных источников [21]. Для полного использования подхода с использованием многослойных микрокапсул критически важным является выбор биосовместимых полимеров с соответствующими ионными свойствами. Полимеры, используемые для оболочки терапевтических клеток, должны быть цитосовместимыми, биоразлагаемыми и способными обрабатываться в мягких условиях.Кроме того, полимеры не должны вызывать потерю функции клеток и в некоторых случаях не должны стимулировать клетки к слишком раннему высвобождению их биологических молекул. С этой точки зрения хитозан считается привлекательным биоматериалом для использования в подходе с использованием многослойных микрокапсул. Хотя доступно лишь несколько отчетов об исследованиях стратегии многослойных микрокапсул, они показали многообещающие результаты для применения в клеточной терапии. Например, Zhi et al. использовали островки, покрытые многослойной оболочкой из хитозана и альгината натрия [22].Сначала они добавили раствор хитозана к клеткам, чтобы инициировать рост пленки на поверхности клеток, после чего последовала адсорбция альгината натрия на поверхности тонкой пленки хитозана таким же образом с образованием единого бислоя хитозан / альгинат. Этот процесс повторяли до тех пор, пока не образовался желаемый многослойный слой (хитозан / альгинат) _n хитозана, где «n» представляет количество бислоев. Они контролировали многослойное осаждение на поверхности ячеек, измеряя дзета-потенциал, и средняя толщина каждого высушенного слоя была определена равной примерно 1.5 нм. Клетки, покрытые морскими биоматериалами, не демонстрировали никаких признаков апоптоза, что позволяет предположить, что клетки были здоровыми и не затронуты многослойностью. Способность островков секретировать инсулин также не была нарушена. Этот результат свидетельствует о том, что технология покрытия клеток на основе морского биоматериала имеет потенциал для применения в терапии клеток с высвобождением биологических молекул. В другом исследовании живые тромбоциты были инкапсулированы тонким многослойным слоем, состоящим из хитозана и поли-1-глутаминовой кислоты [21].Тромбоциты можно эффективно использовать для восстановления кровеносных сосудов, а также для образования, ретракции и растворения сгустков из-за биологического воздействия, вызванного высвобождением их содержимого. Однако клетки могут слишком быстро потерять свои биологические функции при попадании в организм. В этом контексте авторы применили стратегию многослойных микрокапсул в терапии клеток на основе тромбоцитов, поскольку инкапсуляция клеток может привести к замедленному высвобождению биологических молекул, таких как факторы роста, и может снизить иммунное отторжение, генерируемое хозяевами.Инкапсуляция пластинок осуществлялась путем самосборки полиэлектролитов с использованием послойной технологии. В результате содержимое и структура клеток сохранялись до и после многослойного процесса. Напротив, клетки, многослойные с ионными полимерами, отличными от хитозана и поли-1-глутаминовой кислоты, были активированы во время процесса инкапсуляции, тем самым высвобождая свое содержимое и слишком рано теряя свои функции.

Хотя стратегии создания многослойных микрокапсул еще не полностью исследованы, они привлекут гораздо больше внимания исследователей в области биомедицины в будущем благодаря своим уникальным преимуществам, таким как иммунная защита, контролируемое высвобождение биологических факторов, продуцируемых клетками, способность обеспечивать ECM. — имитация окружающей среды и минимальный объемный характер.

2.3. Разные морские биоматериалы

В то время как альгинат и хитозан являются ведущими морскими биоматериалами, исследованными до сих пор для применения в клеточной терапии, другие морские биоматериалы также недавно показали большие перспективы. Среди них наиболее активно использовался каррагинан для целей клеточной терапии. Каррагинаны представляют собой сульфатированные полисахариды, образующиеся в качестве матричного материала в нескольких видах красных морских водорослей (Rhodophyceae), таких как Chondrus crispus, Gigartina и Eucheuma cottonii [184,185].Полисахариды можно разделить на три основных семейства в соответствии с количеством и положением сульфатной группы в повторяющихся единицах галактозы: каппа (κ), йота (ι) и лямбда (λ), как показано на рисунке 4. Среди них κ- каррагинан в основном использовался в области клеточной терапии из-за его отличительных свойств. Гидрогели, приготовленные с κ-каррагенаном, являются термообратимыми и могут быть легко получены с помощью механизма ионного гелеобразования: катионы калия, содержащиеся в κ-каррагенане, предотвращают электростатическое отталкивание между соседними спиралями, демонстрирующими отрицательные заряды, тем самым способствуя их агрегации [186, 187].Благодаря механизму ионного гелеобразования клетки могут быть включены в гидрогели κ-каррагинана в мягких условиях. Его способность к переработке в различные формы / форматы и сходство химической структуры с гликозаминогликанами являются отличительными преимуществами, которые можно использовать из κ-каррагинана [188]. Возможность инъекции гидрогелей κ-каррагинана в физиологических условиях также является одной из привлекательных особенностей морского биоматериала. Хотя этот биоматериал для марины только недавно был использован в приложениях клеточной терапии, он продемонстрировал многообещающие характеристики в нескольких исследованиях.

