Мин 1: Индикатор напряжения МИН-1. Цена и условия поставки от компании МСК-СНАБ. Наша компания занимается продажей оборудования с хранения. Наша почта [email protected] тел: 8(499)707-76-61

), скобки и π (число пи), уже поддерживаются на настоящий момент.
  • Из списка выберите единицу измерения переводимой величины, в данном случае ‘1/мин’.
  • И, наконец, выберите единицу измерения, в которую вы хотите перевести величину, в данном случае ‘оборот в минуту [об/мин]’.
  • После отображения результата операции и всякий раз, когда это уместно, появляется опция округления результата до определенного количества знаков после запятой.

  • С помощью этого калькулятора можно ввести значение для конвертации вместе с исходной единицей измерения, например, ‘313 1/мин’. При этом можно использовать либо полное название единицы измерения, либо ее аббревиатуру. После ввода единицы измерения, которую требуется преобразовать, калькулятор определяет ее категорию, в данном случае ‘Скорость вращения’. После этого он преобразует введенное значение во все соответствующие единицы измерения, которые ему известны. В списке результатов вы, несомненно, найдете нужное вам преобразованное значение. Как вариант, преобразуемое значение можно ввести следующим образом: ’92 1/мин в об/мин‘ или ’24 1/мин сколько об/мин‘ или ’65 1/мин -> оборот в минуту

    ‘ или ’44 1/мин = об/мин‘ или ‘9 1/мин в оборот в минуту‘ или ’57 1/мин сколько оборот в минуту‘. В этом случае калькулятор также сразу поймет, в какую единицу измерения нужно преобразовать исходное значение. Независимо от того, какой из этих вариантов используется, исключается необходимость сложного поиска нужного значения в длинных списках выбора с бесчисленными категориями и бесчисленным количеством поддерживаемых единиц измерения. Все это за нас делает калькулятор, который справляется со своей задачей за доли секунды.

    Кроме того, калькулятор позволяет использовать математические формулы. В результате, во внимание принимаются не только числа, такие как ‘(18 * 6) 1/мин’. Можно даже использовать несколько единиц измерения непосредственно в поле конверсии.3′. Объединенные таким образом единицы измерения, естественно, должны соответствовать друг другу и иметь смысл в заданной комбинации.

    Если поставить флажок рядом с опцией ‘Числа в научной записи’, то ответ будет представлен в виде экспоненциальной функции. Например, 1,129 706 779 843 1×1027. В этой форме представление числа разделяется на экспоненту, здесь 27, и фактическое число, здесь 1,129 706 779 843 1. В устройствах, которые обладают ограниченными возможностями отображения чисел (например, карманные калькуляторы), также используется способ записи чисел 1,129 706 779 843 1E+27. В частности, он упрощает просмотр очень больших и очень маленьких чисел. Если в этой ячейке не установлен флажок, то результат отображается с использованием обычного способа записи чисел. В приведенном выше примере он будет выглядеть следующим образом: 1 129 706 779 843 100 000 000 000 000. Независимо от представления результата, максимальная точность этого калькулятора равна 14 знакам после запятой. Такой точности должно хватить для большинства целей.

    Содержание

    Конвенция о запрещении применения, накопления запасов, производства и передачи противопехотных мин и об их уничтожении [Оттавская конвенция] — Конвенции и соглашения — Декларации, конвенции, соглашения и другие правовые материалы

    Конвенция о запрещении применения, накопления запасов, производства и передачи противопехотных мин и об их уничтожении [Оттавская конвенция]

    Преамбула

    Государства-участники,

    будучи преисполнены решимости положить конец страданиям и несчастьям, вызываемым противопехотными минами, которые каждую неделю убивают и калечат сотни людей, главным образом невинных и беззащитных гражданских лиц, и в первую очередь детей, препятствуют экономическому развитию и восстановлению, затрудняют репатриацию беженцев и лиц, перемещенных внутри страны, и порождают другие тяжелые последствия в течение многих лет после их установки,

    считая необходимым сделать все, чтобы эффективным и скоординированным образом способствовать решению сложной задачи удаления противопехотных мин, установленных по всему миру, и обеспечить их уничтожение,

    желая в максимальной степени содействовать усилиям по уходу и реабилитации, включая социальную и экономическую реинтеграцию лиц, пострадавших от мин,

    признавая, что полное запрещение противопехотных мин стало бы также важной мерой укрепления доверия,

    приветствуя принятие исправленного 3 мая 1996 года Протокола о запрещении или ограничении применения мин, мин-ловушек и других устройств, прилагаемого к Конвенции о запрещении или ограничении применения конкретных видов обычного оружия, которые могут считаться наносящими чрезмерные повреждения или имеющими неизбирательное действие, и призывая к скорейшей ратификации этого протокола всеми государствами, которые еще не сделали этого,

    приветствуя также резолюцию 51/45 S Генеральной Ассамблеи Организации Объединенных Наций от 10 декабря 1996 года, в которой ко всем государствам обращен настоятельный призыв активно работать над эффективным, имеющим обязательную юридическую силу международным соглашением о запрещении применения, накопления запасов, производства и передачи противопехотных наземных мин,

    приветствуя далее меры, принятые в последние годы – как на односторонней, так и на многосторонней основе – в целях запрещения, ограничения или временного прекращения применения, накопления запасов, производства и передачи противопехотных мин,

    подчеркивая роль общественного сознания в упрочении принципов гуманности, показателем которой стал призыв к полному запрещению противопехотных мин, и отмечая усилия, предпринимаемые с этой целью Международным движением Красного Креста и Красного Полумесяца, Международной кампанией по запрещению наземных мин и многими другими неправительственными организациями по всему миру,

    ссылаясь на Оттавскую декларацию от 5 октября 1996 года и Брюссельскую декларацию от 27 июня 1997 года, в которых содержится настоятельный призыв к международному сообществу заключить имеющее обязательную юридическую силу международное соглашение о запрещении применения, накопления запасов, производства и передачи противопехотных мин,

    подчеркивая желательность обеспечения присоединения всех государств к настоящей Конвенции и будучи преисполнены решимости активно содействовать приданию ей универсального характера во всех соответствующих форумах, включая, в частности, Организацию Объединенных Наций, Конференцию по разоружению, региональные организации и объединения и конференции по рассмотрению действия Конвенции о запрещении или ограничении применения конкретных видов обычного оружия, которые могут считаться наносящими чрезмерные повреждения или имеющими неизбирательное действие,

    исходя из принципа международного гуманитарного права, согласно которому право сторон в вооруженном конфликте выбирать методы и средства ведения войны не является неограниченным, принципа, запрещающего применение в вооруженных конфликтах оружия, снарядов и средств и методов ведения войны, которые могут нанести чрезмерные повреждения или причинить излишние страдания, а также принципа, согласно которому необходимо проводить различие между гражданскими лицами и комбатантами,

    договорились о нижеследующем:

    Статья 1

    Общие обязательства

    1. Каждое государство-участник обязуется никогда и ни при каких обстоятельствах:

    a) не применять противопехотные мины;

    b) не разрабатывать, не производить, не приобретать иным образом, не накапливать, не сохранять и не передавать никому, прямо или опосредованно, противопехотные мины;

    c) не помогать, не поощрять и не побуждать никоим образом кого бы то ни было к осуществлению деятельности, запрещенной для государства-участника согласно настоящей Конвенции.

    2. Каждое государство-участник обязуется уничтожить все противопехотные мины или обеспечить их уничтожение в соответствии с положениями настоящей Конвенции.

    Статья 2

    Определения

    1. «Противопехотная мина» означает мину, которая предназначена для взрыва от присутствия, близости или непосредственного воздействия человека и при этом выводит из строя, калечит или убивает одного или нескольких человек. Мины, предназначенные для детонации от присутствия, близости или непосредственного воздействия движущегося средства, а не человека и оснащенные при этом элементом неизвлекаемости, не могут быть отнесены к категории противопехотных мин лишь на том основании, что они так оснащены.

    2. «Мина» означает боеприпас, предназначенный для установки под землей, на земле или вблизи поверхности земли или другой поверхности и для взрыва от присутствия, близости или непосредственного воздействия человека или движущегося средства.

    3. «Элемент неизвлекаемости» означает устройство, призванное защитить мину; оно является частью мины, связано с ней, присоединено к ней или помещено под ней и приводится в действие при попытке тронуть мину или иным образом преднамеренно потревожить ее.

    4. «Передача» означает не только физическое перемещение противопехотных мин на национальную территорию или с нее, но и передачу права собственности на мины и контроля над ними, однако не предполагает передачи территории, на которой установлены противопехотные мины.

    5. «Заминированный район» означает участок, являющийся опасным в силу присутствия или предполагаемого присутствия мин.

    Статья 3

    Исключения

    1. Несмотря на существование общих обязательств, изложенных в статье 1, сохранение или передача некоторого количества противопехотных мин для целей разработки методов обнаружения мин, разминирования или уничтожения мин и обучения этим методам разрешены. Количество таких мин не должно превышать минимальный объем, абсолютно необходимый для достижения вышеупомянутых целей.

    2. Передача противопехотных мин для целей уничтожения разрешена.

    Статья 4

    Уничтожение запасов противопехотных мин

    С учетом исключений, предусмотренных в статье 3, каждое государство-участник обязуется уничтожить или обеспечить уничтожение всех запасов противопехотных мин, которые ему принадлежат, или которыми оно владеет, или которые находятся под его юрисдикцией или контролем, в кратчайшие возможные сроки, но не позднее чем по истечении четырех лет после вступления настоящей Конвенции в силу для этого государства-участника.

    Статья 5

    Уничтожение противопехотных мин в заминированных районах

    1. Каждое государство-участник обязуется уничтожить или обеспечить уничтожение всех противопехотных мин в заминированных районах, находящихся под его юрисдикцией или контролем, в кратчайшие возможные сроки, но не позднее чем по истечении десяти лет после вступления настоящей Конвенции в силу для этого государства-участника.

    2. Каждое государство-участник приложит все усилия к тому, чтобы выявить все находящиеся под его юрисдикцией или контролем районы, в которых, как известно или как предполагается, установлены противопехотные мины, и примет меры к тому, чтобы в кратчайшие возможные сроки все места установки противопехотных мин в заминированных районах, находящихся под его юрисдикцией или контролем, были обозначены по периметру, взяты под наблюдение и изолированы с помощью ограждений или других средств, с тем чтобы эффективно исключить доступ туда гражданских лиц до тех пор, пока все установленные там противопехотные мины не будут уничтожены. Обозначение должно соответствовать по крайней мере стандартам, установленным в исправленном 3 мая 1996 года Протоколе о запрещении или ограничении применения мин, мин-ловушек и других устройств, прилагаемом к Конвенции о запрещении или ограничении применения конкретных видов обычного оружия, которые могут считаться наносящими чрезмерные повреждения или имеющими неизбирательное действие.

    3. Если то или иное государство-участник считает, что не сможет уничтожить или обеспечить уничтожение всех противопехотных мин, указанных в пункте 1, в эти сроки, оно может обратиться к совещанию государств-участников или конференции по рассмотрению действия Конвенции с просьбой увеличить промежуток времени, установленный для полного уничтожения таких противопехотных мин, на срок до десяти лет.

    4. В каждой просьбе следует:

    a) указать срок предлагаемого продления;

    b) подробно изложить основания для предлагаемого продления, включая:

    i) информацию о подготовке и проведении работ в соответствии с национальными программами разминирования;

    ii) информацию о финансовых и технических средствах, которые государство-участник может задействовать в целях полного уничтожения противопехотных мин;

    iii) изложение обстоятельств, которые мешают государству-участнику уничтожить все противопехотные мины в заминированных районах;

    c) описать гуманитарные, социальные, экономические и экологические последствия этого продления;

    d) привести всю другую информацию, имеющую отношение к просьбе о предлагаемом продлении.

    5. Совещание государств-участников или конференция по рассмотрению действия, приняв во внимание факторы, указанные в пункте 4, анализирует просьбу и большинством голосов присутствующих и участвующих в голосовании государств-участников выносит решение о том, следует ли удовлетворить просьбу о продлении срока.

    6. Срок может быть продлен еще раз при условии подачи новой просьбы в соответствии с пунктами 3, 4 и 5 настоящей статьи. Обращаясь с просьбой о новом продлении, государство-участник должно представить соответствующую дополнительную информацию о том, что было сделано в ходе предыдущего продления, санкционированного в соответствии с настоящей статьей.

    Статья 6

    Международное сотрудничество и содействие

    1. При выполнении своих обязательств по настоящей Конвенции каждое государство-участник имеет право запрашивать и получать помощь, где это возможно, со стороны других государств-участников в той мере, в какой это возможно.

    2. Каждое государство-участник обязуется содействовать как можно более широкому обмену оборудованием, материалами и научно-технической информацией, имеющими отношение к осуществлению настоящей Конвенции, и имеет право участвовать в таком обмене. Государства-участники не могут вводить необоснованных ограничений в отношении предоставления средств разминирования и соответствующей технической информации в гуманитарных целях.

    3. Каждое государство-участник, обладающее соответствующими возможностями, будет оказывать содействие усилиям по уходу и реабилитации, социальной и экономической реинтеграции лиц, пострадавших от мин, и осуществлению программ информирования о минной опасности. Такое содействие может осуществляться, в частности, через систему Организации Объединенных Наций, международные, региональные или национальные организации и учреждения, Международный комитет Красного Креста, национальные общества Красного Креста и Красного Полумесяца и их международную федерацию, неправительственные организации или на двусторонней основе.

    4. Каждое государство-участник, обладающее соответствующими возможностями, будет оказывать содействие в разминировании и осуществлении связанных с этим мероприятий. Такое содействие осуществляется, в частности, через систему Организации Объединенных Наций, международные или региональные организации и учреждения, неправительственные организации и учреждения или на двусторонней основе, а также путем перечисления средств в Целевой фонд добровольных взносов Организации Объединенных Наций на оказание помощи в разминировании или в региональные фонды, занимающиеся вопросами разминирования.

    5. Каждое государство-участник, обладающее соответствующими возможностями, будет оказывать содействие в уничтожении запасов противопехотных мин.

    6. Каждое государство-участник обязуется предоставлять информацию для базы данных о разминировании, созданной в системе Организации Объединенных Наций, в особенности информацию, касающуюся различных средств и методов разминирования, а также списки экспертов, учреждений, специализирующихся в этой области, или национальных координационных центров, занимающихся вопросами разминирования.

    7. Государства-участники могут обращаться к Организации Объединенных Наций, региональным организациям, другим государствам-участникам или другим компетентным межправительственным или неправительственным структурам с просьбой оказать их руководящим органам помощь в разработке национальной программы разминирования, с тем чтобы решить вопросы, касающиеся, в частности:

    а) масштабов и сферы охвата проблемы противопехотных мин;

    b) финансовых, технических и людских ресурсов, необходимых для осуществления этой программы;

    c) определения срока, необходимого для уничтожения всех противопехотных мин в заминированных районах, находящихся под юрисдикцией или контролем соответствующего государства-участника;

    d) мероприятий по информированию о минной опасности, направленных на уменьшение числа инцидентов, связанных с ранением или гибелью людей в результате подрыва на минах;

    e) оказания помощи лицам, пострадавшим от мин;

    f) взаимоотношений между правительством заинтересованного государства-участника и соответствующими правительственными, межправительственными и неправительственными структурами, которые будут участвовать в осуществлении этой программы.

    8. Каждое государство-участник, предоставляющее и получающее помощь в соответствии с положениями настоящей статьи, будет содействовать обеспечению полного и своевременного осуществления согласованных программ оказания помощи.

    Статья 7

    Меры транспарентности

    1. Каждое государство-участник представит Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций как можно раньше, но в любом случае не позднее чем по истечении 180 дней после вступления настоящей Конвенции в силу для этого государства-участника, информацию о:

    a) национальных мерах по осуществлению, упоминаемых в статье 9;

    b) всех запасах противопехотных мин, которые ему принадлежат, или которыми оно владеет, или которые находятся под его юрисдикцией или контролем, с разбивкой по типам, количеству и, если это возможно, с указанием номеров партий складированных противопехотных мин каждого типа;

    c) насколько это возможно, координатах всех заминированных районов, в которых установлены или предположительно установлены противопехотные мины, находящиеся под их юрисдикцией или контролем, с указанием как можно более подробных данных о типах и количествах противопехотных мин каждого типа, установленных в каждом заминированном районе, и датах их установки;

    d) типах, количествах и, если это возможно, номерах партий всех противопехотных мин, сохраненных или переданных для целей разработки методов обнаружения мин, разминирования или уничтожения мин и обучения этим методам, либо переданных в целях уничтожения, а также об учреждениях, которым государство-участник разрешило сохранить или передать противопехотные мины в соответствии со статьей 3;

    e) о состоянии программ, связанных с конверсией или прекращением эксплуатации объектов по производству противопехотных мин;

    f) о состоянии программ, связанных с уничтожением противопехотных мин в соответствии со статьями 4 и 5, включая подробные данные о методах, которые будут использованы в целях осуществления процесса уничтожения, местоположении всех объектов, где будет осуществляться уничтожение, и применимых нормах безопасности и экологических нормах, которые необходимо будет соблюдать;

    g) типах и количествах всех противопехотных мин, уничтоженных после вступления настоящей Конвенции в силу для этого государства-участника, включая количественную разбивку по каждому типу противопехотных мин, уничтоженных в соответствии со статьями 4 и 5, а также, если это возможно, указание номеров партий противопехотных мин каждого типа – в случае их уничтожения в соответствии со статьей 4;

    h) технических характеристиках каждого типа произведенных противопехотных мин, в той мере, в какой это известно, и мин, которые в данный момент принадлежат государству-участнику или находятся в его владении, с указанием, где это реально возможно, такой информации, которая может способствовать обнаружению и обезвреживанию противопехотных мин; эта информация должна, по меньшей мере, включать в себя данные о размерах, взрывателе, боевом заряде, содержании металла, а также цветные фотографии и другие данные, которые могут способствовать обезвреживанию мин; и

    i) мерах, принятых в целях незамедлительного и эффективного оповещения населения о всех районах, о которых говорится в пункте 2 статьи 5.

    2. Информация, предоставляемая в соответствии с настоящей статьей, должна обновляться государствами-участниками ежегодно, охватывая предыдущий календарный год, и предоставляться Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций не позднее 30 апреля каждого года.

    3. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций препровождает все такие полученные доклады государствам-участникам.

    Статья 8

    Содействие соблюдению и разъяснение по поводу соблюдения

    1. Государства-участники договариваются консультироваться и сотрудничать друг с другом в вопросах, касающихся осуществления положений настоящей Конвенции, и объединять усилия, действуя в духе сотрудничества, с целью способствовать соблюдению государствами-участниками своих обязательств по настоящей Конвенции.

    2. Если одно или несколько государств-участников желают выяснить и стремятся решить вопросы, касающиеся соблюдения положений настоящей Конвенции другим государством-участником, они могут направить этому государству-участнику, через Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, запрос о разъяснении в отношении волнующей их проблемы. К такому запросу прилагается вся относящаяся к делу информация. Каждое государство-участник, заботясь о том, чтобы не было злоупотреблений, должно воздерживаться от направления необоснованных запросов. Государство-участник, получившее запрос о разъяснении, предоставляет, через Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, запрашивающему государству-участнику в течение 28 дней всю информацию, которая может способствовать выяснению проблемы.

    3. Если запрашивающее государство-участник не получит через Генерального секретаря Организации Объединенных Наций ответа в течение этого периода или сочтет ответ на запрос о разъяснении неудовлетворительным, оно может вынести эту проблему через посредство Генерального секретаря Организации Объединенных Наций на рассмотрение очередного совещания государств-участников. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций рассылает это представление, приложив к нему всю соответствующую информацию, имеющую отношение к запросу о разъяснении, всем государствам-участникам. Вся такая информация должна быть предоставлена запрашиваемому государству-участнику, которое будет иметь право на ответ.

    4. До созыва любого совещания государств-участников любое из заинтересованных государств-участников может обратиться к Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций с просьбой оказать свои добрые услуги с целью способствовать получению запрашиваемого разъяснения.

    5. Запрашивающее государство-участник может обратиться через посредство Генерального секретаря Организации Объединенных Наций с предложением о созыве специального совещания государств-участников для рассмотрения данной проблемы. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций вслед за тем направляет это предложение и всю информацию, представленную заинтересованными государствами-участниками, всем государствам-участникам с просьбой сообщить, поддерживают ли они идею о созыве специального совещания государств-участников для рассмотрения этой проблемы. Если в течение 14 дней с момента направления таких материалов по крайней мере одна треть государств-участников выступит в поддержку созыва такого специального совещания, Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций созывает это специальное совещание государств-участников в течение последующих 14 дней. Кворум на этом совещании составляют большинство государств-участников.

    6. Совещание государств-участников или, в зависимости от обстоятельств, специальное совещание государств-участников в первую очередь определяет, следует ли заниматься дальнейшим рассмотрением проблемы, приняв во внимание всю информацию, представленную заинтересованными государствами-участниками. Совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников прилагает все усилия к тому, чтобы решение было принято консенсусом. Если, несмотря на все усилия в этом направлении, согласия достичь не удалось, решение принимается большинством государств-участников, присутствующих и участвующих в голосовании.

    7. Все государства-участники должны в полной мере сотрудничать с совещанием государств-участников или специальным совещанием государств-участников в рассмотрении им этой проблемы, включая работу миссий по установлению фактов, создаваемых в соответствии с пунктом 8.

    8. Если требуется дополнительное разъяснение, совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников санкционирует создание миссии по установлению фактов и утверждает ее мандат большинством голосов государств-участников, присутствующих и участвующих в голосовании. Запрашиваемое государство-участник может в любой момент предложить направить миссию по установлению фактов на ее территорию. Такая миссия направляется без принятия совещанием государств-участников или специальным совещанием государств-участников решения о создании такой миссии. Эта миссия, в состав которой могут входить до девяти экспертов, назначаемых и утверждаемых в соответствии с пунктами 9 и 10, может собирать дополнительную информацию в соответствующем месте или в других местах, имеющих непосредственное отношение к предполагаемой проблеме соблюдения и находящихся под юрисдикцией или контролем запрашиваемого государства-участника.

    9. Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций подготовит и будет обновлять список выделяемых государствами-участниками квалифицированных экспертов с указанием их имени, национальности и других соответствующих данных, а также будет рассылать его всем государствам-участникам. Любой эксперт, включенный в этот список, будет рассматриваться как назначенный в состав всех миссий по установлению фактов, если только то или иное государство-участник не заявит в письменном виде о своем несогласии. В случае несогласия этот эксперт не будет участвовать в работе миссий по установлению фактов ни на территории возражающего против этого государства-участника, ни в любом другом месте, находящемся под юрисдикцией или контролем этого государства, если о несогласии было заявлено до назначения этого эксперта в состав таких миссий.

    10. Получив запрос от совещания государств-участников или специального совещания государств-участников, Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций, проведя консультации с запрашиваемым государством-участником, назначает членов миссии, включая ее руководителя. Граждане государств-участников, обратившихся с просьбой о создании миссии по установлению фактов, или государств-участников, непосредственно затрагиваемых ее деятельностью, не могут быть назначены в состав миссии. Члены миссии по установлению фактов пользуются привилегиями и иммунитетами, предусмотренными в статье VI Конвенции о привилегиях и иммунитетах Объединенных Наций, принятой 13 февраля 1946 года.

    11. Члены миссии по установлению фактов прибывают на территорию запрашиваемого государства-участника в кратчайшие возможные сроки, уведомив это государство по крайней мере за 72 часа. Запрашиваемое государство-участник принимает необходимые административные меры, связанные с приемом, транспортным обеспечением и размещением членов миссии, и несет ответственность за обеспечение, в максимально возможной степени, безопасности членов миссии в период их пребывания на территории, находящейся под его контролем.

    12. Без ущерба для суверенитета запрашиваемого государства-участника миссия по установлению фактов может ввезти на территорию запрашиваемого государства-участника необходимое ей оборудование, которое будет использоваться исключительно в целях сбора информации, касающейся предполагаемой проблемы соблюдения. До момента прибытия миссия сообщает запрашиваемому государству-участнику, какое оборудование она намерена использовать в рамках своей работы по установлению фактов.

    13. Запрашиваемое государство-участник должно приложить все усилия к обеспечению того, чтобы миссии по установлению фактов была предоставлена возможность поговорить со всеми имеющими отношение к делу лицами, которые могут предоставить информацию, касающуюся предполагаемой проблемы соблюдения.

    14. Запрашиваемое государство-участник предоставляет миссии по установлению фактов доступ ко всем находящимся под его контролем районам и объектам, где, как предполагается, могут быть собраны факты, имеющие отношение к проблеме соблюдения. При этом должны быть учтены все меры, которые запрашиваемое государство-участник считает необходимым принять в целях:

    a) защиты секретного оборудования, засекреченной информации и режимных районов;

    b) обеспечения соблюдения конституционных обязанностей, которые запрашиваемое государство-участник может иметь в отношении прав собственности, обыска и конфискации и других конституционных прав; или

    c) физической защиты и обеспечения безопасности членов миссии по установлению фактов.

     В случае принятия запрашиваемым государством-участником таких мер оно приложит все разумные усилия с целью продемонстрировать с помощью альтернативных средств, что оно соблюдает настоящую Конвенцию.

    15. Миссия по установлению фактов может оставаться на территории соответствующего государства-участника не более 14 дней, а в любом конкретном местоположении – не более 7 дней, если не было достигнуто договоренности об ином.

    16. Со всей информацией, предоставленной на доверительной основе и не имеющей отношения к проблеме, которой занимается миссия по установлению фактов, следует обращаться как с конфиденциальной.

    17. Миссия по установлению фактов представляет, через Генерального секретаря Организации Объединенных Наций, доклад о результатах своих расследований совещанию государств-участников или специальному совещанию государств-участников.

    18. Совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников рассмотрит всю соответствующую информацию, включая доклад, представленный миссией по установлению фактов, и может предложить запрашиваемому государству-участнику принять меры к устранению в оговоренный срок проблемы соблюдения. Запрашиваемое государство-участник представит отчет о всех мерах, принятых в ответ на это предложение.

    19. Совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников может предложить заинтересованным государствам-участникам пути и средства, позволяющие еще более прояснить или решить рассматриваемую проблему, включая задействование соответствующих процедур, предусмотренных международным правом. Если будет установлено, что рассматриваемая проблема порождена обстоятельствами, не зависящими от запрашиваемого государства-участника, совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников может рекомендовать надлежащие меры, включая коллективные меры, о которых говорится в статье 6.

    20. Совещание государств-участников или специальное совещание государств-участников должно приложить все усилия к тому, чтобы решения, о которых говорится в пунктах 18 и 19, были приняты консенсусом или же двумя третями голосов государств-участников, присутствующих и участвующих в голосовании.

    Статья 9

    Национальные меры по осуществлению

    Каждое государство-участник принимает все надлежащие правовые, административные и иные меры, включая применение уголовных санкций, чтобы предотвратить и пресечь осуществление любой деятельности, запрещенной для государств-участников по настоящей Конвенции, лицами, находящимися на территории под его юрисдикцией или контролем.

    Статья 10

    Урегулирование споров

    1. Государства-участники консультируются и сотрудничают друг с другом в целях урегулирования любых споров, которые могут возникать по поводу применения или толкования настоящей Конвенции. Каждое государство-участник может довести о любом таком споре до сведения совещания государств-участников.

    2. Совещание государств-участников может внести вклад в урегулирование спора, используя любые средства, какие оно сочтет уместными, в том числе предложить свои добрые услуги, призвать государства, являющиеся сторонами в споре, начать выбранную ими по своему усмотрению процедуру урегулирования и рекомендовать предельный срок для осуществления любой согласованной процедуры.

    3. Настоящая статья не наносит ущерба положениям настоящей Конвенции, касающимся содействия соблюдению и разъяснения по поводу соблюдения.

    Статья 11

    Совещания государств-участников

    1. Государства-участники регулярно собираются для рассмотрения вопросов, связанных с применением или осуществлением настоящей Конвенции, включая:

    a) вопросы, касающиеся действия и состояния настоящей Конвенции;

    b) вопросы, обусловленные докладами, представляемыми в соответствии с положениями настоящей Конвенции;

    c) вопросы международного сотрудничества и содействия в соответствии
    со статьей 6;

    d) вопросы совершенствования методов обезвреживания противопехотных мин;

    e) вопросы, касающиеся представлений государств-участников согласно статье 8;

    f) вопросы, связанные с решениями, касающимися представлений государств-участников, предусмотренных в статье 5.

    2. Первое совещание государств-участников будет созвано Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций в течение года после вступления настоящей Конвенции в силу. Последующие совещания будут созываться Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций ежегодно до проведения первой конференции по рассмотрению действия Конвенции.

    3. При возникновении обстоятельств, о которых говорится в статье 8, Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций созывает специальное совещание государств-участников.

    4. Государства, не являющиеся участниками настоящей Конвенции, а также Организация Объединенных Наций, другие соответствующие международные организации и учреждения, региональные организации, Международный комитет Красного Креста и соответствующие неправительственные организации могут приглашаться на эти совещания в качестве наблюдателей в соответствии с согласованными правилами процедуры.

    Статья 12

    Конференции по рассмотрению действия

    1. Конференция по рассмотрению действия будет созвана Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций через пять лет после вступления настоящей Конвенции в силу. Последующие конференции по рассмотрению действия будут созываться Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций по просьбе одного или нескольких государств-участников, при условии что промежуток между конференциями по рассмотрению действия ни в коем случае не будет менее пяти лет. Все государства-участники настоящей Конвенции будут приглашаться на каждую конференцию по рассмотрению действия.

    2. Конференция по рассмотрению действия созывается с целью:

    a) провести обзор действия и состояния настоящей Конвенции;

    b) рассмотреть необходимость проведения последующих совещаний государств-участников и установить промежутки между ними, о чем говорится в пункте 2 статьи 11;

    c) принять решения в отношении представлений государств-участников, предусмотренных в статье 5;

    d)  утвердить, в случае необходимости, в своем заключительном докладе выводы, касающиеся осуществления настоящей Конвенции.

    3. Государства, не являющиеся участниками настоящей Конвенции, а также Организация Объединенных Наций, другие соответствующие международные организации и учреждения, региональные организации, Международный комитет Красного Креста и соответствующие неправительственные организации могут приглашаться на каждую конференцию по рассмотрению действия в качестве наблюдателей в соответствии с согласованными правилами процедуры.

    Статья 13

    Поправки

    1. В любое время после вступления настоящей Конвенции в силу любое государство-участник может предложить поправки к настоящей Конвенции. Каждое предложение о внесении поправки направляется Депозитарию, который рассылает его всем государствам-участникам и запрашивает их мнения о том, следует ли созвать конференцию по рассмотрению поправки для рассмотрения этого предложения. Если большинство государств-участников не позднее чем через 30 дней после рассылки предложения уведомят Депозитария о том, что они выступают за дальнейшее рассмотрение этого предложения, Депозитарий созывает конференцию по рассмотрению поправки, на которую приглашаются все государства-участники.

    2. Государства, не являющиеся участниками настоящей Конвенции, а также Организация Объединенных Наций, другие соответствующие международные организации и учреждения, региональные организации, Международный комитет Красного Креста и соответствующие неправительственные организации могут приглашаться на каждую конференцию по рассмотрению поправки в качестве наблюдателей в соответствии с согласованными правилами процедуры.

    3. Конференция по рассмотрению поправки проводится сразу же после проведения совещания государств-участников или конференции по рассмотрению действия, если только большинство государств-участников не обратятся с просьбой провести ее раньше.

    4. Любая поправка к настоящей Конвенции принимается большинством в две трети голосов государств-участников, присутствующих на конференции по рассмотрению поправки и участвующих в голосовании. Депозитарий сообщает о любой принятой таким образом поправке государствам-участникам.

    5. Поправка к настоящей Конвенции вступает в силу для всех государств-участников настоящей Конвенции, которые приняли ее, после сдачи Депозитарию документов о принятии большинством государств-участников. В последующем она будет вступать в силу для любого оставшегося государства-участника в день сдачи им Депозитарию своего документа о принятии.

    Статья 14

    Расходы

    1. Расходы, связанные с проведением совещаний государств-участников, специальных совещаний государств-участников, конференций по рассмотрению действия и конференций по рассмотрению поправок, покрываются государствами-участниками и участвующими в них государствами, не являющимися участниками настоящей Конвенции, в соответствии со шкалой взносов Организации Объединенных Наций, скорректированной надлежащим образом.

    2. Расходы, понесенные Генеральным секретарем Организации Объединенных Наций согласно статьям 7 и 8, и расходы, связанные с деятельностью любой миссии по установлению фактов, покрываются государствами-участниками в соответствии со шкалой взносов Организации Объединенных Наций, скорректированной надлежащим образом.

    Статья 15

    Подписание

    Настоящая Конвенция, совершенная в Осло, Норвегия, 18 сентября 1997 года, открыта для подписания всеми государствами в Оттаве, Канада, 3 и 4 декабря 1997 года и в Центральных учреждениях Организации Объединенных Наций в Нью-Йорке с 5 декабря 1997 года до ее вступления в силу.

    Статья 16

    Ратификация, принятие, утверждение или присоединение

    1. Настоящая Конвенция подлежит ратификации, принятию или утверждению подписавшими ее сторонами.

    2. Она будет открыта для присоединения любого государства, которое не подписало Конвенцию.

    3. Документы о ратификации, принятии, утверждении или присоединении сдаются на хранение Депозитарию.

    Статья 17

    Вступление в силу

    1. Настоящая Конвенция вступает в силу в первый день шестого месяца считая с месяца, в течение которого был сдан на хранение сороковой документ о ратификации, принятии, утверждении или присоединении.

    2. Для любого государства, которое сдает на хранение свой документ о ратификации, принятии, утверждении или присоединении после даты сдачи на хранение сорокового документа о ратификации, принятии, утверждении или присоединении, настоящая Конвенция вступает в силу в первый день шестого месяца считая с даты сдачи этим государством на хранение своего документа о ратификации, принятии, утверждении или присоединении.

    Статья 18

    Временное применение

    Любое государство может в момент ратификации, принятия, утверждения или присоединения заявить, что оно будет применять на временной основе положения пункта 1 статьи 1 настоящей Конвенции до вступления ее в силу.

    Статья 19

    Оговорки

    Оговорки в отношении статей настоящей Конвенции не допускаются.

    Статья 20

    Срок действия и выход

    1. Настоящая Конвенция является бессрочной.

    2. Каждое государство-участник в порядке осуществления своего государственного суверенитета имеет право, выйти из настоящей Конвенции. Оно уведомляет о таком выходе все другие государства-участники, Депозитария и Совет Безопасности Организации Объединенных Наций. В таком уведомлении о выходе должно содержаться полное объяснение причин, мотивирующих такой выход.

    3. Такой выход вступает в силу только по истечении шести месяцев со дня получения Депозитарием уведомления о выходе. Однако если на момент истечения этого шестимесячного срока государство-участник, заявившее о выходе, вовлечено в вооруженный конфликт, выход вступает в силу лишь после окончания этого вооруженного конфликта.

    4. Выход государства-участника из настоящей Конвенции никоим образом не затрагивает обязанности государств продолжать выполнение обязательств, взятых в связи с какими-либо соответствующими нормами международного права.

    Статья 21

    Депозитарий

    Генеральный секретарь Организации Объединенных Наций настоящим назначается Депозитарием настоящей Конвенции.

    Статья 22

    Аутентичные тексты

    Подлинник настоящей Конвенции, тексты которой на английском, арабском, испанском, китайском, русском и французском языках являются равно аутентичными, сдается на хранение Генеральному секретарю Организации Объединенных Наций.

    Гайковерт пневматический ударный композитный 1/2″DR 9500 об/мин, 1 356 Нм Jonnesway JAI-1114

    Пневматический ударный гайковерт с лекгосплавным, металлическим корпусом, покрытым специальной, ударопрочной эмалью, нанесенной электростатическим способом. Резинополимерная накладка рукоятки снижает вибрационные воздействия на руку оператора. Гайковерт применяется для обслуживания осложненных и нагруженных соединений с размерами резьбы до М16 и максимальным моментом затяжки 1356 Нм. Во время производства работ с применением пневматических ударных гайковертов, рекомендуется использование перчаток с виброгасящими накладками и средств защиты органов зрения и слуха.

    Код товара 49922
    Артикул JAI-1114
    Страна производитель Тайвань

    ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА

    Инструмент JONNESWAY ENTERPRISE CO., LTD. по уровню исполнения относятся к изделиям класса PROFESSIONAL, применяются для производства работ по сборке, ремонту и обслуживания продукции машиностроения, персоналом, имеющим соответствующую квалификацию, знакомым с правилами техники безопасности, условиями эксплуатации и навыками работы.

    На изделия JONNESWAY распространяется понятие «ПОЖИЗНЕННАЯ ГАРАНТИЯ», то есть, объявление неограниченного срока поддержания гарантийных обязательств весь срок эксплуатации, а именно, замены вышедшего из строя инструмента в случае использования производителем некачественных материалов или нарушения технологии в процессе его производства. Другими словами: подлежит замене инструмент, имеющий дефект, обнаруженный или возникший в результате нарушений при его производстве и делающий невозможным дальнейшее использование инструмента.

    Не подлежат обслуживанию по гарантийным условиям изделия, вышедшие из строя в результате:

    • Воздействия нагрузок, превышающих расчетные.
    • Воздействий, не связанных с выполнением основных функций изделия.
    • Нарушений правил хранения и применения
    • Естественного износа.

    В этой связи, производитель настоятельно рекомендует:

    1. Не использовать насадки для ручного привода с механизированным инструментом.
    2. Не использовать насадки для механизированного инструмента с ручным приводом.
    3. Не наращивать рычаг привода или ключа.
    4. Не наносить удары по телу ключа или привода другими предметами.
    5. Не допускать падения инструмента с большой высоты на твердую поверхность.
    6. Не допускать длительное хранение инструмента в условиях высокой влажности или иных агрессивных к материалам изделия средах.
    7. Не допускать самостоятельного ремонта и регулировок инструмента в период гарантийного срока.
    8. По окончании работ очищать инструмент от загрязнений.

    Подбирать и использовать инструмент согласно производимой работе и строго по назначению.

    Вставки-биты являются расходным материалом, гарантия на них не распространяется, равно как и на торцевые насадки (головки с вставками, составные и цельные), ударные и для ручного привода, предназначенные для обслуживания крепежа с внутренним рабочим профилем.

    Гибкие удлинители и удлинители с шаром (серия S21) неспособные, в силу своих конструкционных особенностей передавать большой крутящий момент, также не подлежат обслуживанию по гарантийным условиям.

    Инструменты режущего, ударно-режущего действия, отвертки и шарнирно-губцевого инструмент, в случае износа рабочих поверхностей, обмену по гарантии не подлежат.

    На инструмент, имеющий в своей конструкции кинематическую схему, распространяется понятие «ограниченной гарантии», в связи с сокращенным сроком эксплуатации, связанным с повышенным износом при использовании и определен в 12 месяцев с начала использования в условиях эксплуатации средней интенсивности, за исключением динамометрических ключей, точность показаний которых зависит от интенсивности эксплуатации. Динамометрические ключи подлежат обязательной тарировке по совершении 1000 циклов. При повышенной интенсивности или тяжелых условиях эксплуатации инструмента гарантийный срок может быть сокращен. Начало эксплуатации определяется по дате продажи, указанной в гарантийном талоне JONNESWAY продавцом инструмента или документе подтверждающим факт приобретения изделия. В случае отсутствия возможности определения даты начала эксплуатации изделия, начало эксплуатации определяется по серийному номеру, исходя из информации, получаемой от производителя. Обслуживание по гарантийным условиям производителя не предоставляется в случае невозможности идентификации предусмотренных серийных номеров изделий и документов, подтверждающих приобретение и начало эксплуатации изделий, относящихся по гарантийным условиям к инструментам с ограниченным гарантийным сроком. Претензии к инструменту, вышедшему из строя в течение гарантийного срока, принимается к рассмотрению в соответствии с Законом «О защите прав потребителя».

    Претензии по данной гарантии также не принимаются к рассмотрению в случаях невозможности подтверждения квалификации пользователя, наличия признаков проведения ремонтных работ изделий, осуществлявшихся неуполномоченными на это лицами, изменения конструкции, или самостоятельной установки неоригинальных компонентов и деталей изделий.

    Производитель оставляет за собой право определения причины выхода из строя изделия (из-за некачественного материала, человеческого фактора или по иным причинам).

    Права по настоящей гарантии ограничиваются первоначальным потребителем и не распространяются на последующих.

    Функция МИН — Служба поддержки Office

    В этой статье описаны синтаксис формулы и использование функции МИН в Microsoft Excel.

    Описание

    Возвращает наименьшее значение в списке аргументов.

    Синтаксис

    МИН(число1;[число2];…)

    Аргументы функции МИН описаны ниже.

    • Число1, число2,…    Аргумент «число1» является обязательным, последующие числа необязательные. От 1 до 255 чисел, среди которых требуется найти наименьшее.

    Замечания

    • Аргументы могут быть либо числами, либо содержащими числа именами, массивами или ссылками.

    • Учитываются логические значения и текстовые представления чисел, которые непосредственно введены в список аргументов.

    • Если аргумент является массивом или ссылкой, то учитываются только числа. Пустые ячейки, логические значения и текст в массиве или ссылке игнорируются.

    • Если аргументы не содержат чисел, функция МИН возвращает значение 0.

    • Аргументы, которые являются значениями ошибки или текстами, не преобразуемыми в числа, приводят к возникновению ошибок.

    • Если в ссылку в качестве части вычислений необходимо добавить логические значения и текстовые представления, воспользуйтесь функцией МИНА.

    Пример

    Скопируйте образец данных из следующей таблицы и вставьте их в ячейку A1 нового листа Excel. Чтобы отобразить результаты формул, выделите их и нажмите клавишу F2, а затем — клавишу ВВОД. При необходимости измените ширину столбцов, чтобы видеть все данные.

    Данные

    10

    7

    9

    27

    2

    Формула

    Описание

    Результат

    =МИН(A2:A6)

    Наименьшее из чисел в диапазоне A2:A6.

    2

    =МИН(A2:A6;0)

    Наименьшее из чисел в диапазоне A2:A6 и 0.

    0

    gto_norm_03_eng

    %PDF-1.5 % 1 0 obj >/OCGs[7 0 R 873 0 R]>>/Pages 3 0 R/Type/Catalog>> endobj 2 0 obj >stream 2018-02-07T10:10:37+03:00Adobe Illustrator CC (Macintosh)2018-02-07T10:11:25+03:002018-02-07T10:11:25+03:00