Рисунок 4. Химическая структура каппа (κ), йота (ι) и лямбда (λ) -карагинанов.

Рисунок 4. Химическая структура каппа (κ), йота (ι) и лямбда (λ) -карагинанов.

Например, Santo et al. предложили гидрогели на основе каррагинана, способные выделять тромбоцитарный фактор роста (PDGF) с контролируемой скоростью для инженерии костной ткани [189]. Они приготовили бусинки κ-каррагинана с использованием метода ионотропного гелеобразования с последующей загрузкой PDGF в бусинки.Эффективность загрузки PDGF в шарики также можно контролировать, изменяя параметры обработки, такие как концентрация биоматериала, ионный сшивающий агент, а именно хлорид калия, и время отверждения в сшивающей среде, составляющее примерно до 90%. Кроме того, поведение высвобождения PDGF из гранул можно также контролировать в зависимости от параметров обработки. По данным анализа MTS, фибробласты, инкубированные в экстрактах, приготовленных с гранулами каппа-каррагинана, не показали значительного снижения их жизнеспособности, что указывает на цитосовместимость гранул каппа-каррагинана.Авторы предположили, что гранулы κ-каррагинана являются многообещающей инъекционной системой, которую можно использовать для доставки клеток и факторов роста в организм минимально инвазивным способом. Каррагинан также продемонстрировал потенциал в инженерии хрящевой ткани. Морской полисахарид особенно полезен для регенерации хрящевой ткани из-за его структурного сходства с гликозаминогликанами, одним из ключевых компонентов, составляющих ECM хрящевой ткани [190, 191]. Rocha et al. сообщили о гидрогелях на основе каррагинана, инкапсулирующих hADSC и TGF-β1, для создания хрящевой ткани [192].Причина включения TGF-β1 в гидрогели на основе каррагинана заключалась в том, что он может инициировать межклеточные взаимодействия и стимулировать пролиферацию и дифференцировку хондроцитов [193,194,195], а также продукцию протеогликанов и других компонентов хрящевого матрикса [196]. Гидрогели каррагинана, включающие TGF-β1, увеличивают жизнеспособность и пролиферацию клеток и повышают уровень экспрессии маркеров хондрогенной дифференцировки, демонстрируя перспективность κ-каррагинана для инженерии хрящевой ткани.Совсем недавно Popa et al. также сообщили о гидрогеле κ-каррагинана с инкапсулированными hASC для инженерии хрящевой ткани [197]. Гидрогели κ-каррагинана не проявляли цитотоксического действия на hASC, что подтверждается экспериментами по флуоресцентному окрашиванию и количественному определению ДНК. Авторы продемонстрировали, что гидрогели κ-каррагинана поддерживают функциональность клеток и построение ЕСМ с обнаружением отложения гликозаминогликанов и продукции протеогликанов с помощью метода метахроматического окрашивания.Кроме того, механический анализ показал повышенную жесткость и вязкоупругие свойства гелей κ-каррагинана с их инкапсулированными клетками во время периода культивирования. Хондрогенная дифференцировка также подтверждается экспрессией клетками коллагена типа II. Эти исследования показывают, что гидрогели на основе каррагинана предлагают новые подходы к лечению дефектов хряща. Каррагинан также использовался в сочетании с альгинатом для приготовления шариков и волокон гидрогеля и продемонстрировал хорошую технологичность для различных составов для доставки клеток и приложений тканевой инженерии [198] .Как показано в этих литературных источниках, каррагинан имеет явные преимущества с точки зрения биологических свойств и технологичности по сравнению с различными препаратами на основе гидрогеля для инъекций. Таким образом, ожидается, что каррагинан станет ведущим морским биоматериалом после альгината и хитозана для применения в клеточной терапии. Помимо каррагинана, агароза (рис. 5) также была исследована для применения в клеточной терапии. Агароза представляет собой полисахаридный полимерный материал, полученный из некоторых видов красных водорослей (Gelidium, Gelidiela, Pterocladia, Gracilaria, Graciliaropsis и Ahfeltia) [199].Морской полисахарид состоит из линейно полимеризованных повторяющихся единиц арабинозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из d-галактозы и 3,6-ангидро-1-галактопиранозы [200]. Отличительным свойством агарозы является ее способность образовывать термочувствительные гели, трансформируемые примерно при физиологических температурах [201]. Благодаря термочувствительным свойствам, гидрогели агарозы были исследованы для приложений доставки лекарств и клеток в биомедицинской области [202, 203, 204]. В частности, морской полисахарид был использован для изготовления каркасов для конструирования мягких тканей, таких как нервные [205] и хрящевые ткани [206, 207], из-за его механических характеристик, подобных мягким тканям, и биосовместимости.Механические свойства гидрогелей на основе агарозы также можно контролировать с помощью температуры гелеобразования и времени отверждения [208]. Однако агароза обладает низкой адгезией клеток и биологическими свойствами, способствующими клеточной активности, включая пролиферацию и дифференцировку [207]. По этой причине агароза обычно исследовалась с другими материалами, обладающими биологическими свойствами, для применения в клеточной терапии.