  • 256176JPEG/9j/4AAQSkZJRgABAgEBLAEsAAD/7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA+0AAAAAABABLAAAAAEA AQEsAAAAAQAB/+4ADkFkb2JlAGTAAAAAAf/bAIQABgQEBAUEBgUFBgkGBQYJCwgGBggLDAoKCwoK DBAMDAwMDAwQDA4PEA8ODBMTFBQTExwbGxscHx8fHx8fHx8fHwEHBwcNDA0YEBAYGhURFRofHx8f Hx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8f/8AAEQgAsAEAAwER AAIRAQMRAf/EAaIAAAAHAQEBAQEAAAAAAAAAAAQFAwIGAQAHCAkKCwEAAgIDAQEBAQEAAAAAAAAA AQACAwQFBgcICQoLEAACAQMDAgQCBgcDBAIGAnMBAgMRBAAFIRIxQVEGE2EicYEUMpGhBxWxQiPB UtHhMxZi8CRygvElQzRTkqKyY3PCNUQnk6OzNhdUZHTD0uIIJoMJChgZhJRFRqS0VtNVKBry4/PE 1OT0ZXWFlaW1xdXl9WZ2hpamtsbW5vY3R1dnd4eXp7fh2+f3OEhYaHiImKi4yNjo+Ck5SVlpeYmZ qbnJ2en5KjpKWmp6ipqqusra6voRAAICAQIDBQUEBQYECAMDbQEAAhEDBCESMUEFURNhIgZxgZEy obHwFMHR4SNCFVJicvEzJDRDghaSUyWiY7LCB3PSNeJEgxdUkwgJChgZJjZFGidkdFU38qOzwygp 0+PzhJSktMTU5PRldYWVpbXF1eX1RlZmdoaWprbG1ub2R1dnd4eXp7fh2+f3OEhYaHiImKi4yNjo +DlJWWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq+v/aAAwDAQACEQMRAD8AfYQXdzdx2FhJMLqc8ItP vEMgc0rxR+p2HZjnPiJJ5X7nqp1XFIAgfxRNfMfsCYv+U/mG9crN5emtJf8Af8Dx+mf9ixU/8LmQ MWUcgse0/DHpyCQ7pc/x8UovfyW89xMfq2nyXC9hQI34nj+OWRjPrEudi7bwn6jw/ah/+VOfmX/1 Y5f+RkH/AFUyfhS7m/8AlfTfz/v/AFO/5U3+Zf8A1Y5P+RkH/VTHwpdy/wAr6b+f9/6nf8qb/Mv/ AKscn/IyD/qpj4Uu5f5X038/7/1O/wCVN/mX/wBWOT/kZB/1Ux8KXcv8r6b+f9/6nf8AKm/zL/6s cn/IyD/qpj4Uu5f5X038/wC/9SP0L8pfzBtdUhuLnRZVij5GvOJtypA2VyepyGXDMxoBxdZ2ngni MYy3PvTgflz53NuIn0mUn6vFC+6UJd63H7XZfv7ZT+XnfJ151mLisS/iJ+Q9Kt/yr/zp65lOkzH9 9JMQSm5VPThh3uhG/t3yP5bJ3Nf5rHVcQ+kD7bKmPy787rEFXS5uaxLEsnw1DStW4k69fDD+Xn3M vzeIm7HO/l9IX/8AKvPOvKselywmvoxOOB9GBR1QVPxPT6O/TH8vk7kfm8Vbm+v9aXn5D8c1Bvy3 82VLf4cL8T1lflO1O/McgD4fF92HwMncWz87Dl4h+A9Py/Yt1DyZ5r0yzkvbmxmSCzUSxXEpUsvI gNA5BPINWgO/4DISwzAsigxjqMcjVj1bGuX9Yfj9LKPySMY80XsSfYSyaSD2imkiYD6GDAZkaH6z 7nF7SvwwT1O/vF/opv8AO9lXzHYuZLiGlmKTQDmq/vX/ALxaNUf7HDrvrHuT2YLgRUTvyP6D+1iE PkzzHrFlFeJpC6xYzgmG8gAikIBoaciB1H8wzHhhmd4guaNTHHKhI45Dodx+Pgh7z8k/NJX1LSxn iY7+jKFantyQmn45cIZBzi5OLtyI2nR8x+1Kv+VOfmTUhdElYD9rnEAf+CcHLRjl3OaO19N/P+93 /Km/zL/6scn/ACMg/wCqmPhS7k/yvpv5/wB/6nf8qb/Mv/qxyf8AIyD/AKqY+FLuX+V9N/P+/wDU 7/lTf5l/9WOT/kZB/wBVMfCl3L/K+m/n/f8Aqd/ypv8AMv8A6scn/IyD/qpj4Uu5f5X038/7/wBT v+VN/mX/ANWOT/kZB/1Ux8KXcv8AK+m/n/f+pkkH5a+dUsI7c6TMGW19A0KbNKwMu4bsB179sxjg yXddXTz12IzMuIfXfy5Ir/lX3nM3HqHSpuBuPVI+D7CRcIx1/m3yP5fJ3NP5rHw1xD6a+Zs/Yoj8 u/PHoBf0VMJBAI+QKbSTPW4YfF+z1Hj2w/l59zM6vFfMVxX8Ij0qjfl35yZnX9EzJFIwiIBX4baN fhRfi/bPXwB3x/L5O5iNXjH8Qsb/AOcevwU5Py685yqhm0SSYtssEhUQQKOi8VLcm96U9xj+XyDo WQ1mOPKdeY+qX6g6P8u/OcSu0OiSQsnWGMqYJ1PVeLFeLe9Ke5x/L5D0Ky1eOVXO/M/VH9YSe7s5 tOvZLO5QrJZusTxtufQnPAxt48Hh4DKSCNi2xlxix/F/uo738QmvkKdR5x0iEXUorcp/od0n73b+ RzQtTv8Aa2y3APWNuvRr1UP3cjwjl9UeXxH9j078wPzC1jy/q8NjaWitG6xSCV1dvU5uVYAqKUWm 46+4zaajOMdWQP1fj+x0GDTzyE8I5D8fj7UD5g/Oa60R9Mgm0h2ri/09dQlVryC2MYZnUr6cvxkV Qb9PizJaUph/5yNgnETQ6LFIs684qalAKqqlpCeSKFCCOT4mNCUIBqVBVRdp/wA5B6W96I7yxt7O zWSNJ7t9StyUjdwhk9OgZggIYgb77VxpXpP6at5dLk1OydLmzNmt7ayqfhkR0Z1IPgygUyE5UCe5 MRZpj8vnfUbe5WO4sofTCo8hjlYtxZFk+EMgqeL5hnVSB3Ab/BBGxRS+cpuRU2BJUlSQ0gBIJ6Vi 8Bk/zR7vx8keD5q1p5seWZVntDFD8XqTL6r0p2AEe+9BhjqbO4/HyQcXmjj5k0nhzDyMCCy8YJjU Dbb4Ms8eP4BYeGVzeYNLVirNKCDxP7ibr4VCYfGj+AV8MosXKutvJFvHOdiQQeJQsNjQjp3ywGxb Ah59qH5o3cXnKXRoYbeK2s2ZJxcMVll4blkrxp7UVvE7EZj9o5J6fHHIAJA9Px97fpJ6aQlHJIwm Pp7id/ny5WCs1f8ANq7sNQngFpaNFDIyLzuSkrAFh9gpsfhoR2+7MiBsA97QUw8ya2dV/K251aZI 4xMqOyxv6iBUuVX7RC12XfbMfWf3Z+h4uRpQTkADCvyNjdPNE6sKGPRoI2/1llBI/HMXRh2n4/od t2rIHH78kir/AJ3yiPzFYsZ5baloP3sac4x+9faQUbbw/Xg131j3MOzI3AihLfkdj8GV+WNXu9N/ Ke31O1Rb64gjkdRGpKvW5YFgqmtADXY5m6OvDF/jd1uvBGSQAr3+5LNI/NrVptK1fUrjTBNBpsfq xhWMHNmnEQjMsoWMdTQdaDv1x02XjhZIJvp+D+3nsw1GGWOdEVslP/Qx0HwA6LCjOnrANqdvQQgC srMFKheTBRvv+zWhpkU0rm/5yLiKj0NEimdiOKDU7ZSUdFkRqMoI5IzNQjouNKzfyb+Y2k+aLG4N u8MeqWsbS3FhHOtyET9h/UjAUq2BUZrPmLUbK9lgtraGWOH6sHaSRkbldOyLQKjbArvmLlzyiaA7 vtbYYwRugYvPV0yRV08PK6hikcjkfHHHKlCIz+zMAffIDVnu/G362ZwjvVW863QZCNNJRweNHkJJ AB2pF4Vw/mj3fj5I8Ed6aQ+ZdP8AST6x6kVyE5TRCGdgrAhXAPp/EFY0rlwzxrfn7iwOMqg8w6We jS0JoD6E3Xf/ACPbD48fwCjwyiLTU7O7kaOBmLoKtyjkQU27sqjvko5BLkgxIY75886yeWfLsOor Ejz3JCK0nIRRkxly7UHQcenIfgcvhjMrroGHiRjIcV0T0SR/zO1SHQ7W7e3sXu3kVbstc+nCgY78 WAkUlO/xU2+0M12j1UsplGQoxLl6uOET/cy44fqRnkr8wtS17Wm066trGNBC0qy2d01wTwYKRQxo APiFN9/15zivK/P7q3m7WwNiJBHUfzSTkKPvGaHP9Z95ek0g/dx+P2R3Sb8q9e1K5886LZXEglje 4B5sPjHBS2xFOvGm+ZGPEBMEd7se09FjjhlOIo0+nr7TLK+9L60hf0W5xUd0o3j8BXNq8UrSW1vK waSJHZdlZlBI+ROKrUsrJDVLeNTSlQijalKbDFVi6XpirxW0hVa8uIjQCvj064qqtbQNG8bRqY3T 03SnwlNxxp4b4CLUKJ0rTSQWtYmIZHFVBo0Q4od+6jYZHw49zLiKj/h7Q+fP6jDzNfi4CvxbHI+D DuT4ku9ZH5Y8vxuzpYRBmNW+GoryDdDt1GAYIDoviS72j5X8usatp8B+aA4/l4dwXxJd6aZcwaKq xUkVKmq+xoR+o4qkN/5E8q32sHV7mxVr9uHqyBmUSenuvqKCFanuMjOIkKLXPFGXMLrnyP5Vubp7 qawVp5HaR2DyKC7gKx4qwG4HhkmxKvP+m6dp35b6jZQRmKxiWP8AdAs5o1yjMPiLMeRY5j6v+7P4 6uXob8WNc/2MI/JRm/xTfCQUnezeWcdkLSxCNK+Kou/398wtD9Z9zn9ogeGK5XQ8+dn5pd/zkLqt 9p/mbSntX487M81IBDUlala/PLdXASlv3Ob2HpoZcUuIdf0PTPymuGufy90ed1CtIkrMF2FTO/TM nTCoAfjm6btLGIZ5RHT9TJLHSrCxt2t7aLjC7c2Viz1Y0G5csewy9wV5sLE1rbRGvX4F3/DFWm07 T2dHa1iZ4/sMUUlfkabYqhtTk0/SNIv9Q+qF4bW3muJoLaNfVkWNDIyIvw8mamwrucVeen88vy/m ld30rVjdKYDOh06QyI6sTEr0qAytWm/yyJgDvTLdy/mv+WksLI2i6gvpVk9A6XKD+8YcyOK06gV3 +WROGHcE8Uu9Cn82vyumiU/oTUmSu/HTpduRABPE78u1MicEO5PHLvUpfze/LD1UWby5qioB+6nf T+IZRV2KAuJGCmvKi/hicEO5eOXen3lP81/JWoa1ZaFpOmX9ncaoztC01obeE+nDJLyZ2busJApX 9dLIwEeQYyJPN6JkmKX6xoGk6xpx07UbcT2nwkRkkEFdgVYbg074oItL4vIHlKO0jtBYBreJneNW eQkNIKE8i3I7dKnbtkYxEeTGGOMBQCto/k3y1o06z6ZZLbSqhiDK8jfC1CRRmIP2Rkmbwvz00aec NYdYzwiu2klHeSegWKNa/Q33Zo8/1l6TTAnHEd8a90ep/QxX8ov/ACZGhf8AGdv+TbZl4/qDvO1v 8Wn7v0vrjNi+fuxVIvOXnXQvJ+mQ6nrcjxWU1zHa+rGhk4NLWjMF34qFJNAT7Yqxkf8AOQX5QHp5 gHXj/vLedf8AkTimmH+a/wA/baa8gufJ/mLTobeISxzafq1lfkzyIWAZWghJVStCtXX3p0xWksf8 /PNiTSQtr3lNHAQxcrLXTzDxrMGHFG24v33r2xWlST8//MBgieHzF5TLEFZS1nrpXnzbjxIi6FKd e/LsMVpRuvz382vZPTzN5Ut2mWSOO4js9bLo4Aqyh5XWqBqjkpBPbFaXJ+fnmQGTh5j8sGN3me1+ s2WtCT0mmb0q+lEF48CtO9PtVNcVplflH88vL8OkSz+cdfsmu572ZLN9PtL9YfRSKFwvGSh2Kj1a 1bqCN+uK0nJ/5yA/KIMFOvgFq0ra3nah/wB8++K0znTNRstT0201Kxk9ayvoY7m1loy84pVDo3Fg rCqsDQiuKETirF/zOYp5F1Rg6xlViPqP9laTp8R6dMx9X/dn8dXK0QvKBV+559+SXL/El1xBWE2U jIz/AN5KTNFylYdge3+1mFofrPudh3l9A77HuGx2SP8A5yW/5SPSP+YNv+TpzI1h2fB2ns5/dy/r foepfk5/5LTQ/wDjFJ/yfky/B9AdF2v/AIzP3/oDM8udc7FXnF9+R+jXGo3l7b+YNdsBqNzcXd5b Wl76ULNdOZJAqKgoOfE716fTim0BrP5h3EVm9/Z6x5i1HVbBJJdNgOqiFzKVHwpO8ZERfiql/YeG K2wi38gfmpJZWlrqOj67JLHPFPJdx+Z4V4GF5OJiR1kKHjNuQ53FRTFNqk/lr80LS4lRNJ82zxei k1I/NUdFevOYBhDRm+LjxXrvSvZVUk8k/mvbzKItM1++RppTctN5pRQ8ZieBSoURsH+y6s1f5WVh tiq/R/Jn5lvfQvNpPma1tLkxLJI3myKsKtQSSlViVm4qq/BTt9AVQnl7yT+ch2jRpdYbWxpV7JGt 3Imsz+vbRkN8UgMhIKq/I/B/k7E4F2emL+TVmsDQjzb5o4uSX/3LS78iS2wWnxFqnbCi058qeQYP Ll/cXqa5rOqvcxiNo9UvWuo1oQQyqVWjbUr4YoZRirsVfOXnlnbzrqvpyepNHcSemGFI7cH7Ukm+ 7fyjw+k5o8/1n3vR6YDwhYoEfGXkPLv/ALAxT8ov/JkaF/xnb/k22ZeP6g73tb/Fp+79L64zYvn7 sVdiqnDb28JkMMSRmVzJKUULycgAs1OrGnXFWL+cvy+TzPfWd42varpUljT0Y9OnSGOvKrOQY2bm UJSvLYdsU2k8n5PSfo68tofOXmFZ7v1Wa4kuo35SSJGiNKFjjaQIsKrTmKioqK7K2hdD/JnVLK8t 31HzrqupWdk8c1jaPwCwywSq8TL6vrpRUUxkBBUE7jpitrk/JjUo7kPF5/8AMqwOedyhvA0juAoB V+NF2WlOJ7eG6tuP5IQSW1vY3PmrXLzTIfVBs57leKq0LxQ+j6SxCNoeastQy1X7NNsVtlPkXyc3 lPTLrTv0rd6tDNdPcwTXzmSaNHjRPSL1owDIW2C9encqGR4q7FXYqxb8z24+RdUbkicREecn2FpO m7dOmY+r/uz+OrlaIXlHP4c+Tz78kqN5nvJQHfnZPW6l+EyUli+wn7KDt/mcwtD9Z9zse0tsYGw3 5Dpz5nvST/nJb/lI9I/5g2/5OnMjUfV8HZ+zn93L+t+h6l+Tn/ktND/4xSf8n5MvwfQHRdr/AOMz 9/6AzPLnXOxV2KpT5i1PWtPt4JNJ0ltYmklCSQJNHAVQgkvzk+Hanf8AXTFUjj82ef3kKf4HlQK/ BnbUbMDjQHktCa9cVSfXtU/MS/Wwuh5Z1HTZbK5eQ21pqdqROqAOolEfqBkfiRxYex64VSiXyv8A mARL6UGvRyRpCkJXXYvTk4A82oTszcfiqtDXam+KGSaFL560OOW1l0i+1j171xHNc39s5jtwQgcM 3FqMq8+B33+gKUyfzD57SnHymZSz8dr62QKoWMliSWJHJ3AoK/D03GBU/wBGuNRudKtrjUrdbS9m QPNbIxcRltwpZlQ8gKctuuKozFXYq7FXzj57b1POWrw1NwRcsRaIOIr/ADTvv8PgPDsc0ef6z73p NMKxRP07fUf96Px8GK/lF/5MjQv+M7f8m2zLx/UHedrf4tP3fpfUkvmvyvDK0MusWMcqO0bxtcwq yuhIZCC1QylTUZsXz9r/ABb5V/6vNj/0kw/81Yq7/FvlX/q82P8A0kw/81Yq7/FvlX/q82P/AEkw /wDNWKsVvfO+vR3c/wBU1Dy21mZmS0+sagUmZCwCFgoZfs1J3r7YVWN5y82+nGV1Dyn6hjJlU6jN RZNuIVvT+JT3JAp4HFWNXml2txqV8RL5cktpL17+J7nUnaOSSUs7Ex/GAeT0aq0oNvDFCGj8l6BF EZLa78v2l2qwmIx6rckCRUZ5DzBRvhuJDxNKletD0VZjL5y8wzfWfR1Ly3aBJ2FoJL4ymSD05eLO VACt6no1FDtz/wAklSr23m/VX1VFu9X8vw6X6rFnt7v1ZTCBVQwkMQVm+z8NadfbFWR/4t8q/wDV 5sf+kmH/AJqwK7/FvlX/AKvNj/0kw/8ANWKu/wAW+Vf+rzY/9JMP/NWKpB+YGtaRfeRtY+oaha3B gWAytFIkwj5TrxLqjd+Jp40zh2f92fx1crRC8o6/2MK/JMFvM95KRK3Kyf8AfzfCW/exbJHtxX6B mFofrPudh3ltjA258h8eZ6lI/wDnJb/lI9I/5g2/5OnMjUfV8Haezn93L+t+hl/kO88uWXkXytde YJLWGwjsr799e8BGrm6jpvJ8IJFcyMH0B0Xa/wDjM/f+gMu8l6Doj+TtCeTTrVpG060Z2MMZJJgQ kkld8tdcnP8Ah7QP+rba/wDIiP8A5pxV3+HtA/6ttr/yIj/5pxV3+HtA/wCrba/8iI/+acVY9pmj zejOIPL+kywi7vBHJJKUcqLqQCqi0kA+XI4VXajbTafYz3s3lnSnit0LukMkkshA7IiWJZj7AVxV jS+fvKpQu2iWChftk2+oUU0rQsNLK+PQ9j4HFU8bS5de0D1LDRtNtodQg5W95HLJDOiuKq6rLYBk YeDL9GKsbl8g+Zk1CHT/AK1GJLi3nlRxLbEKIWjQnfTCeX78dajbpjaGTaH5V1jTrH6vd6dp2qy8 q/WrqaNZKUA4/udPiXtXp3xSk1z5z8vWt7d2VxoOnrcWTskyxxXk4JQkHi0GnSqenSvL23FVU40C 5ttf08ahpfl/SpLVmZA0puLduSGh/dz6fG//AAuKoi+0y6iW2kbQtLt1W8syZ4Ji0if6VFuo+qR1 P+yGKvIPPZMvnHV4KyXAFy9bSMcF3p/fSnt4CvTsc0Wf6z73pNMKxxO0duZ3/wBKPx7wxz8rdPvr P8ytCW5heL9+wBI+E/u26MNjmThkDIU7ftHPDJpp8Jvb9L37y/qNjLJa2UdzC97BreqtcWyyKZY1 aa+KlkHxCtR1GbN4RmWKuxV2KpF5qa4U6QbdEkl/SMVFkcxr/dyftBZD+GKo719f/wCWO1/6SpP+ yfFUi1rzlrWk6hHZyeXri79WL1VubIXFzCCCR6bPHbni/wANaEYqs0jzzq2qX4s4/L13bEsy+veR XdvD8AJrzktVFGpthVU17y95i1a5huY7yfTHi4ApZai6RuqvyIeN7R1JYHiT1piqV6V5e8xXUAuE 1TUB6VzPGwfUw3P6vcPEQwNjTi3p9gNvffFU/wBe8wa1o2mSahJpIvFjZF+r2Us087eo4Sqxrb7h eXJvBQTgVKbP8wtVupoYl8tX8XrTCAPNBeRqpZgnNy1qOKfFUt0pU9MKsn9fX/8Aljtf+kqT/snw KwTz7cXaWfmuW9EdoU03SSHidpwF+u3W/wAUce/tQ5j6oXjP46uXoYmWaIAvy+DFfyI1Gzu/NuoL b+rIyWLF7iY7tWaPYKNlHyAzF0cCJb9zt+1tPOGIGVD1ch7ihP8AnI+yu7jX9MeCJpVisz6nAVpy lamw37ZPUyAnv3OR7P5oRhISNWf0Mn8j6Hcat5I8o28N0tnJFbXkpke3iuKhLqP4QsoIU1oeQ3FM ytP9AdN2v/jM/wAdAzfypZx3f5e6PZSu6xz6TbQu8TGKQK9sqko6UKNvsR0y11yivkOJVK/p3WuN FCj684oFr0oB1G2KtnyLGTGf05rA9MKAReyVbiXrzP7VeffwGKptomjDSbaSAXlze+pIZTLeSerI Kqq8Q1Bt8NfpxVi+svYaVoM9/Do0GoX8t9eLHE0MdZHNzKfilfiq1p1ZvlU7GM5UzjAkEgXQ5WB9 6lo0ml65o9hd3GiW1leR38dteW4hUqsqqDIqsUXmoLU5CoNMGOfEE5cRhV8yAeYNX02QjeYbBfNs elny1bHSJJ/qi6h6Kc/rDScQnoqruqgBiXcKPoPLLTXDd73y3YRhIyIoUI3fFH5c9z5c/JbqlxDo +jIdM0G01K/nv9RWOGSOONeMV7KKGVhxUAbAbnwFKkYWr1Jx1uBd83K0mmjlPqPCNt/2c0xiXy/d XFhqqaVbhP0bqUhi+q7loZ7ZfscOZ3U026dMngz+JiE2GTTmOXg26dR18+SR6L5gi1K8udP1Dy7a 2RuEuHtP3UTn0FgLRyCSJXjUs0T1jLlt61oKZZDJZph5MuDjI4fVXON++gbRnmTV7TQ4tOhsfLlr qBMEM187RRp6cBH7yRajlKwVTRUB36kbVujW9mqajGXpoXxGuYFeZs7Dz/UiZm0WG41PVotJgdDp Gl3ENsbdTRp5rv8AZYR0J2BLcenxEdsfUZeDGZD7W7Hh5p8Hv6jp58v19HaDd2uq6bzvdDtdN1Wz vLFpEijVgoe8X0ysoRVZiqcjxO1cp0mq8UyHd+nybtXpRiog8QP7L259fj0eS/mXq9hbecNYhuHm mZbhv9CX4IxX4vjYAFg1a03+WYWXGTM+96Ds/SznjiYgR2+rmfgi/IUqr5x0iEXE6VuE/wBDuVq+ 2/wSHrTqd22yGAese/o0aqN45Hhidvqj+kfsD0jyt5dubXzF+mfWtfq17rGqK9vHZxx3BkSa8VJJ Lsh2JOKh2ow6EUpx33rzTK9d8naPrV5FeXbXUdxDGYke2uZrccC3IhliZVbfxGBUvX8s9AV43F1q nKORJt9RvDyZOnL958Snup2PfFW4Py10CAwtHPfgwMjIDeTFT6ZBAKE8ONR9njQdqYbVG+bbO0vB pEF3BHcQNqMXKKVVdDSOTqrAjArzzWNRTS/NtxbyaBpMmlwKT9QNvbi94s9EuGHFVWA8SoYFyWI/ 1cp4zxV5uRHECTcoCIhf8Vk91V7x3WOabeYtP0jSbLX7mx0fTROl+qJLcwQrbwqNPgkZpW4OyoKE mi/Mr9oZEdyA40vpJsbDr+PioeWYtM1e0gg1TQdPjv7O6tUnnitoFjmMgerxqA37tuHJa70PTuQe tcmRjQG4JI3q9j3bgfq83LGq+e301tD0xtPLBFsBawG8CNKEF0VooEAUNuCx/wCIjUnVTGUR3+qu XT7+XXk7MaTEcJle9c+nLcf1rod3mhfMkNjpGgV0rTNIt7qS+1AG71CCFbZFF/JGvI8Cx3YKoFBU j4ugbY5JEOt4TwEjh5tvqJh5/amtnZaHdRafqkvl+1in/RmpySWn1a3Dc4J7dBVd05bH9r7umGEi Y2W3LijHJwiQI796+69vcknly7hvLu70/VdD0iaO4F0LW5s4ISkIhjasMjMiO0yNGeY9MUqOlKG6 YAO18nHxgmBkTG7qhd138q8ud+SO81W0GmHRI9O0nSobeZIfWluraD98Tu0Fv8PxTsimgZh8m/Z1 Wt1MsctieXdt83ZaLTY8gJl58uncT5Wu8z6bYLovmRY9KW0F1o+kS3NhAiQMHa6uiysEIXkvT7Xb MjLInDZ2NBhpfRqBwyGxNHp7+X6GO/kPp9ha+bL823rRu9i3OCdSCtJo6UNKH7zmPopEy37nadrZ 8k8Q4qI4uY9xRn53uE8x2LGWeCloKSwrzQfvX/vFo230ZHXfUPc0dmC4EVE78jsfgyDyfeLH5e8t yNd3I52uofv7C2a4L/6Vh2RYrniMzNJ/dj8dXXa0VlIqvL4JroWo6THo1jDpmqaxLp8NvFHaSDTp GrEqARmv1Lf4aZkOKjTq0ANDqOsA+B02Tuaf8sWKtLrFs32dS1g7ldtNc7rsR/vF2xVsatA1eOo6 waGhppsnUf8ARlirC9X1PzG/13T7SObUvLd3JLE5ura4iciYkXCyL+jXUn13ZQo7d641aEKdd88J DawCza3sYpYf0cbeGfgT+yBGNMjULQ7AN0+4kABKtZ6l5rGrG8/R/p6k8QjubiK2meRQvNwhP6NR uJeUnlSu/TeoNore0Je6r5ol0xrf6mL3SvrDzXMV3DOyvcesZZ1XnpfEGK558eXUDtkJQEtiLZwn KJuJosu07UleTT5tTu9VtdZW2nUWkOnyPGsTSRepxP1Fa8eMfyrhAAFDkxtu1j8r2kV41nPqNutw ZpbuSHS2BLTH98xIsf2mT4vcYgAK3OfLVwLB7q61KY25R7B5tLYsCEMaFeVjueMxA/1sNoIVkvtI Gr3kv6T1g3r21ul1GdNkoIFecxEg2Pdml+7ARexSoQSaLbafZWekz3yWSXlmsVuunGC3/wB6oqhm W0iVfc8hkYwEeQplOcpm5Gy8g/MzStMuPOmry3MdxA7Tn/S0HOI0UDcDlSnTcDNTmmRM09VoNTkj iiImMhXLkfx80V5CnH+MdJhF5IR9ZStrcpSbb+RjxqB367ZXgHrG3Vx9VD93I8PTnE7fH8B6F+nG 0mya7vo9Uis4ta1Jbe6ibSltxJJe3SDed1kC0Zh8Y65vXm0ZJ57gQV9fUnoUVhHPoMhUyJ6icgkr cQyDkCe2Koq080XN5dG1tBqtxcKhkaKKXQnIQEKW+GU7cjTFUd9c8xf8sOuf8Fon/VXArG/Ol157 YaV+i7XUEmF6tPro0plL+m/Dj6Mw9/tbYVSS5u/zXbWbdLrT7WTVdvq6uummYIA0kZVjKx+1FKR8 iR3xVeb780lt9ZaexH9+P0kJv0c0PL6vEPiDS7j0vT9uuKFKCf8ANZLWza302JLKWaN4Pqw05VNx upPwyUYfD1OKo86v+cb3NxbWsCvfR0VoydNDqAFaj0mb7Kyg/T74KHNKbPewfopjeWGqnTxd3LUu zoRX6wk0rTFRJJ2cSHb9n2wqjFur5dSsVjsNbWdbScWaxnRBGLcPB6lKScevp0/DFUJZ3trKL+XT 9P1IyIji/e2/QIkCsW5BiknL4jGfpGKopteubSGxSaDWIRKqCyWV9DDGpSJeNZetZlX/AGWClSfz M99NZebfrltfq/6N0vjFcNaLMR9bujWNrNylP9Y1yjVf3ZcrRGssdwPfySb8kZQ3me8jFxLLxsn/ AHNwnGRP3sfei8h/nXMLQj1n3Ox7TjWMHhA35g7Hmv8AzvlEXmOxY3ElrSzFJFTnF/ev/ebGntuM dcPWPcvZkbgRQlv30fgmmjw2F15N8vLqN5NFamKd3nsUVgz/AKTtvRb4km4qspR6jpStaA5maT+7 h56uu1orKRRHv5sC0yC0Om2U8unXtxIttBIlxFc29uhAjQElGtfhO4J8e5r1ynETNbPSJP8ARo9O 1CXhQ0+t27cTxUIq/wCis68pJHSlAKiv7WKr3h079w1pp19Ld3Dzlo1uLZVjaVfTB2s/i9X1nACj b6cVTTRte1yximt9ItdRkmuZGuZoop7SUtK6jk/xWJbog2GBU81CG4uvK9zAsusaqZLyXlp4t4oA 1L5mL+qbLYx059eooKYqrxrdRaRo8Mt5q1gYLiGFLIWscqxJHyRAsgsV5fAoOKqGlJqtv5r1BVt9 XtNPuP3ja16cDmaQ7NS2+oFkrxSprvtX7IxShby2u7zy8bVP0rrMUupXy3Fq0EUCKn1q4rIzGxfl U7Mn+Ue22KE5Mty/mDTHl1TWIpWsLsuhsomZGMloSm1lRt+pp2xSlGiW97bLritaarolvKjyJOsF vL9ZYh3YtHHY/u92J698ULtWhv7j9BmKHVtWW29CVbpoobcW7VWrKpsSz8eIansO+Kou6Nydb14R X+rXkp0m0CWxtI4zO3qXtImY2JCKx25ce5602UrdBgu7bSLaCYanpgTULRY9PlijmjdBcwhWeZbO IqP2ac9gOuKHnX5gSiHzpq7+vcWhM5/esvqWzUA6g1C+H7OaPUbzPV6XSx4sURUZbcuUv2/akv5W a/qN1550WzuGWVGuARIR8a8VLbEU60octx4gJgjvdh3noccMMpx22+D0rW7gDR+LW1yy/p2+Aa6k aKxLLe31KPHLE4LerQb7sF8M27xSCm+sRlpZrW3WMIiuJLu8ADBSIRzN79niNqjoNsKr7OedTNfw xp688QW1mhvboCnptzHqC85FfWVD32B74FZTo11bXFoqXNrq09/GAboWl9dMi86lNjd8gCvj1xVQ 8wJaerpNNO15f9Pjryu7k1/dybCt0aHFUt1GUr5sgMdlIqKY4f8ASL28/SIRypZEpedW5NxHuPeq rd/6S23mEQ2GoCR7+CJRqN5dLbESW1qhSUrdAszcvh61JA+Sq6wa3l0TSXbT9RobwBDpt7dPalBI 4URk3J347NT9quKqkh2Ueb5WfT7n0ZEaKEpeXX6SaQIjcGJu6EDhKSo7cfA4qgbmO0k0eKA6Xdzr Lql6Gh2K8uVjcLdznjEBc0MoHt4k1xVM7IRvqWiNcWGrtO2mXBm+q3d0YWcvacmgZrot6Va036Ux Sk/lydZoNUM9qZJJbRZpP0Ne3bOzuhb1Za3jVjZWHCo3xQra0HC6P6GmyuiwGQDVLy8WXmkfINBS 6oApUM22wh4Kq3mmW0g03zfI0OoW0K6bpRcXcskk3+9l0OSNJLKQPbl9GY+qH7sub2fEyzRAq/P3 JT+Rl5Fc+ZLsw3v1uNbJ6K6hZU/fR/aI41+7MLRRqZ2rZ2PauIwgLjwm/hyP45oP/nIXVr3TvM2l NbOFD2Z9RCAQ1JWpX78s1cBKW/c5PYemhlxS4h2/QyryTquqp5S8sXdhbRzTy2l6ZIKPsr3sKFkV Axopbk3tmTphWMB03aWPgzyjzr9TB9FgupNCgjlS4j9S3jUn9G+qgDxIxKSfUpQ6t6ezFj79syXB R36BvmCiK4miW5jA5x6SqtSKQR1ctp3FW5LWhUeIA2wKvGk6m1zLPZzXNs8Qmmt1i01IxEEUuoje Sw4jhwIjLNuTSpriqb+V5dU0e6W/NmGe9b0raOa1MPpksAWT0YVIDBxuTuB9GKsjuo/Mt35Wvo5I IJYPrN0XSyknNwxjvXJVAE3+JafLFV8UPmm20fRoooLZIvrELol1JP66mQs/GSqdRyocVWWdl5lH nK6uPQP1pIv7yWS5FgVNDxipGFLfvO/h7YqlmqweZZvKzvNaG5it9TvZfq+lyTG4ZxeT9ggJWvvi qfen5st9f0qBY7FvR0+7jQtLOxKrJaCrMUqTsMUpXpFj5itzr8sNp6czKyTyXzTCN/TDoGgIjoyk JWvgRXfFDepWfmOeXQTPZmUssRjks5Lj6vGYytPrIC04t6h6gigJ2IGKouePzVPr+uwPFZ/vdJs0 k9KSbnwaS9H7v4Pt7mn0YpUdGi1228v2ryW621pPqFqZkvnm+uAi8ih4DL+1wBWp3BxQ8s8/ajax +e9ZhW/a1uVnPKOYc4GqoIpX7O3WjDNJqIHjOz1OmwSOGJ4OKNdPq/HwLGfyi/8AJkaF/wAZ2/5N tmTj+oO47W/xafu/S9W8xrbvok8YuJ/Wl1u8BivIJ209fTvL0rxcWtylW9T9kNVgvSmbJ8+S+XRJ 3mu5Y54WaVYuHKxuC7yR0QLK403cIjvwNPBaCpIVWHQNSkmYPNBJYD1Vjh+o3QYqVf0lY/o1k3Yr z+HxpiqJsrfXtM9caXdSW0bLRhBb3UR/dsyx8kXTgtAhVV+Lv+yOirI9cFv6mlEax5gcNfR7vZzb fu3+Jf8AQxvilKtR0jUZNZkurdr6VhPE0N9cafL63BF3dnFizc1ZVCUHQYoXalp814mrQWt5ql8T qMTvDe2UzxkR2kDpIyiyekiSqvGo6AHwOKV+nWV1a6dawXt7qtmVvlMNvZ2UyRLG2/KhslHqci1a Yoat9FvE8zC7M18loJpZDfpp0wvCskZAIb6js5bZzXdcVQ11p13d2MX1O41G9Md3qRYXljLIqM11 IqsrCzbiWBPqfdtiqNtbe9hm02KTU9Xhv4tOvESO3s5xCjLJbiJI1NmjenSnLbag6d1KE0nR7uxF 1ze+0+0NpKrGz0+WN2dSBCh52QHpiOvKvfptihvVdP1u4+ptYXF9eQR20XpyX1lcFo5GNJAhWxk+ H0+lOuKqXm/1P8K+cBNc3l1P+itJMz3sTwsHN3c8ljEkVuSlehp9OU6j6C7Lsj/GYe/9BY1/zjX/ AMpZqf8AzAH/AJPR5j6f6vg7/wBov7qP9b9BVf8AnJb/AJSPSP8AmDb/AJOnHUfV8GPs5/dy/rfo Zl+X9pPc+RvKwgtba8mW0uisF4Kx8fr8AlINGo4iL8dvtUrtmRp/oDou1/8AGZ/joGA6RBaSWtlH DKyuYIPXQSXqp/d1dx6en3K8gwA4rJSnU7Zc61EQtYJE0wuAzRqHVZ5NUKGKakZZgunQsXVn+FVJ 4nc+GKou30e1dXeW6m+GNGuXimvGEZkDPEUR9PUsHjViwWrKaAjCr0D8uNO0i/sL65ktIbhHuAQZ leTg7xJLJGguLa1kSNTIAoKdMCU3t9Csv0LdPYaZYyXwuLsW6zwp6ZIupAAxArSmKuu9D0/6lpLX mmWUd689v9bSGFPTEhU+oqkipXl0riqJh0KM6vOkuj6aNJCA28yxL65kotVZOPHj9revhtgVKrfR aeXrmTRtI0251EX1+I0vEEcfFb2YU5JG52AAGFUfcaDoY80aeg0614GxvSV9GOhImtADSnapwKpj RAYNX/SGkadFboJP0c8ESmRowh4kqKBqcTthVy6EOGj/AFHStNezaNTqLzxD1AKJx9LiKEkcq8vb FVsOhaP/AIs1ZI9NtGK6bYNFG0SBOZmvR2U0rxFTTArZ0f0tHtJ77TdPttVW9tC5s4xwUfXY6FGZ VevD8cKvnD83f/Jka7/xnX/k2ua3J9RfQOyf8Wh7v0u/KL/yZGhf8Z2/5Ntjj+oL2t/i0/d+l7V5 pl9LyQtHRHfXtQVRKIXVq3t4WXjcMkZqoPVhTr2zZPn7Cray09YF9YWzxTOC9qYtGX0ypJ+JhcvV aseleuKFOOysY7JbeEWNuZRQAW2j0iUyVVWCzMppxHTw3pirNdG8qeRLS+muNS1vQ9Qiuoyt1Alv ZW4kcurh3ZJGbYovXwGKWRa35l8pRjRYYNVsFihvoQqJcQ0VFikA6NsBiqaP5p8vm9hkTX7BbVY5 FmgM8BLuxQxsG5VHEKw964FS7TvNHl03XmARa3YQyyXa+hK08TKD9RtlDcea8gGHjird/wCaPLy2 ulpPrlhPcJcQevKs8KhmAIZ+IY8QTvhVME80eXheyyt5gsWtXjjWK39eAcHUvzblyqeQK7HpT3wK gPL3mry0umzKNZsEc31+RzuIjsb6Yg05r1HTFW7jzV5XPmjT3GsWPAWN6C31mGgJmtKCvLvQ4qit Q82eWDp94DrVg1YpOAFxEDTh0+2amuKu0/zX5YGnWYGtWCkRR8w1xEduAqPtihxVhP5l6lp1/ofn KSwuobuNNK0pXeCRZFDfXbo0JQnfKs/0F2PZH+Mw9/6Cwv8A5xr/AOUs1P8A5gD/AMno8x9P9Xwd /wC0X91H+t+gqv8Azkt/ykekf8wbf8nTjqPq+Dh3c/u5f1v0Mt8i2lhP5G8qve6THrEcVneFbZ4k mYF76BC6rICPhVizd6DMjT/QHRdr/wCMz9/6AwfSRptvo9oX0kt6SW1CItMYMGTcAPAzspLAksaj 78vdajbGPTnuYZ0sY5oZGWD0pY9KEYkjlEDqWS1LCTkdx4jtvirTrYTvGi6MLdwkrzqV0pfiMfFU lDQ0Qp6JZQjqatvirINJ8l6NqFlAZpNNkjmZZJLeWSzguloprEz2lrHxO9WC4FRuoaF5fXQLe7aw 0XTLeXUJ/Svo1jlEoM05SKv1R14MBWvgNqbEKt6L5b0ObR7GS10zSNWjN9Ghu5EVW+yP3ZBtFNO+ /jiqDi8u+XB5lhtmXSjO15cCOw9IhHKyKGgLtaFCI6cdvh4xVu/8vaFDYRvc2Oj6XW51RVLJyEgW +K/s2w/u9lUV6Hb2VR2ieWNGkk0gwaPpGowSaffut66isvGe3Adh9UG61oNunTFUq0fy35fM7Bf0 Vqc72csiWpjCKyn1CHo1o1CN6CoNAO2Ku8weX/L0U0CXDaXorixt5WtIoo25J6gHqktZSGrsOB4k fDX2ZVUyl8s6R9avyNI0hIE03SpVvOAeoa4uf3nFLUGswUK3EDb8FVPytoehAPc2UWl6jJDeabzu IlCyWzfWV3jrbIQzftDl1HboFXkP5u/+TI13/jOv/Jtc1uT6i+g9k/4tD3fpTb8sNAax8+6JLc3M S3An+C1U8nNUYHw6DfKsOW5ig4PaGt8TBIRieGub1DXP00PLUpRFltxrd4bJLf6z9ZMgv70yBhbl XK/Z4qh435VBpm3eMYxe2Hme6tU9Gw1JAySCEFdbWRQVZVMgMiUajV6j23FMVVobbzDLfNY29peQ 2mov9Vgec65GYgxcD1pDIBCeJ5dRWtPDFWSyflx5tvIbgXV5DbzXDySFoL/VWUPJUHiDLHxXZaKN hvShocUq1l5Mv9K1u01TUZ/Vubq/tzSK5vJYzIYZBKxindo1qVXjwUfqooZ7L+l/0jF6Qt/0bQeu WL+uGo9eAA4U5en1/wAr2wJS+x+uev5j+piM3f1xfQE3IR8/qFtTnxq1Pliq68+v/UtJ/SAiF79Z g+si3LGL1KHlw50bjXpXFUXF+nf0vN631X9D8P8AR+HqfWfUon26/u+P2+nt74ql+kfpD9B3P6PM Iu/r99wNwGMdP0hLzrwIb7Fae+Kom5/5SrTv+YG+/wCT1pirn/TP1HVP0j9X9PjN9TNvz5elRuPq 8/2+PGvHatcVaUaydP0v9Gm3C/ufrhuQ5PocRz9LgR8dOnLbFWEfmx/xx/OH/bJ0r/qOuspz/QXY 9kf4zD3/AKCwL/nGv/lLNT/5gD/yejyjT/V8Hf8AtF/dR/rfoKaf85A6RJqHmPTW9aOCGGzPqySG gHKVqU/4HK9Xk4ZfBw+xdUMWOQokmXRPPL0GrweTPKsegTevMlregyD1FVkNwlT+7q2zUzL0xuAd R2lMyzyJFHu+DBdOk0xrPTlvLPQriFoYVuGvSyXFBEE+w8Miu/FmVm5DL3BTWO78rxtHJa22hW6M JbsyVUOsfGkUwQQoTW6Rg5JFAO7bYqhoL3y3LHaNaweXLi4BaaSRWRE5ERl5IqRyMGLmTx7VNcVZ D5fi/Lq4M0N/a2n10TCKGGzEMvFOMYWMllDBvUcjiABuNt91WSW1jcR6ELbS4b0vBdTrBFcBvQWN bmRSAEBIZU2HvirSxalFpmmJqaX0d99cT1lsg4gpzbhw5jlXhxrXvXFVZLXXhriSfV510sNIXlUS G7PIEqR8IRTypy3NcVQcMGrSaQ36Mhu5rgX2oV+uc/TCm7m6emrHlWnLFUTbR3a6tpK3y6it3+j7 v6yluD6fqGW1L+ny+LhXxxSoW9p5giF8b+CaKz+rOIWsxIJedN+fMceB3O349cUN3lrr8lpZtpVv NLSCLlLe+oWDKP2fTU1Hhvtiq+aO5bX9aW0XUWuTpdkLdJwfT9QS3nD1ePxcOVOnvilUsIdbSADV knikOpWn1UW/qej6AuIeIn9QCrcuXTalMUPB/wA3f/Jka7/xnX/k2ua3J9RfQeyf8Wh7v0ss/L5G h84aQohhso5LgEQseVxLQE1Jr9J+1mLp98g6uj1Z4sctzMgc/wCEfj4M/wDMptYvJkUs9Egj8w3z SSBkjKK1/diRwzxXCj4Wavwb9KrXkN482wb69YXNohbnDVGa3nj1K2YvQHjyC2C/ZanL2PU4UKlj ci5W00xZBJfXzyQwf7kLL1HKsjIU46au7NGYzX7AYk8tsCs30j8sp72KQ6o99pEqcUiENzZXXMUq zGtmqj4jTcY2qvdfl5p2narpd1JdS38LXsMaWtzHbFB+5ZWZuEScieFfYk+ONqyibSLFNSggj8v2 kllIKzXvGFfTPFzT0yvJt1Ubfze2BKCsNE0lLnzA0Ok2txLHeL6MBjiWv+g2x4hitFqTiq2bR9Pn 07SJ73Q7WwvJbiBrmz4Qy+k5B5J6iLxeniMKo2LSrVtYmtZPLlrHpqR8otRpAfUf4fg9ELzX7Tbn w98CoLR9F0xNFuJLbR7S6uBf3ypEyRRgj6/Ku7lGoFXfp2wqr3Og6EPNGnr+jrXibG9JX0Y6Eia0 ofs++BVS40XTHsdTE+i2tusQkS2f04X9WP0g3qUC/B8TMvE77V74qprpNjBp2mm00C1vfUECT/DB GY424h5PjX4uKktQbmlO+FWIfmdY2VpovnJLS3jt0bStKLLEioCfrt1uQoGU5/oLseyP8Zh7/wBB YR/zjX/ylmp/8wB/5PR5j6f6vg7/ANov7qP9b9BZH+dsTP5ksWW3ilZLMETTn93F+9fcjuT/AJnK NcfUPc6rs2VYzciN+Q5lmP5dyepo3l5/VSatjffvYxRD/pUX2dzsOnXM3S/3YddrRWUiq97yrSLh buysE+sXcJZYbWq3NzGp/drGAGWzki4gt09TYZkuImdwt2A0rTXTaZIh+rmK7vlclmYRxFPqA4jk jcqtUDem4wKptfXvIXkb3Su6mF4jcXyR82ULRmNg1eI+LlTrXwwqn2iaBrPmW5lv7W8ubexM8dtc vFcz20sY9JZZzD61svqBZWHE0Wu+/wAOBXpFjJdR6PcvaRCe5W5vDFESFDH63JtUkAYErLx7uSx0 d72NYbx57ZrmFDyVJSpLqrdwGqK4qi4JtXbVriKa3RNNVQbe4DVdmotQVrtuW7dsVSmzm1iHy9cy aRbx3V8L/UPThmbgh/06etWqKfjiqPuf+Uq07/mBvv8Ak9aYqtafV5LTVlv7aOCGNZRZuj8zJH8d GYfsnjxxV0c2rpDpCWVvHLayRoLyV24tGoCUKiorUFvuxVShLjzdq5jHJxpmnlB4n1r6nUj9eKuk m1WbQraTVbdLa+N3a+pDE3NQBeRhaNv1WhxV8x/m7/5MjXf+M6/8m1zXZPqL6B2T/i0Pd+llf5dq h84aVLbxBoWuBzvZyTLMaH7H+T+FOgzFwf3gvvdHrCfDIkd6+kco+/8AHvLMdbtLc6PLNBJqEV/H rV8waO4vxD8d5eKPSihniWo4/EUpTqe+bx5pKLO58yzoS73kbSKJIuTeZFVVWRVdXJ1DdytWUDxB 3HVVSlk8zRzTO4vJB6cRSNX8xMI5ubci3+m8iTHsah5aYqqyzeb5LyS2tYdQRpGLWvrnzGCsXUeo P0ipLU2qKfLFKaaXY3l5fafFq8eqRM17H9XYz65boFCSc+TXV1KvI1Xjxodm7YoZ3NoWjRX9vZFt XZ7ivGVdQ1MxLRWb45PX4j7FPpHjgSgbHy3pUNx5gmeTU3W3u1PCHUNRaRgLG2agVJ+Ttvt37Yq1 eeXdHvLDSrpJNViS6nt3Ec2o6ikqhwWoym4qrDvhVER+XNDfVZNOB1wPFH6huW1PVRAQePwrJ9Zo W+Lp7HwwKgbDRdH0/wAv3V5IdXuFhvL8eja32pSysFvZgKIk+5oNyfmTXFUXceVdL/xNp6CfUOLW V6xJ1LUOW0trTcz8h9rcf0xVz6Pot3b6rFGdYieyWSN2nvtTRHPE/FGXno67dRiqjLp+iabY6eJh rU5nhBBtr7UpFXhHyo3GcAFuiqNyegwqk/nPSLS1svNltGlxdxSaZpbPFNczXEh/0u6FFe4kdh0r QMBmPqj+7Ll6GRjmiQeHzYt+Q9hp9r5t1A2plRmsWDwTqVZaTR9CQKj78xNHImW/c7ftfPknijxV 9XMe4oz870ifzLp6GBrmU2gMUFaRVEr1aTtRff6Bkdd9Q9zR2YSMZN8Ivn19wZV5QsHvtA8vwvdy Wziyv6zWL+nQmeNKAkN9nl37gHMzSf3YdbrK8U1fxec2T6Q3la2F4U9NYokNdWMJPJVDn4ZV9Lev w7U6ZlOKrXOo2MdlD6kMLackSGK6fWU4iMSOsT8nk5h5i1GO/bAqlc3NnbSshtlLgFHaXXGG0nKM giSXkwWtPbovTFWXeW/InknzBaQ3Om60969sieqttfXMqxuwoQxjuOLGqEVp22xtLMPL2laja6T6 EOpGOC3muY0DRK5Cx3Ei1LuSx6dScVb1iz1dl09l1UMrXcJVhBGQQa0IIOKpiLXVS5QasC6/aUQx 1HzFffAqVeX7bU002Z21VYk+vX4q0MYFfrs1dye/XCq+4stX/wAUaeP0l8Rsr0hvQTYCW0qKV74F RWoWuqtYXgGqh+MUnNRDH/KdjQ7YVdp9pqwsLQfpUKWhQqphjrTiOm/viqAtrLVv8X6mP0lRhp9g Wf0U3HrXtBSvahwKi9Rt9RNtBK2pC4hF3aclWJAGpdxgjkp8cKvBvzO0rS7jznq8tys1s5nP+mKO cTUUD4qcuNOm9M0uaZEzT1nZ+pyRxRETGQr6ev4+aXflzq0+o/mjocjErCs7CGLsq+m3bxy3BDhI cvWaaOLSTHWtz8XvOpfl4+oW0tlcavK+my3U94LF7e2kjDXEskrKecZLrWZtmObR4hLpfyb0ibea 5SUhiwL2VkxBPhWI067U6dsNq3L+TukTTTzy3EUk1yeVxI1hYkud/tExb/aOKphD+XkkGp/pSDVT FqFKG5SzslehXj1EQ7HFUXdeVNcumgabzJck20onipb2go6gqK/uvBjgVX/QXmT/AKmW4/6RrP8A 6pYqo2/lbXYJbmWPzJch7uQTTVt7Q1cRpEKfutvhiXFW7jyxr1x6XqeZLk+lIsqUtrQfEvT/AHVi qr+gvMn/AFMtx/0jWf8A1SxVRtPK2u2kTRQ+ZLkI0ksxBt7Q/HNI0r/7q/mc4q5/K2uvexXh8yXP rwxyQofq9pThMyM+3peMS4qqS+XfMMsTxP5luSkilWh2a0GzCh/3VirofLvmGKJIk8y3ISNQqj6t Z9FFB/urFUj856Dc2flXzBe3l/cancXVvawGixQuqW87OvD0hHvWdjmPqv7suVoj+9jy+PJiP5Iz B/M94guXm42T/uZ04SpWWPrstR9GYehHrPudj2nCsYPCBvzB2PNAf85F6nc2ms2EEB4fWbOjuOoV ZX2Hz5ZZqoXME9zl9g6eMwZS/hLMfysu4rbyh5WeRZGBsb5QIopJjX61Gfsxq5+nMvB9AdV2v/jM /f8AoDCNHs9bm07T5be/aO3W3iIRr3U0jVWiQcfTit5F3YfZ6A1oaZc61mVrpPlm40mG21XVtQ+t RLyn9CS8dR63KMUkkhWQo4TZW+GoNBXkSqrTeXvJjss761riDioPGa9RWoipyfjGObMI/tNU1xVs aV5Oirx8w67CWNDwub2OpccRsqKK+G3XFWRabe6XPpE1ncRXckL3F0H/ANGu6kfWpCPiWMGv04pb ubjT4LPTLOwtbpLaxmgWOJbS6okMS8QN46/CKYqiIm8vxarNq0dpdDULhBFLcfVbwkoONFoY+I+w OgwKl8EOkX2iz6drFldSwSXl5MYTa3YBWS7lkjaqIOquD/bhVGT6lC3mGyulguzbxWl3FI/1S52e WW2ZBT067iJvuwKt/wBwlrb6i1jZ3SXF8sjTUtbw85HLv+1HQVeRjt44VWhdDuk0ye+tLt7vTUU2 5+rXo4PRORoqBW3Qda4q1HeQt5j1K4lt7v6nc2FnbpILW6HJ45bsyKKR8hRZl399sCrf9wun6Ta6 XplrPbWyXlsYo2trpVBkvUkcl5U7sxO5wq8Z/MCYQ+dNWf6zNaE3B/eSLztm2H0L965o9RvM9XpN LHixRHDGW3TaX7ftYp+UX/kyNC/4zt/ybbMrH9Qd52t/i0/d+l9cZsXz92KuxV2KuxV2KuxV2Kux V2KuxV2KuxVi35ozQw+QtWlmZ0iVI+TRGjj98m4yjUi8ZczQRMs0QKvz9zzz8jbuO48yXZivReRi yenJQsq1lj+1Slf+BzC0Uamdq2dh3piMIC48Jv4dfxzSb/nJb/lI9I/5g2/5OnL9R9Xwdl7Of3cv 636GXeRAG8jeVF/SaaUTZ39LhzxB/wBIQcftx+PLr2zI0/0B0Xa/+Mz9/wCgMQ0O01l7SOY29u7f VrcQvN+hg4VI/T4qZ151KpQhwDT7RbLnWohNP16702eG4sbG3llcNwP+HHWkDs0J+ywZviB+IfC1 dz1Kqbafp8OnvIl1p1rrmnOCVspW0S1CyIUZJP3cmx3dQoanWuKpzpj+T5tWs2uvJml2XMVlvpJ9 Ml+rsvOiqEZmNQFNV238RilmOi6/oS2cgbUbUH61dmhmjGxupCP2sCo4+Y/Ly0rqloKmgrPFuf8A gsVb/wAQ6B/1crX/AJHx/wDNWKrV8x+XmFV1S0YVIqJ4juDQj7XY4qoDW9DXUXmOtWpSSFUS19eO gKMxeQfF35qDt2xVEHzF5fAJOp2gA6n14/8AmrFXDzF5fIBGp2hB6h24/wDmrFWh5k8ulyg1S05q AzL68VQDUA05d6HFUJq2t6NNbwxQ39tJK93ZhI0mRmJ+tRbAA1xV4V5+1C3j89azAuofVrgTnlDO oaA1UEU6U2P82aXURPGTT0+mwSOGMjDijXMfV+Pgxj8ov/JkaF/xnb/k22ZOP6g7ntb/ABafu/S+ uM2L5+7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYqwz84/wDyWmuf8Yo/+T8eU5/oLseyP8Zh7/0F5R/z jX/ylmp/8wB/5PR5Rp/q+Dv/AGi/uo/1v0FV/wCclv8AlI9I/wCYNv8Ak6cdR9XwY+zn93L+t+hO dNurO3/Kny59dIS1e2mEs7OY0jCanbvUussDKaL8JDUDU5fDUZkaf6A6Ltf/ABmfv/QEtt9QeNlS 41Sw+sFmabjqFw3wCiv6cL6g1OI36+/euXOtRU15KFjJ1O2Ji+K2X9ITBeJLSMWYagzHkQ1Kk7Cg 6Yqith2Dy1WuvXf1m6DTNaiwvGKIJUcS84pry4Aosh5g7Dt2xVPNNv8A8v5tQsXsJbue6SaNrNF1 GKVZHPxIOJumWQh4rirJrW41O50eaCCyvLaRry4YTo1sSAt67Mv+9Cn4gOJocUr9Svb+O30yKTTr uR47mBWlZrWrlQQSaT9T1xVEJLrC6s94bW9a1aMotlW14hjw+Ov1jtwPbvgVKrN9XvfL11a2lte2 U0l9f0uojall/wBOmJABuF+WFUdc6jef4p08/oq6qLG9HHla1P7603/v8CrWk1e2tNUee2vblJ1l eJHNqBEp5txH+kGtAwXtsB3rhVtJNWuLTS3gtb23SBYnlRDakSqOB4n/AEgdQpH04qpQahenzdqv HTLpWbTbACjWtV/fXtG/v6d/HAq7nqlto9pZ3lvd3EovLb1L6Y24rzvUYcgs8jUUGm3hhV83/m7/ AOTI13/jOv8AybXNbk+ovoHZP+LQ936U8/LvR7YfmFo2oWDgW63BE1s3wyRMyMOJX5nKMGQ8QBdb rNXL8vLHP6q2PQvpzNw8i7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYqwz84//Jaa5/xij/5Px5Tn+gux 7I/xmHv/AEF5R/zjX/ylmp/8wB/5PR5Rp/q+Dv8A2i/uo/1v0FOPz+0+0vtf0+GWUQ3P1QfVnb7J PqvVT8/vyrWSMZj3OB2NnnjgSBcb3/Wi4I7qw/LLy9bMJlm9CeF3tpGjZA9/COfOOOZuNDvRDmZp jcAXWdp5BPPKQ5H9SW/pr6vPG0F1cXKxLzWCW4vyCzj95WtixPpuW4/F0G4y9wFsFxHNcTzLf30T Lah9rm/NGVyxTjJYGNQI+bV8RSlKYqvW9SW1eFdTuweSlWa4vi59JW5qOVgPhJcFj/qnrTFUy8ow 22t6k2nXd/fRPG3rxPbz3julzQfAGnsoFCx7nc7ECuKvUtOuYrXSLq5lr6UE99JJTc8UuZWNPoGB LetGo080pW8h3P04qjhcxm7e1APqJGsrGnw8XLKN/h5DiqS6XqVtpug3N5dFhDHqF8rFFLtWTUZU X4VqerDFUVc/8pVp3/MDff8AJ60xVXvbmOax1KNQwa3R4pOQoCTCJPh8RxcYq6zuY4bDTkYMTOsc ScRXf0i+/gKIcVQdp/ymeqf9s7Tv+T99ird1qNtqOjw3dqWML3lsillKEmO9SNtmANOSmnjir5g/ N3/yZGu/8Z1/5NrmuyfUX0Dsn/Foe79LLfISvJ5y0ed0iugJwE1CFgppQ7Oo6/QTv2GYmn+se90W pIGOUQTHb6T+h9F5vHnHYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FWGfnH/5LTXP+MUf/J+PKc/0F2PZ H+Mw9/6C8o/5xr/5SzU/+YA/8no8o0/1fB3/ALRf3Uf636CyT87BI/mKziQQyh7Ic7WbYyASv9k7 0K/LKNd9Y9zqezaECTY9X1DorSXmn2XkLy9HexiKGaGeJraZ5C3E3sHPiYZYnPFdxR8zdJ/dh22t N5ZG7YrZ6nYSs89xDbi3tirRxiTUI7h+cojmBP19VkHoluFa02O/TMhxVM6tZiC1SZYZecjPIUGo IVLVUCiaktFHEfarUdak1xVkln5c0ia1XUIfMGm2d3cLHcRw/XrlFjZyXZHjluZmQheKtxala7DF Wa6bYflXpl7b3tjfWcNxaljCw1FmUc0ZDVGmKt8Ln7QPj1wJTHRfNfldbOQNrFip+tXZobmEbG6k IP2u4xVbrPmvyu31HjrFiaXcRNLmE0Arv9rFUx/xb5V/6vNj/wBJMP8AzViqV+XPNXlhNPmD6xZK Te37AG5iBo17MQd27g1xV1x5q8sHzPp8g1iyKLZXqs31mKgLS2pAJ5d+JxVF6l5s8rHTroDWbEkw yAAXMP8AKf8AKxV2m+bPKw061B1mxBEMYINzD/KP8rFUBa+afLA836nIdXshG2n2Cq/1iLiWWe9J APLqOQr88VRmqeZfLlzDBBb6rZzTyXdmscUdxEzsfrUWwUMScVfNH5u/+TI13/jOv/Jtc12T6i+g dk/4tD3fpZT5JHo+btMu5reGMibkb6GQLAaKd5Qabf8ABZiYJVMb/N0eoleMxEj/AFZDf4fgPVIf NfmuSCMRXvluW5FfXR72ReJEjdPTWX9jj9ObIZT3x+brpafCDuMoH9UfppePN3mZVUzzeXLZmrxj k1KTlWpA6RU8OmEZj3x+aBpsJ5eIf80frc/mnzcrRtz8v+iCGnZb52qgoW9MsqfE3Ki8ttjUiowe Me+PzQMGD/bL/qhMNF81zXVvdy3t1pMUlT9RhgvRKRsaC4YCgNafYrk45u8x+bVn08YkACfnca+X 7Uut/OHmGFbdb240F5nhrOgvvRZZeYpSvq1Hp+H7XemQGY98fm3HS4jZj4lX/Nvb7FG787ebEBMK 6CoJcKz6kCOIB4kmkf2iR06U99k5z/R+bKGlwnmcn+lTHSPN2oXWj3dxeS6RBqAQmxhjvVlj5cKh ZnXpRtjxOSjm2NmN+9pzaeEZgDj4evpo/BAp5w8zxxJK8ugXETRxDmL/ANKktB6tT+8Ujl9kD7zk fGl3x+badNhJr94Dv/DezX+NPNi3ih5dFNsi85oo9RQzEcuPw8uCj7Jap2oR3BqPHP8AR+a/lsPD znf9XZE23ni4k0CWa4vNFttb5fubZb+OaLhUfaasfxUrtWnvk/F9PMX70S0QGQADIYd/DRQt3561 uOaRba48vTxcz6Uh2IIQnYMtDUjxrv4DAc0v6PzZx0UCNxkH+Y5vP+tn0wp0BS1RKTqysFNaKR+7 UsKbnHxj/R+a/kYf7Z/pP2oWD8wvNRmCyr5eEZJPqfpVBQVIAIAf4gKHw/gBml/R+bYdBirbxf8A SJP5983X+o+RtetdRl0iNHt4/qyWN+tzM8gnQkcKLtx328MjPITEg05Gh0sYZ4GPHz3uNDkxX/nG v/lLNT/5gD/yejwaf6vg5/tF/dR/rfoLI/zuhaXzDZL9Wiul+pqTE7ch3lfeM06j6Mo1x9Y9zqez ZcMCbMd+fT4p1ok2nzfl9pFimsxaRdRF343F0YrhaSSUWqyr3p9rkOP35labJEQFkOHq8U55ZEDi /qjZBJL5wji4nUoWRZPhmOuoGMTUUs1bZgOKgsoq2/Untf40O8OJ4Uu4roX8xcHFvr0d1yBiP+5q KijZxJy9BmDVXgeux6d8fFh4hMsE484kfBQu18yq1xbr5hjqzSC3La8kbslQUO1sSpI6jenjj4sO 8JGDIRYia9yIvf8AEsFtMlvrCMAg4ST64icmJUsDJ9XYqPA8a7eBx8aHeGIxTJoAtWVx5h53AfWo JFu5QRImtoy28BmRnEXKE1cKG4ll6fDt1x8WHeGRwZBzifkh5rjzSI2EeswPdyKyNbvr8ZA/eD41 YWzGvBAV+HuRtj4sO8KdPkAvhlXuVoJvNCSutxqNtPJCsE1tC+uKWZ7f4CnEQJVJEdmZ2apYL064 +LDvCPBnV0a9ynJc+bfUcjVLf0YHciYeYEoxcLyWUG1ooUj4Ke9cfFh4hfAny4Tv5NzS+ZInthJr 0ER48pQ2vICrAcQN7Yeop3qSBv2x8WHeEx0+SXKMj8CmOj+btfsrWWOS70e6dyZUe71qN35FB8FU hCooI7A4+JHvDL8rl/mS+RZbp3nLQpLGF7/VNNt71lBnhjvIZEVu4V6rUfRj4ke8L+Vy/wAyXyKJ /wAXeVP+r1Yf9JMP/NWPiR7wv5XL/Ml8i7/F3lT/AKvVh/0kw/8ANWPiR7wv5XL/ADJfIvln81Lm 2uvzB1qe2lSeCSYGOWNg6MPTXcMtQcwJm5F7rsuJjp4AijSe2n5L/mxaNytrRYj1IW5hofmOdDjL TyPMOHl7V0c/q3+BTeP8r/zIn4jU9DguCvSeO4gSUfIh/wBRGVnRzHJwZavTR/u8hj5EEj8fNFH8 rPP6IVhtfViPW3u5beQU8OYk5ffXIflMnd9rj/ncJO+x742Psr9S2H8p/OqisOnPYSd1hubd4Sf9 R3p9yjCdLk7rZT1+M8yJjzBB+f7VrflT55klrdaRFIw6XcFxFDN93qf8b4/lMnQfcka7EB6ZEeRF j7v0Kj/lZ+YQXgtolzF/vq7a3Yj/AGaSD8QcH5TJ3fawGtwXf0nvjf3EIdPyn8+q3JfL+nxt2cSw sR9FV/Xkjpcnn9n6209oYSP7zIfx8UQ/5U+epErd2RugPs2yTW8MPyYeoWI+ZPyyI0mToGuOuxA+ k8PnuT9zX/KrfP5pcSaaklym1tAJ4Fgi7V+3Vj70+VMfymTu+5fzuH6RKo9TvxFDaj+U/wCYxs3t 7OwDTXO95cyXECs3+SoDmi9qeGShpZ3ZDdp9fp+PimaEfpFFIP8AlRH5l/8AVuj/AOkiD/mvL/Bn 3O0/lzTfzj8i7/lRH5l/9W6P/pIg/wCa8fBn3L/Lmm/nH5F3/KiPzL/6t0f/AEkQf814+DPuX+XN N/OPyLv+VEfmX/1bo/8ApIg/5rx8Gfcv8uab+cfkXf8AKiPzL/6t0f8A0kQf814+DPuX+XNN/OPy L0T8lPy482+VvMF9ea1apBbz2hhjZZY5Kv6iNSiMT0U5dhxyErIdP2z2hiz4wIGyD3Kn51fl75u8 z63p15odussdtbmORzLHEQ5cttyZT0xz4zI7Bj2Pr8OGEo5DzPdbDrT8r/zehX05rCG6h6GOaeBq j586/fmJLRk9KcvJq9DI2CYnyBR8H5UedlXlDpr6fL1KQ3Nu8Nf9Rnp9wGQOkyd1uLPX4+shMeYI Pz/a5vyp88yS1utIikYdLu3uIoZvu9T/AI3x/KZOg+5I12ID0yI/oyFj7v0Lpfys/MH0+h2FLyA9 YLuS3r/yMVz+KnANJk7q+LGOtwXd8B7439x/W6L8qfPEa1tbOSzb/fJuLeaH6FaSoHypidJk6i1l r8R+oifnRB+79ajL+VHn52rJoVhO3eRpIkJ+jk/68I0uTz+Y/Wzjr8I5TyD8fBWi/Kz8wwvAWMNn FTdbVrfl9DNJT/hcB0mTuv4hhLW4OdmR/pX+j9bl/KrzyrNHBp31eJ957k3ED3EntUyGnzr8sfym Tu+5TrsXOR4j0FERDQ/KrzsCo/RQW1tt7W0E8HxONw8jF/H5+OP5TJ3JOux/zvVLnKjy7h+PJIL7 8lfzSvbp7mawjLuen1mCgHYD4+gzIjp5AVTtMPa2kxxEQT8ih/8AlRH5l/8AVuj/AOkiD/mvD4M+ 5t/lzTfzj8i7/lRH5l/9W6P/AKSIP+a8fBn3L/Lmm/nH5F3/ACoj8y/+rdH/ANJEH/NePgz7l/lz Tfzj8i7/AJUR+Zf/AFbo/wDpIg/5rx8Gfcv8uab+cfkXf8qI/Mv/AKt0f/SRB/zXj4M+5f5c0384 /Iv/2Q==
  • Adobe PDF library 10.01application/pdf
  • Alik Sayfutdinov
  • gto_norm_03_eng
  • 1TrueTrue104.999997148.000010Millimeters
  • Cyan
  • Magenta
  • Yellow
  • Black
  • PANTONE 872 C
  • Группа образцов по умолчанию0
  • PANTONE 285 CSPOT100.000000CMYK89.99999847.9999990.0000000.000000
  • PANTONE 286 CSPOT100.000000CMYK100.00000072.0000030.0000000.000000
  • PANTONE 368 CSPOT100.000000CMYK63.0000000.00000097.0000030.000000
  • PANTONE 661 CSPOT100.000000CMYK100.00000075.0000000.0000005.000000
  • PANTONE 872 CSPOT100.000000CMYK20.00000030.00000169.99999915.000001
  • xmp.did:ad5746e4-40f4-4df2-a0dd-8ce148479f81uuid:a4c33fb4-763b-c24a-a533-768ad29596d9xmp.did:ea23c21a-bbe9-4f71-ab33-f61c022c02e0proof:pdfuuid:442adba5-f05b-0d48-a507-3ffa9c4db14fxmp.did:d2a3e9b2-404a-4db7-af14-51bdfc7a0cdexmp.did:ea23c21a-bbe9-4f71-ab33-f61c022c02e0proof:pdf
  • savedxmp.iid:ea23c21a-bbe9-4f71-ab33-f61c022c02e02017-06-30T14:50:54+03:00Adobe Illustrator CC (Macintosh)/
  • savedxmp.iid:ad5746e4-40f4-4df2-a0dd-8ce148479f812018-02-07T10:10:38+03:00Adobe Illustrator CC (Macintosh)/
  • endstream endobj 3 0 obj > endobj 9 0 obj >/Resources>/ExtGState>/ProcSet[/PDF/ImageC]/Properties>/XObject>>>/Thumb 891 0 R/TrimBox[5.66928 5.66928 303.307 425.197]/Type/Page>> endobj 10 0 obj >/Resources>/ExtGState>/ProcSet[/PDF/ImageC]/Properties>/XObject>>>/Thumb 900 0 R/TrimBox[5.66928 5.66928 303.307 425.197]/Type/Page>> endobj 892 0 obj >stream H|n$ z:zd«xKV`2$A_=t5Q:o?~e-3y{q2[:sG-̃OXC

    Глава хунты Мьянмы Мин Аун Хлаин. История генерала, которому нравятся парады в Москве

    Автор фото, Reuters

    Подпись к фото,

    Вся карьера 64-летнего генерала Мин Аун Хлаина связана с армией

    Главнокомандующий могущественной армии Мьянмы Мин Аун Хлаин фактически возглавил страну после военного переворота, который произошел 1 февраля. Что о нем известно и почему о нем говорят как о стороннике дружбы с Россией?

    Всю свою жизнь Мин Аун Хлаин посвятил Тамадо — так называются вооруженные силы Мьянмы. Он не новичок на политической сцене: командует армией с начала процесса демократизации в стране, который начался с 2011 года, и принял эту роль у предыдущего военного диктатора Тан Шве (управлявшего Мьянмой с 1992-го по 2011-й).

    В ООН его обвинили в причастности к преследованиям мусульманской народности рохинджа, в результате чего погибли по меньшей мере 10 тыс. человек, а 700 тыс. стали беженцами.

    Теперь Мьянма возвращается к военному правлению под его руководством, и Мин Аун Хлаин, похоже, намерен расширить свою власть и определять ближайшее будущее страны.

    Путь к власти

    64-летний генерал провел всю свою карьеру в армии Мьянмы, куда он пришел как курсант. Он был студентом юридического факультета Янгонского университета, а в 1974 году поступил в Академию оборонной службы с третьей попытки.

    Хлаин служил в пехоте и регулярно получал повышения по службе, но больших заслуг за ним не значилось. К 2009 году он дослужился до главы Второго бюро спецопераций.

    Автор фото, Reuters

    Подпись к фото,

    У Мьянмы вторая по численности армия Юго-Восточной Азии

    В этой роли он руководил операциями на северо-востоке Мьянмы, в результате которых десятки тысяч беженцев из этнических меньшинств бежали из восточной провинции Шан и региона Кокан, расположенного неподалеку от китайской границы.

    Несмотря на обвинения в убийствах, изнасилованиях и поджогах домов в адрес его военных, Мин Аун Хлаин в августе 2010 года был назначен руководителем Объединенного штаба вооруженных сил.

    Менее чем через год его назначили на высший пост в армейском командовании — главнокомандующего вооруженными силами, в обход старших по званию генералов. В этой роли в марте 2011 году он сменил Тан Шве, руководившего страной с 2002-го. Преемником Тан Шве в качестве гражданского главы государства стал следующий президент Мьянмы Тейн Сейн.

    Когда Мин Аун Хлаин стал главнокомандующим, блогер и писатель Хла Оо рассказал, что они знали друг друга в детстве. Он описал Мин Аун Хлаина как «закаленного в боях воина жестокой бирманской армии», но также назвал его «джентльменом и исследователем».

    А вот что говорил о себе сам Мин Аун Хлаин в интервью российскому изданию «Аргументы и факты» в июне 2020 года: «Начинал с младшего лейтенанта, сейчас — Верховный главнокомандующий. Служил в армии, когда Бирма (прежнее название Мьянмы — Би-би-си) строила социализм, при военной администрации, сейчас служу при демократическом правлении. Командовал взводом, ротой, батальоном, полком, военным округом».

    Мин Аун Хлаин подтвердил журналистам, что ему принадлежит высказывание: «История Мьянмы — это история Вооруженных сил, история Вооруженных сил — это история Мьянмы», и заявил, что на территории страны армия борется с террором.

    Правление военных в Мьянме до 2011 года он описал так: «Военные никогда не стремились владеть всей полнотой политической власти. Проблема была в том, что до поры до времени ее было некому передать. Это не значит, что Вооруженные силы правили страной по своему усмотрению. Они всегда прислушивались к мнению народа. Все эти годы в стране работал парламент, проводились выборы «.

    Политическое влияние и «геноцид»

    Мин Аун Хлаин начал свою деятельность на посту верховного главнокомандующего, когда Мьянма перешла к демократии в 2011 году после почти 50 лет военного правления. Но Тамадо по-прежнему в значительной степени определяла политические процессы в стране.

    Политическое влияние Хлаина и его популярность в соцсетях росли, пока партия «Союз солидарности и развития», которую поддерживали военные, руководила правительством.

    Но в 2016 году к власти пришла Национальная лига за демократию во главе с Аун Сан Су Чжи, лауреатом Нобелевской премии мира, которая во времена военной диктатуры много лет провела под домашним арестом. На первый взгляд казалось, что Хлаин приспособился к новой ситуации: он часто появлялся вместе с Аун Сан Су Чжи на публичных мероприятиях.

    Автор фото, Reuters

    Подпись к фото,

    Выборы 2015 года: Хлаин жмет руку Аун Сан Су Чжи

    Несмотря на перемены, 25% депутатских мест в обеих палатах парламента Мьянмы и ключевые должности в правительстве, связанные с безопасностью, по-прежнему занимали представители вооруженных сил — и не без помощи Хлаина. В то же время, он противостоял попыткам партии Аун Сан Су Чжи изменить конституцию и ограничить власть военных.

    В 2016 и 2017 годах военные усилили репрессии против этнического меньшинства мусульман рохинджа на севере штата Ракхайн, в результате чего многие из них бежали в соседнюю Бангладеш.

    В августе 2018 Совет ООН по правам человека заявил: «В отношении высокопоставленных военных генералов Мьянмы, в частности, верховного главнокомандующего генерала Мин Аун Хлаина, необходимо провести расследование и судить за геноцид на севере штата Ракхайн, а также за преступления против человечности и военные преступления в регионах Ракхайн, Качин и Шан».

    После этого заявления «Фейсбук» удалил аккаунт генерала, а также учетные записи других лиц и организаций, которые, по данным ООН, «совершили или потворствовали серьезным нарушениям прав человека в стране».

    В 2019 году США дважды ввели против Мин Аун Хлаина санкции за его вероятное участие в «этнической чистке» и нарушениях прав человека. В июле 2020 Великобритания также наложила на него санкции.

    Переворот

    На выборах в ноябре 2020 года, по официальным данным, победила партия Аун Сан Су Чжи. Но военные и партия, которую они поддерживали — «Союз солидарности и развития», оспорила результаты.

    Автор фото, EPA

    Подпись к фото,

    Диаспоры мьянманцев во всем мире проводят акции в поддержку Аун Сан Су Чжи. На фото — акция в Токио

    Проигравшая партия выдвинула обвинения в широкомасштабной фальсификации выборов. Эти утверждения отклонила избирательная комиссия перед запланированным на 1 февраля заседанием парламента, на котором планировалось утверждение нового правительства.

    Слухи о подготовке переворота росли на фоне противостояния между правительством и вооруженными силами. 27 января Мин Аун Хлаин предупредил, что «конституцию отменят, если ее не будут соблюдать», приведя пример предыдущих военных переворотов в 1962 и 1988 годах.

    К 30 января его администрация сменила риторику, заявив, что СМИ неправильно интерпретировали слова военных чиновников об отмене конституции.

    Однако уже утром 1 февраля были задержаны глава правящей партии и фактический лидер страны Аун Сан Су Чжи, президент Мьянмы Вин Мьин и другие члены политического руководства.

    Мин Аун Хлаин объявил, что берет на себя всю полноту власти на переходный период. На заседании Совета национальной обороны и безопасности, которое он провел, было объявлено, что в стране состоятся новые выборы, а нарушения на выборах 2020 года будут расследовать.

    Автор фото, Reuters

    Подпись к фото,

    Демонстрация в Токио

    Сначала Мин Аун Хлаин должен был уйти с должности главнокомандующего после достижения 65-летнего возраста в июле этого года, но теперь он обеспечил себе по крайней мере еще год власти — и, возможно, дольше — с явным возвращением Мьянмы к военному правлению.

    Дружба с Россией

    Мин Аун Хлаин известен как сторонник сотрудничества Мьянмы с Россией. Он не менее шести раз посещал ее.

    Автор фото, Getty Images

    Подпись к фото,

    Мин Аун Хлаин и министр обороны России Сергей Шойгу, 2018 год

    В июне 2020 Мин Аун Хлаин вместе с командующими ВМС, ВВС и Сухопутных войск Мьянмы посетил военный парад в Москве. Он дал интервью российскому изданию «Аргументы и факты», в котором заявил, что на парад его лично пригласил Сергей Шойгу.

    «Российские военные парады — это нечто грандиозное», — отметил генерал.

    И рассказал о сотрудничестве с Россией. «Мы покупаем прекрасное российское оружие и для ВВС, и для ВМС, и для Сухопутных войск. Однако главное в ВТС — это даже не закупка истребителей, танков, подводных лодок как таковых. ВТС — это в том числе и военное образование. Деньги могут закончиться, военная техника рано или поздно устареет, а знания останутся», — говорил он.

    «Офицеры, которые учились в России, которые говорят по-русски, знакомы с вашими технологиями, имеют у нас хорошие перспективы служебного роста», — подчеркнул он и сообщил, что шесть тысяч военных страны уже получили образование в России.

    Автор фото, Getty Images

    Подпись к фото,

    Сергей Шойгу неоднократно посещал Мьянму. На фото — визит 2018 года

    Накануне военного переворота, 21-22 января, Мьянму посетил Сергей Шойгу. Как сообщает пресс служба Минобороны России, во время визита Шойгу поблагодарил генерала за участие в параде в Москве в 2020 году и заявил, что две страны вместе боролись с фашизмом.

    По итогам визита Шойгу Мьянма решила купить у России зенитные ракетно-пушечные комплексы «Панцирь-С-1» и беспилотники «Орлан-10Е».

    В Мьянме работает технический центр обслуживания авиатехники и бронетехники, которую поставляет Россия. По данным российского оборонного ведомства, Москва поставила Мьянме 30 самолетов МиГ-29, 12 учебно-боевых Як-130, шесть Су-30СМ, 10 вертолетов Ми-24 и Ми-35П, 8 зенитно-ракетных комплексов «Печора-2М», а также радиолокационные станции, бронетанковую технику и артиллерийские системы.

    Военные страны регулярно участвуют в учениях на территории России.

    Калькулятор расчёта скорости клубочковой фильтрации

    Данные для расчета

    Хроническая болезнь почек

    По данным крупных популяционных регистров, распространённость хронической болезни почек (ХБП) составляет не менее 10%, достигая 20% и более у отдельных категорий лиц (пожилые, сахарный диабет 2 типа). Для сравнения: хроническая сердечная недостаточность встречается у 1% населения, бронхиальная астма у 5% взрослого населения, сахарный диабет — у 4-10%, артериальная гипертензия — у 20-25%.

    До недавнего времени общепринятая классификация хронической недостаточности почек (ХПН) отсутствовала. Например, в России использовались классификации Ратнера (уровень креатинина), Тареева (величина СКФ), урологов Рябова и Кучинского (комплексная). Но современный мир требует унификации подходов к диагностике, лечению и профилактике болезней; чтобы врач, независимо от его места работы и жительства, мог понимать своих коллег.

    В настоящее время общее признание получила концепция хронической болезни почек (ХБП, CKD – chronic kidney disease), предложенная американскими нефрологами (K/DOQI, 2002).

    Определение, критерии, классификация

    Хроническая болезнь почек определяется как повреждение почек или снижение их функции в течение трёх месяцев или более независимо от диагноза.

    Современные критерии ХБП (K/DOQI, 2006)

    Повреждение почек в течение 3 месяцев и более, определяемое как структурные или функциональные нарушения (по данным лабораторно-инструментальным методам исследования) с наличием или без снижения СКФ или

    Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) < 60 мл/мин/1.73 м2 в течение 3 месяцев и более с наличием или без признаков повреждения почек.

    Любой из этих двух критериев.

    Классификация ХБП (K/DOQI, 2006)

    Хроническая болезнь почек делится на 5 стадий по величине СКФ.

    Показатель СКФ на уровне 90 мл/мин принят как нижняя граница нормы.

    Значение СКФ < 60 мл/мин. (для диагностики ХБП) выбрано ввиду соответствия гибели более 50% нефронов.

    Стадия Характеристика СКФ мл/мин/1.73   м2
    1 Повреждение  почек с нормальной или повышенной СКФ 90 и более
    2 Повреждение  почек с лёгким снижением СКФ 60 – 89
    3 Умеренное  снижение СКФ 30 – 59
    4 Выраженное  снижение СКФ 15 – 29
    5 Почечная  недостаточность менее 15

    Таким образом, термин «почечная недостаточность» употребляется, когда речь идёт о терминальной стадии хронического заболевания почек.

    Если признаков повреждения почек нет, а СКФ находится в диапазоне 60-89 мл/мин., то стадия ХБП не устанавливается. Данное состояние оценивается как снижение СКФ, что обязательно отражается в диагнозе. Например: Артериальная гипертензия, риск 4. Хроническая сердечная недостаточность 2 ФК, 1 стадия. Снижение СКФ (64 мл/мин, 12.07.09).

    У пожилых лиц (60 лет и старше) показатели СКФ в пределах 60–89 мл/мин без инициирующих факторов риска ХБП расцениваются как возрастная норма.

    Формулировка диагноза ХБП

    Понятие «Хроническая почечная недостаточность» подразумевало, что вначале в течение многих пациента у пациента было хроническое почечное заболевание, а потом развивалась хроническая почечная недостаточность. Причём, начальные стадии ХПН чаще всего (в силу их бессимптомности) пропускались, пока не наступала терминальная стадия, когда уже требовался гемодиализ или трансплантация почки.

    Диагноз «Хроническая болезнь почек» (даже при отсутствии снижения СКФ) подразумевает неизбежное дальнейшее прогрессирование процесса и призван привлечь внимание врача. Именно потенциальная возможность утраты функции почек является важнейшим моментом в понимании термина «хроническая болезнь почек».

    Таким образом, концепция ХБП расширяет старое понятие «хроническая почечная недостаточность» за счёт оценки начальных стадий заболеваний почек, что позволяет раньше начать превентивные мероприятия и затормозить ухудшение почечных функций.

    «Хроническая болезнь почек» (как следует из названия) может быть и обобщающим термином и самостоятельным диагнозом. Несмотря на многообразие этиологических факторов, большинство хронических заболеваний почек имеют единый механизм прогрессирования, а морфологические изменения в почках при почечной недостаточности однотипны и сводятся к преобладанию фибропластических процессов с замещением функционирующих нефронов соединительной тканью и сморщиванию почек.

    Наличие единого комплекса характерных симптомов и патофизиологических нарушений, связанных общей причиной (гибель нефронов) даёт формальные основания обозначить ХБП не только как синдром, осложняющий течение того и ли иного заболевания почек, но и как самостоятельную нозологическую форму (по аналогии с современным взглядами на хроническую сердечную недостаточность).

    В 2007 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) существенно уточнила рубрику N18 (ранее этим под кодом значилась «Хроническая почечная недостаточность»). В целях сохранения общепринятой структуры диагноза рекомендуется диагноз «Хроническая болезнь почек» указывать после основного заболевания и тогда кодировка болезни устанавливается в соответствии с МКБ по основному заболеванию. Если этиология нарушения функции почек неизвестна, то основным диагнозом может выставляться «Хроническая болезнь почек», которая кодируется рубрикой N18 (где N18.1 — Хроническая болезнь почек, стадия 1; N18.2 — Хроническая болезнь почек, стадия 2 и т.д.).