Рисунок 5. Химическая структура агарозы.

Рисунок 5. Химическая структура агарозы.

Например, гидрогели агарозы, конъюгированные с желатином, были использованы в качестве каркаса тканевой инженерии [209]. В этом исследовании желатин использовался для придания клеточно-адгезивным каркасам на основе агарозы. Клетки прикреплялись и распределялись на агарозно-желатиновых каркасах, в то время как адгезия клеток не наблюдалась на гидрогелях, состоящих только из агарозы. Количество клеток, высеянных на агарозно-желатиновые гидрогели, существенно не отличалось от количества клеток на чашках для культивирования тканей.В другом исследовании агароза использовалась вместе с хитозаном и желатином для подготовки каркасов для инженерии хрящевой ткани из-за ее хорошей механической прочности и способности сохранять фенотип хондроцитов [210]. Гидрогели, приготовленные из композиционных материалов, продемонстрировали соответствующие механические и пористые характеристики и успешные результаты в экспериментах in vivo. Из агарозы также производят гидрогели с пористой структурой [211] и используют для изготовления каркасов вместе с целлюлозой [212] для применения в тканевой инженерии, демонстрируя отличные характеристики.Эта агароза является потенциальным морским полисахаридом в качестве основного материала для приготовления биосовместимых систем для доставки клеток и тканевой инженерии, и ожидается, что в будущем диапазон ее применения будет расширен. Окружающая среда привлекает растущий интерес исследователей в области клеточной терапии [213]. У микроорганизмов есть уникальные метаболические пути, позволяющие выжить в экстремальных условиях, и они выделяют особые биологические материалы, такие как EPS.EPS, полученные из различных морских микроорганизмов, демонстрируют новый химический состав и уникальную биологическую активность. Однако большая часть EPS остается плохо изученной, и лишь некоторые из них полностью охарактеризованы. Выявленные к настоящему времени многообещающие биологические свойства микробных ЭПС в океане включают поддержку клеточной адгезии, облегчение биохимических взаимодействий между клетками, обеспечение защитного действия клеткам и поглощение растворенных органических материалов, необходимых клеткам [214].Например, EPS2, полисахарид, секретируемый морским нитчатым грибом Keissleriella sp., Продемонстрировал замечательные действия по улавливанию свободных радикалов [215, 216]. Это свойство можно использовать для смягчения окислительного повреждения терапевтических клеток и повышения естественной защитной способности клеток [217, 218]. EPS, полученный из морского гриба Penicillium sp. также обладают значительной антиоксидантной активностью, в частности способностью улавливать супероксидные радикалы [219]. EPS, полученный из Vibrio diabolicus, бактерии, выделенной из глубоководных гидротермальных жерловых полихет кольчатых червей, оказался сильным костно-заживляющим материалом, поскольку они способствовали процессу восстановления костей в экспериментальной модели [220].

No related posts.