    Критерии  хронической болезни почек (K/DOQI, 2002)

    1.   Повреждение почек >=3 мес. с наличием или без  снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ), проявляющееся одним из  признаков:

    • морфологические нарушения,
    • изменения мочи (протеинурия),
    • изменение визуальных тестов.

    2.   СКФ=3 мес с  наличием или без признаков повреждения почек. Маркеры  повреждения почек

    • Лабораторные: протеинурия,   альбуминурия (>30 мг/сут).
    • УЗИ: изменение размеров почек   (норма: [10-12]х[5-6]х[3-4] см), повышение эхогенности, объемные образования,   камни, нефрокальциноз, кисты.
    • КТ: обструкция, опухоли, кисты,   камни пузыря и мочеточников, стеноз а. renalis.
    • Изотопная сцинтиграфия:   асимметрия функции, размеров почек.

    Этиология

    • Сахарный диабет.
    • Артериальная гипертензия.
    • Хронический гломерулонефрит   (первичный, вторичный).
    • Хронический  тубулоинтерстициальный нефрит (лекарственный, пиелонефрит).

    Диагностика 1.   Оценка функции почек:

    • СКФ: клиренс инулина или  креатинина,
    • расчетный клиренс креатинина:   формула Кокрофта-Голта (для дозирования лекарств),
    • расчетная СКФ: формулы CKD-EPI и MDRD (для оценки стадий ХБП),
    • цистатин С.

    2.   Биопсия почки. 3.   Калий, натрий. 4.   При СКФКлассификация  хронической болезни почек (K/DOQI, 2002; RNA, 2011)

    Стадии Описание СКФ (мл/мин/1,73 м2) МКБ-10
    1* повреждение почек с N или повышенной СКФ >=90 N18.1
    2* повреждение почек с легким снижением СКФ 60-89 N18.2
    умеренное снижение СКФ 45-59 N18.3
    существенное снижение СКФ 30-44 N18.3
    4 тяжелое снижение СКФ 15-29 N18.4
    5 почечная недостаточность N18.5

    *   – при отсутствии признаков повреждения почек стадии 1-2 не устанавливаются. Формулировка  диагноза

    Диагноз МКБ
    Основной Ds: Хронический гломерулонефрит,     мочевой синдром, ХБП 2 стадия. N03.9
    Основной Ds: Сахарный диабет 2 типа,     тяжелое течение, декомпенсация. Осложнение: Диабетическая нефропатия, ХБП 3б стадия (36 мл/мин/1.73     м2 по CKD-EPI, 13.05.11). Е11.2
    Основной Ds: Гипертоническая болезнь III     стадия, риск 4. Осложнение: ХСН I ФК, 1 стадия. Снижение СКФ (64 мл/мин/1.73 м2 по CKD-EPI, 25.04.10). I13
    Основной Ds: Хроническая болезнь почек,     неуточненная, 4 стадия. N18.9
    Основной Ds: Поликистоз почек, ХБП 1     стадия. Q61.2

    Лечение  по стадиям

    Стадии План действий
    1-2 Коррекция сердечно-сосудистых факторов    риска (гипертензия, дислипидемия, курение, ожирение, гипергликемия, низкая    физическая активность)
    3 СКФ каждые 3 мес, ИАПФ или БРА2, избегать    нефротоксичных препаратов, коррекция дозы медикаментов
    4 Консультация нефролога, подготовка к диализу или трансплантации
    5 Диализ или трансплантация

    Схема  ведения ХБП (K/DOQI, 2002, 2006; CSN, 2006; UKRA, 2012, с изменениями) Лечение  почечной недостаточности Диета: снижение белка до 0,8 г/кг (СКФ 15-29 мл/мин/1,73 м2) – 0,6 г/кг (СКФЗамедление прогрессирования: отказ от курения, контроль гипертензии, ингибиторы  ангиотензинпревращающего фермента или блокаторы рецепторов ангиотензина 2,   контроль гликемии. Синдромально лечение: гипертензии, электролитных расстройств, гиперпаратиреоза, анемии,   дислипидемии. Отказ от нефротоксичных  препаратов: аминогликозиды, ванкомицин, препараты  золота, циклоспорин, нестероидные противовоспалительные препараты. Заместительное лечение: гемодиализ (традиционный, амбулаторный /домашний/), перитонеальный  диализ, трансплантация почки. Лечение  синдромальное

    Синдром Цель Лечение
    Артериальная гипертензия АД<140/90 мм рт.ст. АД<130/80 мм рт.ст. при протеинурии ИАПФ, БРА2, диуретики тиазидовые (при    СКФ>30 мл/мин/1,73 м2) или петлевые (при СКФ
    Дислипидемия ХС ЛПНП<1,8 ммоль/л статины – всем >= 50 лет или моложе с другими факторами риска     (ESC/EAS, 2011; KDIGO, 2013)
    Анемия Hb 110-120 г/л препараты железа, ферумокситол (510 мг в/в, затем     510 мг через 3-8 сут), эритропоэтин
    Нарушение обмена Са Са 2,2-2,6 ммоль/л препараты Са, витамин D, удаление паращитовидных желез     (гиперпаратиреоз)
    Гиперкалиемия калий<5,0 ммоль/л глюконат кальция, сода, гемодиализ

    Что означают ln / min, ls / min, slm и sccm?

    Массовый расход должен фактически выражаться в единицах веса, таких как г / ч, мг / с и т. Д. Однако большинство пользователей думают и работают в единицах объема. Нет проблем, если согласованы условия, при которых масса переводится в объем.

    Здесь указаны наши стандартные или стандартные условия температуры и давления:

    Нормальные условия (l n / мин): температура 0 ° C (или 32 ° F) и давление 1.Выбрано значение 013 бар (или 14,69 фунтов на кв. Дюйм), и эти эталонные условия обозначены буквой «n» в используемой единице объема. Метод прямого теплового измерения массового расхода всегда основан на этих стандартных условиях, если не указано иное.

    Стандартные условия (l с / мин): здесь стандартные условия основаны на 20 ° C (68 ° F) вместо 0 ° C (32 ° F).

    Согласно «американскому» определению префикс «s» в sccm или slm относится к «стандартным» условиям, 101.325 кПа абс. (14,6959 фунтов на кв. Дюйм) и температуре 0 ° C (32 ° F).

    Пожалуйста, обратите внимание на стандартные условия при заказе прибора. «Нормальный» и «Стандартный» могут относиться к каждому клиенту, потому что смешивание этих эталонных условий приводит к ошибке 7%!

    Типовая установка

    Нормальные условия для температуры газа

    Нормальные условия для давления газа

    мл n / мин (нормальный миллилитр в минуту)

    0 ° C / 32 ° F

    1.013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    л n / мин (нормальный литр в минуту)

    0 ° C / 32 ° F

    1,013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    sccm (стандартный кубический сантиметр в минуту)

    0 ° C / 32 ° F

    1,013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    slm (стандартный литр в минуту)

    0 ° C / 32 ° F

    1.013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    мл с / мин (стандартный миллилитр в минуту)

    20 ° C / 68 ° F

    1,013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    л с / мин (стандартный литр в минуту)

    20 ° C / 68 ° F

    1,013 бар / 1 атм / 14,69 фунтов на кв. Дюйм

    Опубликовано в: Общие

    CRISPR-Cas9 корректирует делеционные мутации 44 экзона мышечной дистрофии Дюшенна в клетках мышей и человека

    Abstract

    Мутации в гене дистрофина вызывают мышечную дистрофию Дюшенна (МДД), которая характеризуется летальной дегенерацией сердечных и скелетных мышц.Мутации, которые удаляют экзон 44 гена дистрофина, представляют собой одну из наиболее частых причин МДД и могут быть исправлены у ~ 12% пациентов путем редактирования окружающих экзонов, что восстанавливает открытую рамку считывания дистрофина. Здесь мы представляем простую и эффективную стратегию коррекции делеционных мутаций экзона 44 путем редактирования гена CRISPR-Cas9 в кардиомиоцитах, полученных из индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клеток, и в новой модели мыши, несущей ту же делеционную мутацию. Используя AAV9, кодирующий Cas9, и однонаправленные РНК, мы также демонстрируем важность дозировок этих компонентов редактирования генов для оптимальной коррекции генов in vivo.Наши результаты представляют собой значительный шаг к возможному клиническому применению редактирования генов для коррекции МДД.

    ВВЕДЕНИЕ

    Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), вызванная мутациями в гене дистрофина, характеризуется дегенерацией сердечных и скелетных мышц, потерей возможности передвигаться и преждевременной смертью ( 1 ). Дистрофин — это массивный белок (> 3600 аминокислот), который стабилизирует мышечные мембраны, прикрепляя актиновый цитоскелет к внутренней поверхности сарколеммы ( 2 , 3 ).Тысячи мутаций, предотвращающих выработку дистрофина, были идентифицированы у пациентов с МДД ( 4 ). Эти мутации группируются в горячих точках гена, которые, в принципе, можно обойти с помощью различных стратегий пропуска экзонов для восстановления открытой рамки считывания дистрофина ( 5 ). Однако на сегодняшний день не существует эффективной долгосрочной терапии этого заболевания, и единственный препарат, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами для лечения МДД, позволяет восстановить <1% нормального уровня белка дистрофина после длительного лечения. лечение ( 6 ).Таким образом, остается серьезная неудовлетворенная потребность медицины в новых стратегиях коррекции основной причины МДД — генетических мутаций в гене дистрофина.

    Существенной проблемой при разработке методов лечения МДД было отсутствие животных моделей, несущих наиболее распространенные мутации человека. Поскольку оба гена дистрофина мыши и человека содержат 79 экзонов с высококонсервативными паттернами сплайсинга экзонов, результаты, полученные на мышиных моделях заболевания, могут быть экстраполированы на состояние человека.Одна из наиболее распространенных делеций у пациентов с МДД устраняет экзон 50 в стержневом домене дистрофина, в результате чего экзон 51 выходит за пределы рамки с предыдущими экзонами ( 4 , 7 10 ). Недавно мы описали спасение мышей и собак, у которых отсутствует экзон 50, путем инъекции двух аденоассоциированных вирусов серотипа 9 (AAV9), кодирующих ген CRISPR-Cas9, и одиночных направляющих РНК (sgRNA), которые позволяют пропускать или переформатировать экзон 51 и восстанавливать его. экспрессия дистрофина ( 11 , 12 ).

    Вторая наиболее распространенная горячая точка мутации в гене дистрофина включает экзон 44, который нарушает открытую рамку считывания в окружающих экзонах ( 4 , 7 9 ). Здесь мы описываем создание новой модели DMD на мышах с делецией экзона 44 и представляем две стратегии коррекции этой мутации с помощью CRISPR-Cas9-опосредованного пропуска окружающих экзонов. Эти мыши представляют собой важный инструмент для тестирования и оптимизации различных методов лечения МДД.Мы также показываем, что sgRNA неожиданно ограничивают оптимальное редактирование генов in vivo и что эффективность редактирования может быть увеличена примерно в 10 раз за счет оптимизации дозы AAV, кодирующих Cas9 и sgRNA. Наши результаты подчеркивают потенциал редактирования генов для постоянного искоренения мутаций, вызывающих МДД, тем самым предотвращая патогенные последствия этого заболевания.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Коррекция делеции экзона 44 МДД в ​​индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клетках

    Мы получили индуцированные пациентом плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) у пациента с МДД, у которого отсутствует экзон 44 гена дистрофина ( DMD ) и от брата пациента с нормальным геном дистрофина в качестве здорового контроля (рис.1А). Делеция экзона 44 (ΔEx44) нарушает открытую рамку считывания дистрофина, вызывая сплайсинг экзона 43 с экзоном 45 и вводя кодон преждевременной терминации (рис. 1B). Рамку считывания можно восстановить, используя редактирование гена CRISPR-Cas9, чтобы пропустить экзон 43, что позволяет сплайсинг между экзонами 42 и 45, или пропустить экзон 45, что позволяет сплайсинг между экзонами 43 и 46. В качестве альтернативы, рефрейминг экзона 43 или 45 может восстановить рамку считывания белка путем вставки одного нуклеотида (вставка + 3n + 1) или удаления двух нуклеотидов (делеция + 3n − 2).

    Рис. 1 Кардиомиоциты пациентов с МДД с удаленным экзоном 44 иПСК экспрессируют дистрофин после редактирования генома, опосредованного CRISPR-Cas9.

    ( A ) Схема процедуры получения и редактирования пациента с ИПСК и ИПСК-КМ, полученными из МДД. ( B ) Стратегия редактирования гена для делеции DMD экзона 44. Делеция экзона 44 (черный) приводит к сплайсингу экзонов 43-45, генерируя стоп-мутацию дистрофина вне рамки считывания. Нарушение сплайсинга экзона 43 или экзона 45 приводит к сплайсингу экзонов 42–45 или экзонов 43–46, соответственно, и восстанавливает рамку считывания белка.Рамка считывания белка также может быть восстановлена ​​путем рефрейминга экзона 43 или 45 (зеленый). ( C ) Последовательность sgRNA, нацеленная на акцепторные и донорные сайты сплайсинга экзона 43 в гене DMD человека. Мотив, прилегающий к протоспейсеру (PAM) (обозначенный как красные нуклеотиды) sgRNAs, расположен рядом со сплайсинговыми соединениями экзона 43. Последовательность экзонов представлена ​​жирным шрифтом в верхнем регистре. Последовательность интрона представлена ​​буквами в нижнем регистре. Стрелками показаны участки разрезания ДНК Cas9 каждой sgRNA.Акцепторные и донорные сайты сплайсинга заштрихованы желтым цветом. ( D ) Последовательность sgRNA, нацеленная на акцепторный сайт сплайсинга экзона 45 в гене DMD человека. PAM (обозначенный как красные нуклеотиды) sgRNA расположен рядом с акцепторным сайтом сплайсинга экзона 45. Консервативная последовательность человека и мыши заштрихована светло-голубым цветом. Последовательность экзонов представлена ​​жирным шрифтом в верхнем регистре. Последовательность интрона представлена ​​буквами в нижнем регистре. ( E ) Вестерн-блоттинг показывает восстановление экспрессии дистрофина в отредактированных экзоном 43 (E43) и отредактированном экзоном 45 (E45) ΔEx44 ИПСК-КМ пациента с sgRNA (G) 3, 4 и 6, как указано.Винкулин — это средство контроля нагрузки. HC указывает на iPSC-CM из здорового контроля. Вторая полоса — это неотредактированные ИПСК-КМ пациента ΔEx44. ( F ) Иммуноокрашивание показывает восстановление экспрессии дистрофина в отредактированных экзоном 43 и отредактированных экзоном 45 ИПСК-КМ пациента ΔEx44. Дистрофин показан красным. Сердечный тропонин I показан зеленым цветом. Ядра помечены 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) синим цветом. Масштабная линейка 50 мкм.

    Мы выбрали sgRNAs, которые допускают делецию акцепторных или донорных сайтов сплайсинга экзонов 43 и 45, тем самым позволяя сплайсинг между окружающими экзонами для воссоздания дистрофина в рамке считывания.Для редактирования экзона 43 мы сконструировали четыре 20-нуклеотидных (нт) sgRNAs (G1, G2, G3 и G4), направленных против последовательностей около 5 ‘и 3′ границ сплайсинговых соединений экзона 43 (Fig. 1C). Для экзона 45 мы наблюдали, что соединение интрон-экзон акцепторного сайта сплайсинга содержится в области из 33 пар оснований (п.н.), которая идентична в геномах человека и мыши, что позволяет менять стратегии пропуска экзонов между двумя видами. (рис. S1A). Мы создали четыре sgRNA длиной 18-20 нуклеотидов (G5, G6, G7 и G8) для нацеливания на 5’-границу экзона 45 в консервативной области геномов человека и мыши (рис.1D). С помощью анализа специфической для несоответствия Т7 эндонуклеазой I (T7E1) мы сравнили sgRNA на их способность направлять Cas9-опосредованное редактирование генов в клетках 293 человека (рис. S1B). Две из четырех sgRNA для экзона 43 эффективно редактировали целевую область, и все четыре sgRNA для экзона 45 генерировали точные разрезы в консервативной области (рис. S1C). Мы одновременно протестировали редактирующую активность тех же четырех sgRNA для экзона 45 в клетках 10T½ мыши и подтвердили эффективность четырех sgRNA в геномах человека и мыши (рис.S1C).

    sgRNAs с наивысшей активностью редактирования генов, основанные на анализах T7E1, затем были протестированы на способность эффективно редактировать соответствующие экзоны в ИПСК, полученных от пациента, без экзона 44 (обозначаемых как ΔEx44). Одну плазмиду, кодирующую оптимизированные sgRNA (G3 или G4 для экзона 43 или G6 для экзона 45) и Streptococcus pyogenes Cas9 ( Sp Cas9), вводили в ИПСК, полученные от пациента ΔEx44, путем электропорации, и отредактированные ИПСК дифференцировали в кардиомиоциты (ИПСК-КМ).Экспрессию дистрофина оценивали с помощью вестерн-блоттинга и иммуноокрашивания, подтверждая восстановление экспрессии белка дистрофина в отредактированных ΔEx44 iPSC-CM (рис. 1, E и F). Уровни экспрессии белка дистрофина в ΔEx44 iPSC-CM, отредактированных sgRNA G4 и G6, были приблизительно сопоставимы с уровнями, наблюдаемыми в здоровых контрольных iPSC-CM (рис. 1E).

    Из-за высокой эффективности редактирования в анализе T7E1 и полного сохранения последовательности между геномами человека и мыши, мы решили использовать sgRNA G6 для получения отдельных клонов ΔEx44 iPSCs, которые были отредактированы в экзоне 45.Были выделены и размножены тридцать четыре одиночных клона. Анализ последовательности клонов показал события пропуска экзона в 3 из 34 клонов и рефрейминг дистрофина на + 3n + 1 или + 3n-2 в 13 из 34 клонов (фиг. S1D). Вестерн-блоттинг подтвердил восстановление экспрессии дистрофина в трех клонах, скорректированных с помощью CRISPR-Cas9 (фиг. S1E).

    Получение мышей с делецией экзона 44 DMD

    Чтобы оптимизировать редактирование гена для коррекции делеции экзона 44 in vivo, мы создали модель мыши, несущую делецию экзона 44 в гене Dmd , путем редактирования гена CRISPR-Cas9 ( Инжир.2А). Мы вводили в зиготы мышей C57BL / 6 две sgRNA, которые нацелены на интроны, фланкирующие экзон 44, и имплантировали зиготы суррогатным самкам мышей (рис. S2A). Основатель F0 с делецией 908 п.н., которая элиминировал экзон 44, был выбран для дальнейших исследований. Эти мыши ΔEx44 DMD содержат одну из наиболее распространенных делеций, ответственных за DMD у людей. В принципе, коррекция делеций экзона 44 путем редактирования генов окружающих экзонов может потенциально восстановить рамку считывания дистрофина у ~ 12% пациентов с МДД.Делеция экзона 44 была подтверждена анализом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) (фиг. 2B). Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров для последовательностей в экзонах 43 и 46 подтвердило удаление экзона 44 у этих мышей (рис. 2С). В возрасте 4 недель иммуноокрашивание передней большеберцовой мышцы, диафрагмы и сердца у мышей ΔEx44 DMD показало полное отсутствие экспрессии белка дистрофина (рис. 2D). Вестерн-блоттинг подтвердил потерю белка дистрофина (рис.2E). У 4-недельных мышей ΔEx44 с МДД наблюдались фиброз, воспалительная инфильтрация и регенеративные волокна с централизованными ядрами, что указывает на фенотип тяжелой мышечной дистрофии (рис. 2F и рис. S2B). Уровни сывороточной креатинкиназы (CK) у мышей ΔEx44 DMD были повышены в 22 раза по сравнению с однопометными мышами дикого типа (WT), как и у мышей mdx , установленной модели мышей DMD (рис. 2G).

    Рис. 2. Генерация мышей с делецией экзона 44 DMD.

    ( A ) Стратегия редактирования CRISPR-Cas9, используемая для создания мышей с делецией экзона 44 (ΔEx44).Экзон 45 (красный) находится вне рамки с экзоном 43. ( B ) Анализ ОТ-ПЦР мышц ТА для подтверждения делеции экзона 44. Праймеры ОТ-ПЦР находились в экзонах 43 и 46, а размер ампликона составляет 503 п.н. для мышей WT и 355 п.н. для мышей ΔEx44 DMD. Продукты ОТ-ПЦР схематически представлены справа ( n = 3). ( C ) Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР из мышечной ткани ΔEx44 DMD подтвердило делецию экзона 44 и образование преждевременного стоп-кодона в экзоне 45, обозначенных красной звездочкой. ( D ) Окрашивание дистрофином ТА, диафрагмы и сердца мышей WT и ΔEx44 DMD.Дистрофин показан красным. Ядра отмечены окрашиванием DAPI синим цветом. Шкала 100 мкм. ( E ) Вестерн-блоттинг показывает потерю экспрессии дистрофина в ТА, икроножной / подошвенной мышце (G / P) и сердце мышей ΔEx44. Винкулин — контроль нагрузки ( n = 3). ( F ) Окрашивание H&E ТА, диафрагмы и сердца. Обратите внимание на обширный воспалительный инфильтрат и централизованные миоядра в срезах ΔEx44. Вставки указывают области увеличения, показанные ниже.Масштабные линейки, 50 мкм. ( G ) Сывороточная креатинкиназа (СК), маркер повреждения мышц и утечки через мембрану, измеряли у мышей WT (C57BL / 6 и C57BL / 10), ΔEx44 и mdx . Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен непарный тест Стьюдента t . * P <0,005 ( n = 6). ( H ) Репрезентативный график максимальной тетанической силы EDL-мышц у мышей WT (синий) и ΔEx44 (красный). P <0,005 ( n = 6). ( I ) Удельная сила мышц EDL у мышей WT (синий) и ΔEx44 (красный).Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен непарный тест Стьюдента t . ** P <0,001 ( n = 6). ( J ) Анализ силы захвата передними конечностями мышей WT и ΔEx44. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен непарный тест Стьюдента t . ** P <0,001 ( n = 6).

    Сила сдвига, возникающая при сокращении мышц, приводит к разрыву мышечной мембраны в мышцах, лишенных дистрофина, что в конечном итоге вызывает дегенерацию миофибрилл и фиброз мышц ( 13 ).Фиброзная ткань увеличивает жесткость мышц и снижает их сократимость. Для дальнейшего анализа мышечной функции мышей ΔEx44 DMD мы измерили максимальную тетаническую силу в длинном разгибателе пальцев (EDL) ex vivo. По сравнению с однопометниками дикого типа в возрасте 4 недель, мыши ΔEx44 DMD показали снижение удельной и абсолютной тетанической силы в мышце EDL на ~ 50% (рис. 2, H и I). Аналогичное снижение мышечной силы наблюдалось при анализе силы захвата у 8-недельных мышей ΔEx44 DMD (рис.2J).

    Коррекция делеции экзона 44 DMD у мышей путем внутримышечной доставки компонентов редактирования генов AAV9

    Для доставки Sp Cas9 и sgRNA in vivo мы использовали AAV9 для упаковки компонентов редактирования генов. AAV9 — это вирус с одноцепочечной ДНК, который проявляет тропизм как к скелетным мышцам, так и к сердцу, и был использован в многочисленных клинических испытаниях ( 14 17 ). Для дальнейшего редактирования мышечно-специфического гена мы использовали регуляторную кассету креатинкиназы 8 (CK8e), которая объединяет ключевые элементы энхансерной и промоторной областей гена мышечного CK, чтобы управлять экспрессией Sp Cas9 в скелетных мышцах и сердце ( 18 , 19 ).Для доставки sgRNA мы использовали три промотора РНК-полимеразы III (U6, h2 и 7SK) для экспрессии трех копий sgRNA (рис. S3A) ( 20 ).

    Сначала мы сравнили эффективность редактирования генов с различными конструкциями экспрессии, кодирующими Cas9 и sgRNA. Плазмида PX458 кодирует оба редактирующих компонента ( 21 ), тогда как мы использовали две экспрессирующие плазмиды AAV для экспрессии Cas9 и три копии sgRNA, нацеленные на экзон 45 в мышечных клетках C2C12 мыши. Используя анализ T7E1, мы наблюдали сопоставимую эффективность редактирования с обеими конструкциями (рис.S3B). Среди двух протестированных sgRNA G6 продемонстрировал лучшую эффективность разрезания, чем G5, что согласуется с наблюдениями на мышиных клетках 10T½ и человеческих клетках 293 (рис. S1C).

    Для проверки эффективности стратегии редактирования гена с одним разрезом в модели мыши ΔEx44 DMD мы выполнили локализованную внутримышечную инъекцию AAV9, кодирующего Sp Cas9 (AAV-Cas9) и AAV9, кодирующего sgRNA (AAV-G5 или AAV-G6). ) в ТА-мышце мышей на 12-й день после рождения (P12). В качестве контрольной группы мышам WT и ΔEx44 DMD вводили AAV-Cas9 без AAV-sgRNA.В первоначальных исследованиях в каждую ногу вводили 50 мкл AAV9 (1 × 10 12 мкг / мл), содержащего равные количества AAV-Cas9 и AAV-G5 или AAV-G6. Через три недели после внутримышечной инъекции мы собрали ТА-мышцы для анализа. Редактирование гена in vivo с помощью AAV-G5 и AAV-G6 сравнивали с помощью анализа T7E1 и RT-PCR целевой области (фиг. 3A и фиг. S3C). Редактирование генов с помощью AAV-G6 показало более высокую эффективность при разрезании ДНК in vivo (рис. S3C). ОТ-ПЦР с праймерами, амплифицирующими область от экзона 43 до экзона 46, выявила делецию экзона 45 в мышце ТА, в которую инъецировали AAV-Cas9 и AAV-G6 (рис.3А). Это позволяет экзону 43 пропускать экзон 45 и напрямую спариваться с экзоном 46 при обработке пре-мРНК. В результате альтернативная мРНК обеспечивает продукцию усеченного белка дистрофина в скорректированной ТА-мышце мышей ΔEx44 DMD.

    Фиг. 3 Коррекция делеции экзона 44 Dmd у мышей путем внутримышечной доставки компонентов редактирования генов AAV9.

    ( A ) Анализ RT-PCR мышц TA мышей WT и ΔEx44 через 3 недели после внутримышечной инъекции компонентов редактирования генов, переносимых AAV9.Более низкие полосы дистрофина (179 п.н.) указывают на пропуск экзона 45. ( B ) Круговая диаграмма, показывающая процент событий, обнаруженных в экзоне 45 после обработки AAV-Cas9 и AAV-G6 с использованием анализа последовательности RT-PCR клонов, сгенерированных TOPO-TA. Продукты ОТ-ПЦР были разделены на четыре группы: NE, без редактирования; SK, экзон 45 пропущен; РФ, рефрейминг; и OF, вне кадра. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). ( C ) Последовательности продуктов ОТ-ПЦР мышей WT, ΔEx44 и скорректированных мышей ΔEx44. Последовательности в кадре показаны синим цветом, включая последовательности с пропущенным WT и экзоном 45.Последовательность с измененным кадром отображается зеленым цветом, а последовательность вне кадра — красным. ( D ) Вестерн-блоттинг показывает восстановление экспрессии дистрофина в ТА-мышце и сердце мышей ΔEx44. Винкулин — это средство контроля нагрузки. ( E ) Количественная оценка вестерн-блоттинга в ТА-мышце. Относительную интенсивность дистрофина калибровали с помощью внутреннего контроля винкулина. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен непарный тест Стьюдента t . * P <0.005 ( n = 3). ( F ) Иммуноокрашивание показывает восстановление дистрофина в ТА-мышце мышей ΔEx44 через 3 недели после внутримышечной инъекции компонентов редактирования генов, переносимых AAV9. Дистрофин показан красным. Ядра отмечены окрашиванием DAPI синим цветом. Шкала 100 мкм ( n = 3). ( G ) Окрашивание H&E ТА и сердца мышей WT, ΔEx44 и скорректированных ΔEx44. Вставки указывают области увеличения, показанные ниже. Масштабные линейки, 50 мкм ( n = 3).

    Для дальнейшей оценки мутаций, вызванных редактированием генов, мы выполнили клонирование тимидина в аденозин на основе топоизомеразы (TOPO-TA) с использованием продуктов амплификации RT-PCR и секвенировали продукты кДНК. Результаты секвенирования показали, что 7% секвенированных клонов представляли продукты кДНК с пропущенным экзоном 45, а 42% секвенированных клонов содержали единственную вставку аденозина (A) в экзон 45, которая приводила к рефреймингу белка дистрофина (рис. 3, B и C). . Преобладание рефрейминга объясняет высокую распространенность полосы ОТ-ПЦР на 355 п.н. и более низкую распространенность меньшего продукта ОТ-ПЦР на 179 п.о., что отражает пропуск экзонов (рис.3А).

    Глубокое секвенирование генома и ампликона кДНК в целевой области ТА-мышц с внутримышечной инъекцией AAV-G6 также подтвердило, что 9,8% мутаций на уровне генома и 35,7% мутаций на уровне мРНК содержат единственную вставку A на разрезе. сайт после редактирования гена с помощью AAV-G6 (рис. S3, D и E). Эта одиночная вставка A приводит к рефреймингу экзона 45 и восстанавливает рамку считывания белка дистрофина. Мы также наблюдали второстепенные события интеграции инвертированных конечных повторов (ITR) AAV на участке резки с частотой 0.21% на геномном уровне (рис. S3D) и 1,15% на уровне мРНК (рис. S3E).

    Чтобы оценить восстановление белка дистрофина после внутримышечной инъекции AAV-Cas9 и AAV-G5 или AAV-G6, мы провели Вестерн-блот-анализ ТА-мышцы и сердца (рис. 3D). Мы наблюдали восстановление экспрессии белка дистрофина до 74% от уровня WT в отредактированных мышцах ТА мышей ΔEx44 DMD (рис. 3E). Хотя инъекция была локализована в ТА-мышце, мы наблюдали экспрессию дистрофина в сердце на 21% от уровня WT (рис.3D). Это предполагает утечку AAV в кровоток и доставку компонентов редактирования генов к сердцу. Иммуноокрашивание показало, что экспрессия белка дистрофина восстанавливалась в 99% миофибрилл в мышцах ТА, которым инъецировали AAV-Cas9 и AAV-G6 (фиг. 3F и фиг. S3F). Гистологический анализ и окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) показали выраженное уменьшение фиброза, некротических миофибрилл и регенерирующих волокон с центральными ядрами, что указывает на улучшение аномалий, связанных с мышечной дистрофией в мышце TA через 3 недели после AAV9-Cas9 и AAV-G6. впрыск (рис.3G).

    На основе инструментов проектирования CRISPR (http://crispr.mit.edu/ и https://benchling.com/) мы определили 10 основных потенциально нецелевых сайтов, а также на основе анализа последовательности , мы не обнаружили нецелевых эффектов на этих участках (рис. S4). Анализ T7E1 подтвердил отсутствие отсечения вне мишени в 10 верхних потенциальных сайтах вне мишени, а секвенирование ДНК выделенных продуктов амплификации геномной ПЦР, охватывающих потенциальные сайты вне мишени, подтвердило отсутствие sgRNA / Cas9-опосредованных мутаций в прогнозируемые участки (рис.S4A). Кроме того, мы выполнили глубокое секвенирование геномного ампликона 10 наиболее предсказанных нецелевых сайтов в экзонах, кодирующих белок. Ни один из этих сайтов не показал значительных изменений последовательности (рис. S4, B и C).

    Системная доставка компонентов редактирования генов, экспрессирующих AAV9, спасает экспрессию дистрофина у мышей ΔEx44.

    Чтобы добиться избавления всего организма от фенотипа болезни у мышей ΔEx44 DMD, мы доставляли AAV-Cas9 и AAV-G6 системно посредством внутрибрюшинной инъекции. AAV-Cas9 вводили в дозе 5 × 10 13 мкг / кг.Множественные соотношения AAV-G6 и AAV-Cas9 были протестированы, чтобы определить, может ли быть оптимальное соотношение вирусов для максимальной эффективности системного редактирования. Через четыре недели после инъекции мы оценили экспрессию белка дистрофина в нескольких мышечных тканях, включая ТА-мышцу задней конечности, трицепс передней конечности, диафрагму и сердечную мышцу. Путем иммуноокрашивания мы наблюдали экспрессию дистрофина в 94, 90 и 95% миофибрилл в ТА, трицепсе и диафрагме, соответственно, и в 94% кардиомиоцитов, когда мышам ΔEx44 вводили AAV-Cas9 в соотношении 1:10: AAV-G6 (5 × 10 13 мкг / кг AAV-Cas9 и 5 × 10 14 мкг / кг AAV-G6) (рис.4A и рис. S5). Восстановление белка дистрофина в скелетных мышцах коррелировало с дозировкой AAV-G6, доставленной посредством внутрибрюшинной инъекции. Напротив, в сердце дистрофин-положительные кардиомиоциты наблюдались при низкой дозировке AAV-G6 и оставались стабильными при более высоких дозах. Вестерн-блот-анализ тех же групп мышц после системного родоразрешения показал сходные тенденции коррекции дистрофина (фиг. 4B и фиг. S6). При каждом соотношении AAV-Cas9: AAV-G6, тестируемом при системной доставке, сердечная мышца показывала более высокое восстановление дистрофина, чем скелетная мышца.Коррекция сердечной мышцы достигла 82% при введении AAV-Cas9: AAV-G6 в соотношении 1: 1 и увеличилась еще на 12% при соотношении 1:10. Напротив, мы наблюдали увеличение количества миофибрилл, экспрессирующих дистрофин, с 10 до 94% при увеличении sgRNA. Окрашивание H&E и пикросириусом красным показало, что гистопатологические признаки мышечной дистрофии, такие как регенерированные волокна с центральными ядрами, были уменьшены в ТА, диафрагме и трехглавой мышце через 4 недели после доставки AAV-Cas9 и AAV-G6 (фиг.S7 и S8A). Количественный анализ распределения площади поперечного сечения мышечных волокон показал улучшение ТА-мышцы через 4 недели после введения AAV-Cas9: AAV-G6 в соотношениях 1: 5 и 1:10 (рис. S8B).

    Рис. 4. Системная доставка компонентов редактирования генов AAV9 мышам ΔEx44 устраняет экспрессию дистрофина.

    ( A ) Иммуноокрашивание показывает восстановление дистрофина в TA, трицепсе, диафрагме и сердце мышей ΔEx44 через 4 недели после системной доставки AAV-Cas9 и AAV-G6 в указанных соотношениях.Дистрофин показан красным. Ядра отмечены окрашиванием DAPI синим цветом. Масштабная шкала 100 мкм ( B ) Вестерн-блоттинг показывает восстановление экспрессии дистрофина в ТА, трицепсе, диафрагме и сердце мышей ΔEx44 через 4 недели после системной доставки AAV-Cas9 и AAV-G6 в указанных соотношениях. Винкулин контрольный ( n = 4). ( C ) Максимальная тетаническая сила мышц EDL у мышей дикого типа (синий), ΔEx44 DMD (красный) и скорректированных мышей ΔEx44 DMD (зеленый) через 4 недели после системной доставки AAV-Cas9 и AAV-sgRNA при 1: 5 и Соотношение 1:10. P <0,005 ( n = 6). ( D ) Удельная сила (мН / мм 2 ) мышц EDL у мышей WT (синий), ΔEx44 DMD (красный) и скорректированных мышей ΔEx44 DMD (зеленый) через 4 недели после системной доставки AAV-Cas9 и AAV -sgRNA в соотношении 1: 5 и 1:10. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Ньюмана-Кеулса. ** P <0,001 ( n = 6).

    Для дальнейшей оценки системной доставки AAV-Cas9 в присутствии различных количеств AAV-G6 мы выполнили Вестерн-блот-анализ, чтобы оценить количество белка Cas9, экспрессируемого в мышцах.Хотя мы сохранили общую дозу AAV-Cas9 постоянной (5 × 10 13 мкг / кг), мыши, получавшие более высокие дозы AAV-G6, показали более высокую экспрессию белка Cas9 в скорректированных мышцах (рис. 4B и рис. S6). . Анализ количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) мРНК Cas9 в мышечных группах при сравнении низких и высоких доз AAV-G6 выявил повышенную экспрессию мРНК Cas9 в скелетных мышцах в присутствии высоких доз AAV-G6 (рис. S8, C и D). ). Эти результаты показывают, что на экспрессию Cas9 влияет количество присутствующей sgRNA, и, таким образом, sgRNA ограничивает оптимальное редактирование гена in vivo.Эти результаты также предполагают, что степень восстановления дистрофина и восстановления мышц может обеспечивать среду, которая способствует экспрессии Cas9.

    Чтобы изучить влияние восстановления дистрофина на мышечную функцию у мышей с системной коррекцией ΔEx44 DMD, мы выполнили электрофизиологию EDL-мышцы мышей ΔEx44 DMD через 4 недели после инъекции AAV-Cas9 и AAV-G6. Мы наблюдали восстановление максимальной тетанической силы в мышце EDL у скорректированных мышей ΔEx44 DMD (фиг. 4C). Улучшение мышечной функции коррелировало с повышенной экспрессией дистрофина и уменьшением мышечной дегенерации и было связано с введением увеличивающихся количеств AAV-G6 по сравнению с AAV-Cas9 (рис.S9). Для измерения силы, специфической для мышц, которая откалибрована по площади поперечного сечения мышцы, мы наблюдали увеличение силы с 59 до 89% для соотношения 1: 5 и до 107% для соотношения 1:10 AAV-Cas9. : AAV-G6 в мышце EDL системно скорректированных мышей ΔEx44 DMD (фиг. 4D). Мы пришли к выводу, что системная доставка AAV-Cas9 и AAV-G6 эффективно восстанавливает экспрессию дистрофина и улучшает мышечную функцию у мышей с коррекцией ΔEx44 DMD, а количество sgRNA, доставленное в мышцы, имеет решающее значение для эффективности редактирования генома in vivo.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Наши результаты создают новую мышиную модель DMD, лишенную экзона 44 гена дистрофина, представляющую одну из наиболее распространенных горячих точек для мутаций гена дистрофина у людей. Коррекция делеций экзона 44 путем пропуска экзона или переформатирования окружающих экзонов потенциально может помочь в лечении ~ 12% пациентов с МДД. Эти мыши ΔEx44 с МДД демонстрируют признаки МДД, включая дегенерацию миоцитов, регенерацию, фиброз и жировую инфильтрацию мышц, а также потерю сократительной функции, и станут платформой для тестирования и оптимизации стратегий редактирования генов и других методов лечения.Делеция экзона 44 дистрофина у этих мышей и стратегия восстановления экспрессии дистрофина путем пропуска экзона 45 аналогичны стратегии коррекции с использованием олигонуклеотида казимерсена (SRP-4045), разработанного Sarepta, который предназначен для восстановления экспрессии дистрофина у пациентов с делеции экзона 44 путем маскировки акцепторного сайта сплайсинга на экзоне 45. В недавнем клиническом исследовании этеплирсен, олигонуклеотид, который позволяет пропускать экзон 51 у пациентов, у которых отсутствует экзон 50, как сообщается, обеспечивает экспрессию ~ 0.5% от нормального уровня дистрофина, измеренного в образцах биопсии от пролеченных пациентов с МДД после приблизительно 1 года непрерывного лечения ( 6 ). Для сравнения, мы наблюдали ~ 90% восстановление экспрессии белка дистрофина во всех мышцах и сердце мышей с делецией экзона 44 в течение 4 недель после однократной системной дозы компонентов редактирования генов, кодируемых AAV9. Было подсчитано, что только от 15 до 30% нормальных уровней дистрофина могут обеспечить терапевтический эффект у пациентов ( 22 , 23 ).

    Мы показываем, что соотношение AAV, кодирующих sgRNA и Cas9, может иметь сильное влияние на эффективность генной коррекции in vivo. Увеличение соотношения AAV-sgRNA к AAV-Cas9 заметно увеличивает генную коррекцию за счет однократного сокращения CRISPR. Есть несколько возможных объяснений этих наблюдений: (i) AAV-sgRNA может быть ограничивающим фактором in vivo, так что большее количество вируса дает возможность большего редактирования генов. Более того, поскольку сообщалось, что ассоциация Cas9 с sgRNA вызывает конформационные изменения в Cas9, которые усиливают редактирование генов ( 24 ), более высокие уровни sgRNA могут гарантировать более высокую активность Cas9 in vivo.(ii) sgRNA транскрибируются РНК-полимеразой III и, вероятно, ограничены ядром ( 25 , 26 ). Белок Cas9, полученный в результате трансляции мРНК Cas9 в цитоплазме, может проникать в ядра, отличные от тех, в которых транскрибируется sgRNA. Повышение уровня AAV-sgRNA может позволить большему проценту ядер в миофибриллах экспрессировать sgRNA, тем самым улучшая редактирование генома CRISPR-Cas9. (iii) Истощение sgRNA может происходить с течением времени in vivo, и увеличение количества sgRNA может обеспечить непрерывное редактирование в миофибриллах.

    Когда постоянная доза AAV-Cas9 вводилась с более высокими количествами AAV-sgRNA, мы наблюдали повышенную экспрессию белка Cas9 и мРНК. Возможно, увеличение экспрессии Cas9 с дозировкой sgRNA и последующее увеличение восстановления дистрофина приводит к более здоровой клеточной среде для экспрессии Cas9. Разница в эффективности восстановления при различных соотношениях AAV-sgRNA и AAV-Cas9 потенциально коррелирует с количеством ядер, редактируемых в каждой клетке. Хотя и сердечная мышца, и скелетные мышцы многоядерны, один кардиомиоцит в среднем содержит от одного до четырех ядер, но одно миофибрилло может содержать сотни ядер.Таким образом, создание миоцитов, экспрессирующих дистрофин, путем редактирования ядер в одном кардиомиоците более эффективно, чем в одном миофибрилле. В результате при том же количестве sgRNA сердечная мышца показывает лучшую эффективность редактирования, чем скелетная мышца. Кроме того, на основании предыдущих отчетов, вероятно, что AAV9 имеет лучший тропизм для сердечной ткани, чем для скелетных мышц ( 27 ).

    Используя единственную sgRNA против последовательности в экзоне 45, мы наблюдали высокую долю одиночных нуклеотидных вставок, непосредственно примыкающих к разрезу ДНК, и эти вставки чаще всего представляли собой аденозин, соответствующий следующему нуклеотиду, примыкающему к сайту исходного двухцепочечный разрыв ДНК.Мы сделали аналогичные наблюдения с редактированием гена с одним разрезом экзона 51 у мышей и собак, лишенных экзона 50 ( 11 ). Поскольку разрезание с помощью Cas9 имеет склонность к тому, что один нуклеотид 5 ‘выступает над четырьмя нуклеотидами 5’ на участке разреза, присутствие тимидина в этом положении способствует встраиванию аденозина в комплементарную цепь во время репарации ДНК ( 28 ). Эта вставка одного нуклеотида имеет потенциал для восстановления открытой рамки считывания, если экзон выходит за рамки рамки с предыдущим экзоном на один нуклеотид, как в случае экзонов 43 и 45.Однако эта стратегия с меньшей вероятностью восстановит открытую рамку считывания, если для переформирования белка требуются два нуклеотида из-за низкой частоты вставок двух нуклеотидов после негомологичного соединения концов (NHEJ). Тем не менее делеции, которые удаляют акцепторную или донорную последовательность сплайсинга экзона вне рамки считывания, могут в таких случаях восстанавливать дистрофин. Примечательно, что мы наблюдали низкую частоту интеграции последовательностей ITR AAV в месте разрезания Cas9 in vivo, как наблюдали в предыдущих сообщениях ( 29 , 30 ).

    Наши результаты подчеркивают эффективность редактирования гена CRISPR за один разрез для эффективного восстановления дистрофина in vivo. В то время как несколько исследований также показали, что использование двух sgRNAs для опосредования разрезания Cas9 на дистальных участках генома может позволить вырезать большие промежуточные области генома и восстановить экспрессию дистрофина из мутантных аллелей ( 31 33 ), эффективность подход двойного разрезания низок и связан с непредсказуемыми геномными перестройками, которые мы не наблюдали с использованием только одной sgRNA для управления разрезанием Cas9.Таким образом, мы считаем, что метод редактирования CRISPR с однократным разрезом представляет собой наиболее жизнеспособный клинический подход для коррекции мутаций дистрофина путем редактирования генов. Конечно, еще предстоит определить, можно ли распространить заметные эффекты, которые мы здесь наблюдали у мышей, на людей с гораздо более крупными мышцами в течение более длительного периода времени.

    Есть несколько ограничений нашего исследования, которые следует учитывать. Хотя мы продемонстрировали заметное восстановление белка дистрофина и структуры мышц в течение 4 недель после доставки AAV, мы еще не знаем, сохранятся ли эти эффекты или, наоборот, могут исчезнуть с течением времени.Учитывая, что большинство кардиомиоцитов не перевертывается, мы ожидаем, что преимущества восстановления дистрофина в сердце сохранятся на всю жизнь. Однако еще предстоит определить, будет ли происходить постепенное обновление скелетных мышц после доставки компонентов редактирования генов с помощью AAV9. В этом отношении Уэйджерс и соавторы сообщили, что AAV9 инфицирует сателлитные клетки in vivo ( 34 ), которые могут обеспечивать устойчивый резервуар клеток для длительного поддержания экспрессии дистрофина.Однако мы и другие не наблюдали эффективной инфекции AAV сателлитных клеток in vivo ( 11 , 35 ). Будет ли это связано с техническими различиями в подходах к доставке, еще предстоит определить.

    Возможные иммунологические ответы на Cas9 или дистрофин также еще предстоит изучить в долгосрочной перспективе. Хотя мы не наблюдали иммунного ответа ни на AAV или Cas9, ни на дистрофин в наших предыдущих исследованиях ( 11 ), вполне вероятно, что такие ответы могут наблюдаться в течение более длительных периодов времени.Наконец, мы проверили возможное срезание генома вне мишени в сайтах, которые, по прогнозам, имеют наивысшую гомологию с sgRNAs, используемыми для исправления делеции ΔEx44, но не наблюдали никаких срезов вне мишени выше фона. Имеется мало доказательств нецелевых эффектов редактирования CRISPR-Cas9 у мышей, за исключением одного отчета, который был отозван ( 36 ).

    Таким образом, описанные здесь мыши ΔEx44 DMD в сочетании с оптимизированными векторами ssgRNA и AAV для доставки должны способствовать прогрессу в направлении долгосрочной коррекции мутаций дистрофина у мышей в качестве прелюдии к возможной клинической трансляции.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Дизайн исследования

    Это исследование было разработано с основной целью определить наиболее эффективный способ коррекции мутации экзона 44 в мышиной модели МДД и пациенте с ИПСК, полученным из МДД. Вторичные цели заключались в исследовании количества пропущенных экзонов, экспрессии белка дистрофина и различных индикаторов прогрессирования заболевания у мышей с коррекцией МДД. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) здоровых людей и пациентов с МДД были получены в центре миоредактирования Юго-Западного Веллстоуна.Во всех экспериментах использовали PBMC доноров-мужчин. PBMC были собраны на основе мутации пациентов; мы не использовали методы исключения, рандомизации или слепого метода для выбора доноров. Работа с животными, описанная в этой рукописи, была одобрена и проводилась под надзором Юго-западного институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Животные были разделены на экспериментальные группы по генотипу; мы не использовали методы исключения, рандомизации или ослепления для назначения животных для экспериментов.Эксперименты по инъекции и расслоению AAV проводились без слепого использования. Ослепляющие подходы использовались во время тестов силы захвата, гистологической проверки, анализа иммуноокрашивания, анализа CK и электрофизиологии мышц. Для каждого эксперимента размер выборки отражает количество независимых биологических повторов и указан в подписях к рисункам.

    Плазмиды и клонирование

    Плазмида pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) содержала оптимизированный по кодонам человеческий ген Sp Cas9 с 2A-EGFP.pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) был подарком от F. Zhang (плазмида Addgene; каталожный номер 48138) ( 21 ). Клонирование sgRNA проводили с использованием сайтов Bbs I. SgRNA в этом исследовании, перечисленные в таблице S1, были отобраны с использованием предсказания crispr.mit.edu. Последовательности sgRNA были клонированы в PX458, а затем протестированы в культуре ткани с использованием клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK) и клеток 10T½, как описано ранее ( 37 ).

    Плазмида AAV TRISPR-sgRNAs-CK8e-GFP содержала три sgRNA, управляемые промотором U6, h2 или 7SK, и зеленым флуоресцентным белком (GFP), управляемым регуляторной кассетой CK8e.Система клонирования магистрали TRISPR основана на двух последовательных этапах сборки Golden Gate (New England Biolabs). Детали сборки были описаны ранее ( 11 ).

    Поддержание и нуклеофекция ИПСК человека

    ИПСК человека культивировали в среде mTeSR ™ 1 (STEMCELL Technologies) и пассировали примерно каждые 4 дня (соотношение деления от 1:12 до 1:18 в зависимости от клеточных линий). За час до нуклеофекции ИПСК обрабатывали 10 мкМ ингибитором ROCK (Y-27632) и диссоциировали на отдельные клетки с помощью Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.). ИПСК (1 × 10 6 ) смешивали с 5 мкг плазмиды PX458-sgRNA-2A-GFP и подвергали нуклеофекции с использованием набора P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X (Lonza) в соответствии с протоколом производителя. После нуклеофекции ИПСК культивировали в среде mTeSR ™ 1 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK и меняли на среду mTeSR ™ 1 на следующий день. Через три дня после нуклеофекции среду заменяли на среду mTeSR ™ 1 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK и примозина (100 мкг / мл) (InvivoGen) за 1 час до сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS).(+) И (-) клетки GFP были отсортированы с помощью FACS и подверглись анализу T7E1. Отдельные клоны, полученные из ИПСК GFP (+), были отобраны и секвенированы.

    Дифференциация ИПСК-КМ человека

    ИПСК человека культивировали в среде mTeSR ™ 1 в течение 3–4 дней, пока они не достигли слияния 90–95%. Чтобы дифференцировать ИПСК в кардиомиоциты, клетки культивировали в среде CDM3-C в течение 2 дней, затем в среде CDM3-WNT в течение 2 дней, затем в среде BASAL в течение 6 дней, затем в среде SELECTIVE в течение 10 дней и, наконец, в среде БАЗАЛЬНАЯ среда от 2 до 6 дней.Затем кардиомиоциты диссоциировали, используя среду TrypLE Express (Gibco), и пересевали по 2 × 10 6 клеток на лунку в шестилуночном планшете. Содержимое среды дифференциации можно найти в таблице S1.

    Мыши

    Мышей содержали в помещениях с барьером с 12-часовым циклом свет / темнота и содержали на стандартном питании (2916 Teklad Global). Мышей ΔEx44 DMD получали на фоне C57BL / 6J с использованием системы CRISPR-Cas9. Две sgRNA, специфичные для интронных областей, окружающих экзон 44 локуса Dmd мыши, были клонированы в вектор PX458 (плазмида Addgene; каталожный номер.48138) с использованием праймеров из таблицы S1. Для транскрипции sgRNA in vitro последовательность промотора T7 добавляли к матрице sgRNA с помощью ПЦР с использованием праймеров из таблицы S1. Очищенные в геле продукты ПЦР использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro с использованием набора MEGAshortscript T7 (Life Technologies). sgRNA очищали с помощью MEGAclear Kit (Life Technologies) и элюировали водой, не содержащей нуклеаз (Ambion). Концентрацию направляющей РНК измеряли с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).Инъекционные процедуры были выполнены, как описано ранее ( 38 ). Мышей ΔEx44 DMD скрещивали с мышами C57BL / 6J более чем в трех поколениях. Мыши ΔEx44 DMD и однопометники WT были генотипированы с использованием праймеров, охватывающих целевую область из таблицы S1. Биопсии хвоста переваривали в 100 мкл 25 мМ NaOH, 0,2 мМ ЭДТА (pH 12) в течение 20 минут при 95 ° C. Хвосты ненадолго центрифугировали, затем добавляли 100 мкл 40 мМ трис-HCl (pH 5) и перемешивали до гомогенизации. Два миллилитра этой реакции использовали для последующих ПЦР с праймерами из таблицы S1 с последующим гель-электрофорезом.

    Выделение геномной ДНК, амплификация ПЦР и анализ T7E1 продуктов ПЦР

    Геномная ДНК фибробластов 10T½ мыши, миобластов C2C12 мыши, клеток HEK 293 человека и ИПСК человека была выделена с использованием реагента для лизиса DirectPCR (клетки) (VIAGEN) в соответствии с протокол производителя. Геномную ДНК мышечных тканей мыши выделяли с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneJET (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Геномную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы GoTaq (Promega) или с праймерами.Продукты ПЦР очищали в геле и субклонировали в вектор pCRII-TOPO (InvitroGen) в соответствии с протоколом производителя. Отбирали отдельные клоны и секвенировали ДНК. Последовательности праймеров перечислены в таблице S1.

    Несоответствующая дуплексная ДНК была получена денатурированием / ренатурацией 25 мкл продукта геномной ПЦР в следующих условиях: 95 ° C в течение 5 минут, 95-85 ° C (-2,0 ° C / с), 85-25 ° C. ° C (-0,1 ° C / с), выдерживают при 4 ° C. Затем 25 мкл ошибочно спаренной дуплексной ДНК инкубировали с 2.7 мкл 10 × NEB буфера 2 и 0,3 мкл T7E1 (New England BioLabs) при 37 ° C в течение 90 мин. Продукт ПЦР, расщепленный T7E1, анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле.

    Производство вектора AAV

    AAV были получены Бостонской детской больницей Viral Core, как описано ранее ( 39 ). Векторы AAV очищали прерывистыми градиентами йодиксанола (Cosmo Bio, AXS-1114542-5), а затем концентрировали с помощью фильтрующего устройства Millipore Amicon (UFC8, 100 кДа). Титры AAV определяли с помощью количественной ПЦР.Вкратце, 4 мкл вектора AAV обрабатывали дезоксирибонуклеазой (ДНКазой) I (NEB M0303S) и 2 М NaOH с последующей нейтрализацией. Смесь серийно разбавляли и проводили количественную ПЦР с праймерами, перечисленными в таблице S1. Число копий определяли по стандартной кривой, построенной путем серийных разведений трансгенной плазмиды.

    Доставка AAV9 мышам ΔEx44 DMD

    Перед инъекциями AAV9 мышей ΔEx44 DMD анестезировали. Для внутримышечной инъекции в ТА-мышцу самцов мышей ΔEx44 DMD P12 вводили 50 мкл препаратов AAV9 (1 × 10 12 мкг / мл) или физиологический раствор.Для внутрибрюшинной инъекции мышам P4 ΔEx44 DMD вводили с помощью ультратонкой иглы (размер 31) 80 мкл препаратов AAV9 с дозировкой 5 × 10 13 мкг / кг AAV-Cas9 и соответствующим соотношением AAV-G6. указанные в подписи к рисунку или физиологическим раствором.

    Вестерн-блот-анализ дистрофина

    Для вестерн-блоттинга ИПСК-КМ собирали 2 × 10 6 кардиомиоцитов и лизировали лизисным буфером [10% SDS, 62,5 мМ трис (pH 6,8), 1 мМ EDTA и ингибитор протеазы. ].Для вестерн-блоттинга скелетных или сердечных мышц ткани измельчали ​​в мелкий порошок с использованием устройства для измельчения, замороженного жидким азотом. Лизаты клеток или тканей пропускали через шприц размера 25, а затем через шприц размера 27, по 10 раз каждый. Концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA, и 50 мкг общего белка наносили на 4-20% акриламидный гель. Гели запускали при 100 В в течение 15 минут и переключали на 200 В в течение 45 минут с последующим 1-часовым 20-минутным переносом на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) при 100 В при 4 ° C.Блот инкубировали с мышиным антидистрофиновым антителом (MANDYS8, Sigma-Aldrich, D8168), мышиным антителом против Cas9 (клон 7A9, Millipore, MAC133) или кроличьим антителом против GFP (InvitroGen, A-11122) при 4 ° C в течение ночи. , а затем с козьим антителом к ​​пероксидазе хрена (HRP) или козьим антителом против HRP кролика (Bio-Rad Laboratories) при комнатной температуре в течение 1 часа. Блот проявляли с использованием люминолового реагента для вестерн-блоттинга (Santa Cruz, sc-2048). Контроль загрузки определяли с помощью блоттинга мышиным антителом против винкулина (Sigma-Aldrich, V9131).

    Анализ глубокого секвенирования Amplicon

    ПЦР геномной ДНК и кДНК из мышц выполняли с использованием праймеров, разработанных против соответствующей целевой области и 10 верхних нецелевых сайтов. Второй раунд ПЦР использовали для добавления последовательностей связывания проточных клеток Illumina и целевых штрих-кодов на 5′-конце последовательности праймера. Все последовательности праймеров перечислены в таблице S1. Перед секвенированием библиотеки ДНК анализировали с использованием набора для анализа ДНК Bioanalyzer High Sensitivity (Agilent).Затем концентрацию библиотеки определяли с помощью количественной ПЦР с использованием набора для количественной оценки библиотек KAPA для платформ Illumina. Полученные продукты ПЦР объединяли и секвенировали считыванием парных концов 300 пар оснований на приборе Illumina MiSeq. Образцы демультиплексировали в соответствии с назначенными последовательностями штрих-кода. Данные формата FASTQ были проанализированы с использованием программного пакета CRISPResso версии 1.0.8.

    Гистологический анализ мышц

    Скелетные мышцы мышей WT и ΔEx44 DMD были индивидуально разрезаны и заморожены в смеси объема 1: 2 порошка трагакантовой камеди (Sigma-Aldrich) и среды для замораживания тканей (Triangle Bioscience).Все заливки мгновенно замораживали в изопентановом экстрагенте, переохлажденном до -155 ° C. Полученные блоки хранили при -80 ° C перед разделением на секции. Восемь микрометровые поперечные срезы скелетных мышц и фронтальные срезы сердца были приготовлены на криостате Leica CM3050 и высушены на воздухе перед окрашиванием в тот же день. Окрашивание H&E выполняли в соответствии с установленными протоколами окрашивания ( 38 ), а иммуногистохимию дистрофина выполняли с использованием моноклонального антитела MANDYS8 (Sigma-Aldrich) с изменениями в инструкциях производителя.Вкратце, срезы криостата размораживали и регидратировали / делипидировали в 1% забуференном тритоном / фосфатом физиологическом растворе, pH 7,4 (PBS). После делипидирования срезы промывали от тритона, инкубировали с реагентом, блокирующим мышиный иммуноглобулин G (IgG) (набор M.O.M., Vector Laboratories), промывали и последовательно уравновешивали M.O.M. белковый концентрат / PBS и MANDYS8, разведенный 1: 1800 в M.O.M. белковый концентрат / PBS. После инкубации первичных антител в течение ночи при 4 ° C срезы промывали, инкубировали с M.О.М. биотинилировали антимышиный IgG, промывали и детектирование завершали инкубацией Vector fluorescein-avidin DCS. Ядра окрашивали йодидом пропидия (Molecular Probes) перед нанесением покрытия с помощью Vectashield.

    Для окрашивания пикросириусом красным криосрезы сердца и скелетных мышц, разрезанные на толщину 8 мкм, оттаивали до комнатной температуры и затем фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером. Срезы промывали водопроводной водой перед сенсибилизацией в нагретом фиксаторе Буэна (90 мин при 60 ° C; Polysciences, Warrington, PA).После ополаскивания водопроводной водой ядра контрастировали с нагретым железным гематоксилином Вейгерта. После еще одного полоскания водопроводной водой срезы окрашивали 0,1% раствором сириуса красного, приготовленным в насыщенной водной пикриновой кислоте, в течение 1 часа. Срезы обесцвечивали до коллаген-специфичности двумя промывками 0,5% ледяной уксусной кислотой, обезвоживали, очищали и наносили покровные стекла постоянной синтетической монтажной средой.

    Изолированная подготовка мышц EDL и электрофизиологическая стимуляция

    Подготовка мышц выполнялась, как описано ранее ( 38 ).Вкратце, мышцы были хирургически изолированы от 4-недельных мышей и помещены на датчики силы Grass FT03.C, подключенные к блоку сбора данных Powerlab 8 / SP (AD Instruments, Colorado Springs, CO), погруженные в физиологический солевой раствор при 37 ° C. ° C и непрерывно газируют 95% O 2 –5% CO 2 . После калибровки мышцы были отрегулированы до начальной длины, при которой пассивная сила составляла 0,5 г, а затем стимулировались двумя электродами из платиновой проволоки для установления оптимальной длины (Lo) для получения максимального изометрического тетанического напряжения шаг за шагом в соответствии с протоколом (при 150 Гц для 2 с).Удельная сила (мН / мм 2 ) была рассчитана для нормализации реакции сокращения на площадь поперечного сечения ткани.

    Статистика

    Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Был проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Ньюмана-Кеулса для множественных сравнений. Непарные двусторонние тесты Стьюдента t проводили для сравнения между соответствующими двумя группами (мыши дикого типа и ΔEx44 DMD, мыши дикого типа и ΔEx44 DMD-AAV9, и контрольные мыши ΔEx44 DMD и мыши, получавшие ΔEx44 DMD-AAV9).Анализ данных выполняли с помощью статистического программного обеспечения (GraphPad Prism Software, Сан-Диего, Калифорния, США). P Значения менее 0,05 считались статистически значимыми.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

    Дополнительные материалы к этой статье доступны по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/3/eaav4324/DC1

    Рис. S1. Анализ sgRNAs, которые нацелены на акцепторные или донорные сайты сплайсинга для экзонов 43 и 45.

    Рис. S2. Характеристика линии мышей ΔEx44.

    Рис. S3. Внутримышечная доставка компонентов редактирования генов AAV9 спасает экспрессию дистрофина.

    Рис. S4. Анализ топ-10 потенциально нецелевых сайтов.

    Рис. S5. Коррекция мышей ΔEx44 путем системной доставки компонентов редактирования генов, экспрессирующих AAV9.

    Рис. S6. Вестерн-блоттинг мышей с исправленным ΔEx44 путем системной доставки компонентов редактирования генов, экспрессирующих AAV9.

    Рис. S7. Гистология мышей ΔEx44 после системной доставки компонентов редактирования генов, экспрессирующих AAV9.

    Рис. S8. Количественная оценка гистологического улучшения и анализ КПЦР скорректированных мышей ΔEx44 DMD.

    Рис. S9. Гистологический анализ показывает восстановление дистрофина в мышце EDL у скорректированных мышей ΔEx44 DMD.

    Таблица S1. Последовательности праймеров и компоненты среды.

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечное использование будет , а не для коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

    Благодарности: Мы благодарим J. Cabrera за графику, C. Nolen за техническую помощь, D. Tennison за генотипирование, VS Malladi за биоинформатический анализ, Neuro-Models Facility и L. Ingle за эксперименты по силе захвата, ядро ​​проточной цитометрии и A. Mobley за FACS, C. Wang и вирусное ядро ​​Бостонской детской больницы для производства AAV, D. Caballero за анализ qPCR, E. Sanchez-Ortiz за помощь в проведении вестерн-блоттинга и C. Long, Y. Zhang, V. Кириченко и Н. Джонса за конструктивные советы.Мы признательны С. Хаушке (Вашингтонский университет) за регуляторную кассету CK8e и Д. Гримму (Университетская больница Гейдельберга, Германия) за плазмиду TRISPR. Финансирование: Эта работа была поддержана NIH (гранты HL130253 и AR-067294), Центром исследований мышечной дистрофии сенатора Пола Д. Уэллстона (грант U54 HD 087351), премией родительского проекта по мышечной дистрофии, CureDuchenne, Exonics Therapeutics, и Фонд Роберта А. Велча (грант 1-0025 ENО.). Вклад авторов: Y.-L.M., R.B.-D., E.N.O. написал и отредактировал рукопись. Ю.-Л.М. разработал эксперименты и провел исследования на животных, исследования ИПСК, геномную ДНК, анализы T7E1, ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг, электрофизиологию мышц и анализ. H.L. провел геномный анализ, ОТ-ПЦР и анализ вне мишени. C.R.-C выполнила культивирование ИПСК. A.A.M. провели эксперименты по обработке тканей. J.H. провели анализ электрофизиологии мышц. J.M.S. провели иммуногистохимию и окрашивали H&E.J.R.M. выполнили инъекцию зиготы для создания мышей. Лос-Анджелес предоставил помощь и совет. P.P.A.M. предоставил образцы крови и надзор за электрофизиологическим анализом. Конкурирующие интересы: R.B.-D and E.N.O. консультанты Exonics Therapeutics. Лос-Анджелес — сотрудник Exonics Therapeutics. Ю.-Л.М., Р.Б.-Д., Э.Н.О. являются соавторами патентной заявки, связанной с этой работой (номер заявки на патент США 15/8), в отношении модели мыши и стратегии, представленных в этом исследовании.Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов. Плазмида pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) может быть предоставлена ​​Addgene в ожидании научного обзора и заключенного соглашения о передаче материала. Запросы на плазмиду pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) следует отправлять в Addgene.

    • Copyright © 2019 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

    Сколько кислорода потребляет легкие человека?

    Фон: Количество кислорода, потребляемого самими легкими, трудно измерить, потому что он участвует в газообмене всего тела.Он может заметно увеличиваться при патологических состояниях, таких как инфекция легких или респираторный дистресс-синдром у взрослых. Для оценки нормального потребления кислорода легкими человека в качестве основы для дальнейших исследований анализ дыхательных газов во время общего искусственного кровообращения может быть простым подходом, поскольку в этот период легочная циркуляция отделена от системного кровотока.

    Методы: Потребление кислорода легкими определяли у 16 ​​пациентов, перенесших кардиохирургические операции.Во время полного искусственного кровообращения их легкие вентилировались низкими минутными объемами (дыхательный объем 150 мл; частота 6 мин-1; фракция кислорода на вдохе 0,5; положительное давление в конце выдоха 3 мм рт. Ст.). Весь выдыхаемый газ собирали и анализировали с помощью непрямой калориметрии. В качестве справочного значения также определялось потребление кислорода всем телом у этих пациентов до общего искусственного кровообращения. В пилотном исследовании с участием восьми дополнительных пациентов (такой же режим вентиляции) оценивался вклад системного (бронхиального) кровотока в легочный газообмен во время искусственного кровообращения.Для этого измеряли количество проникновения, диффундирующего из системной крови в бронхиальную систему.

    Полученные результаты: Легкое человека потребляет около 5-6 мл кислорода в минуту при температуре пищевода 28 ° C. Потребление кислорода всем телом перед обходным анастомозом, измеренное в почти нормотермических условиях, составило 198 +/- 28 мл / мин. Средние респираторные коэффициенты легких и всего тела были одинаковыми (0.84 и 0,77 соответственно). Экстраполяция потребления кислорода легкими до 36 градусов Цельсия предполагает, что легкие потребляют около 11 мл / мин или около 5% от общего потребления кислорода телом. Поскольку количество энфлурана, диффундирующего из большого круга кровообращения в бронхиальную систему во время искусственного кровообращения, составляло менее 0,1%, вклад бронхиального кровотока в газообмен легких можно считать незначительным.

    Выводы: Легкие потребляют около 5% кислорода, потребляемого всем телом.

    Армейский правитель Мьянмы берет на себя роль премьер-министра и снова пообещает выборы через несколько месяцев после того, как армия захватила власть у гражданского правительства.

    Выступая в воскресенье, Мин Аунг Хлаинг повторил обещание провести выборы к 2023 году и сказал, что его администрация готова работать с будущим региональным посланником по Мьянме.

    Объявление и речь были сделаны ровно через шесть месяцев после того, как 1 февраля армия захватила власть у гражданского правительства после выборов, на которых победила правящая партия Аунг Сан Су Чжи, но которые, по словам военных, были сфальсифицированы.

    Мин Аунг Хлаинг возглавил Совет государственного управления (SAC), который был сформирован сразу после переворота и с тех пор руководит Мьянмой, и его заменит временное правительство.

    «Чтобы быстро, легко и эффективно выполнять свои обязанности перед страной, совет государственной администрации был преобразован в временное правительство Мьянмы», — сообщил ведущий новостей государственного телевидения Myawaddy.

    В своем выступлении Мин Аунг Хлаинг повторил обещание восстановить демократию, заявив: «Мы выполним положения о чрезвычайном положении к августу 2023 года».

    Он добавил: «Я гарантирую создание союза, основанного на демократии. и федерализм ».

    Вскоре после переворота лидеры хунты пообещали новые выборы в течение двух лет. Упоминание воскресенья по август 2023 года было истолковано некоторыми местными СМИ как продление этого срока на шесть месяцев.

    Мин Аунг Хлаинг также заявил, что администрация будет работать с любым специальным посланником, назначенным Ассоциацией государств Юго-Восточной Азии (АСЕАН).

    Главнокомандующий вооруженными силами Мьянмы, старший генерал Мин Аунг Хлаинг выступает с речью на IX Московской конференции по международной безопасности в Москве, Россия, 23 июня 2021 года. Александр Земляниченко / Пул через REUTERS

    Подробнее

    АСЕАН Министры иностранных дел должны встретиться в понедельник, когда дипломаты заявляют, что они намерены окончательно назначить специального посланника, которому поручено положить конец насилию и способствовать диалогу между хунтой и ее противниками. подробнее

    Армия захватила власть после того, как правящая партия Су Чжи выиграла выборы, которые, как утверждают военные, были скомпрометированы мошенничеством.Он заявил, что его захват соответствует конституции. Избирательная комиссия страны отклонила обвинения в мошенничестве.

    После переворота 75-летняя Су Чжи была обвинена в нескольких преступлениях. Судебный процесс над ней по обвинению в незаконном хранении раций и нарушении протоколов коронавируса планируется возобновить в понедельник.

    МЕСЯЦЕВ ПРОТЕСТОВ

    Военные власти столкнулись с месяцами протестов, забастовок, парализовавших государственный и частный секторы, и возобновления вооруженных конфликтов в приграничных районах.

    Власти заклеймили своих оппонентов как террористов.

    «В настоящее время вся страна стабильна, за исключением некоторых террористических атак», — сказал Мин Аунг Хлаинг в своем выступлении.

    Группа активистов Ассоциации помощи политическим заключенным обвинила вооруженные силы в убийстве 939 человек в целях подавления инакомыслия после переворота и заявила, что по меньшей мере 6 990 военных противников были арестованы.

    Военные заявили, что число убитых протестующих намного меньше, и военнослужащие также погибли в результате насилия.Он заявил, что его ответ соответствовал международным нормам перед лицом угроз национальной безопасности.

    Отчетность Reuters По сценарию Кей Джонсон Под редакцией Кристофера Кушинга и Фрэнсис Керри

    Наши стандарты: принципы доверия Thomson Reuters.

    Мин. Ввод HTML Атрибут

    ❮ HTML тег

    Пример

    Использование атрибутов min и max:







    Попробуй сам »

    Определение и использование

    Атрибут min определяет минимальное значение для элемент.

    Совет: Используйте атрибут min вместе с max , чтобы создать диапазон допустимых значений.

    Примечание: макс. и мин. атрибуты работают со следующими типами ввода: число, диапазон, дата, местное время, месяц, время и неделя.


    Поддержка браузера

    Числа в таблице указывают первую версию браузера, полностью поддерживающую атрибут.

    Атрибут
    мин 5.0 10,0 16,0 5,1 10,6

    Синтаксис

    Значения атрибутов

    Значение Описание
    номер Определяет минимально допустимое значение
    дата Задает минимальную допустимую дату.

    ❮ HTML-тег

    Минимальная заработная плата

    График минимальной заработной платы в Калифорнии на 2017–2023 годы.

    Несмотря на некоторые исключения, почти все сотрудники в Калифорнии должны получать минимальную заработную плату в соответствии с требованиями законодательства штата.С 1 января 2017 года минимальная заработная плата для всех отраслей будет ежегодно повышаться. С 1 января 2017 года по 1 января 2022 года минимальная заработная плата будет увеличена для работодателей, на которых работает 26 и более сотрудников. Это повышение будет отложено на один год для работодателей, на которых работает 25 или менее сотрудников, с 1 января 2018 г. по 1 января 2023 г. Планируемое повышение может быть временно приостановлено губернатором на основании определенных решений. (Полный график повышения ставок см. В таблице ниже).

    Для получения дополнительной информации и рекомендаций по подсчету сотрудников с целью определения того, соответствует ли работодатель требованиям к работодателю с 25 сотрудниками или менее, см. Новые требования к фазе минимальной заработной платы на 2017-2023 годы, страница SB 3 «Часто задаваемые вопросы».

    Есть некоторые работники, которые освобождены от закона о минимальной заработной плате, например, внешние продавцы, физические лица, являющиеся родителями, супругами или детьми работодателя, а также ученики, регулярно заключаемые по контрактам в соответствии с Государственным отделом стандартов ученичества.

    Приказ о минимальной заработной плате (MW-2019)
    Исключение составляют учащиеся, независимо от возраста, которым может быть выплачено не менее 85 процентов минимальной заработной платы, округленной до ближайшего никеля, в течение первых 160 часов работы по профессиям, в которых у них нет предыдущего аналогичного или аналогичного опыта.

    Существуют также исключения для сотрудников с умственными или физическими недостатками, или для тех и других, а также для некоммерческих организаций, таких как защищенные мастерские или реабилитационные центры, в которых работают инвалиды.Таким лицам и организациям может быть выдана специальная лицензия Отделом по соблюдению трудовых норм, разрешающая трудоустройство при заработной плате ниже установленной законом минимальной заработной платы. Разделы 1191 и 1191.5 Трудового кодекса

    1.

    Какая минимальная заработная плата?

    С 1 января 2021 года минимальная заработная плата увеличивается до 14 долларов в час для работодателей с 26 и более сотрудниками и до 13 долларов в час для сотрудников с 25 или менее сотрудниками.Минимальная заработная плата будет корректироваться ежегодно до 2023 года в соответствии с предварительно установленным графиком, показанным выше.

    С 1 января 2021 года минимальная месячная зарплата пастухов увеличивается до 2488,97 долларов в месяц для работодателей с 26 и более сотрудниками и до 2 311,24 долларов в месяц для работодателей с 25 или менее сотрудниками. Минимальная месячная зарплата пастухов специально установлена ​​в Приказе IWC о заработной плате 14-2001. Заработная плата пастухов не может быть компенсирована питанием или жильем, предоставляемым работодателем.Вместо этого в Приказе IWC 14-2007, разделы 10 (F), (G) и (H)) есть положения, которые применяются к пастухам в отношении ежемесячных пособий на питание и проживания, которые должны предоставляться работодателем.

    2.

    В чем разница между минимальной заработной платой на местном уровне, уровне штата и федеральном уровне?

    Большинство работодателей в Калифорнии подчиняются как федеральному законодательству, так и законам штата о минимальной заработной плате.Также местные субъектам (городам и округам) разрешено устанавливать минимальные ставки заработной платы и несколько городов * недавно были приняты постановления, устанавливающие более высокую минимальную заработную плату для сотрудников, работающих в пределах их местной юрисдикции. Эффект от такого многократного охвата различными государственными источниками заключается в том, что при наличии противоречащих друг другу требований в законах работодатель должен следовать более строгим стандартам; то есть тот, который наиболее выгоден сотруднику .Таким образом, поскольку действующий закон Калифорнии требует более высокой минимальной заработной платы, чем федеральный закон, все работодатели в Калифорнии, на которые распространяются оба закона, должны платить минимальную заработную плату штата, если только их сотрудники не освобождены от уплаты налогов в соответствии с законодательством Калифорнии. Точно так же, если местный субъект (город или округ) установил более высокую минимальную заработную плату, работникам должна быть выплачена местная заработная плата, если она выше, чем минимальная заработная плата штата или федеральная минимальная заработная плата.

    3.

    Может ли работник согласиться работать за заработную плату ниже минимальной?

    Нет. Минимальная заработная плата является обязанностью работодателя и не может быть отменена никаким соглашением, включая коллективные договоры. Любые правовые акты, разработанные для защиты сотрудников, не могут быть нарушены по соглашению между работодателем и работником. Разделы 1668 и 3513 Гражданского кодекса

    4.

    Одинакова ли минимальная заработная плата как для взрослых, так и для несовершеннолетних?

    Да. Когда речь идет о выплате минимальной заработной платы, не делается различия между взрослыми и несовершеннолетними.

    5.

    Я работаю в ресторане официанткой.Может ли мой работодатель использовать мои чаевые в качестве кредита для выполнения своих обязательств по выплате мне минимальной заработной платы?

    Нет. Работодатель не имеет права использовать чаевые сотрудника в качестве кредита для выполнения своих обязательств по выплате минимальной заработной платы.

    6.

    Что делать, если работодатель не платит мне хотя бы минимальную заработную плату?

    Вы можете подать иск о заработной плате в Отдел по соблюдению трудовых норм (Управление комиссара по вопросам труда) или подать иск в суд против вашего работодателя о взыскании утерянной заработной платы.Кроме того, если вы больше не работаете у этого работодателя, вы можете подать иск о штрафе за время ожидания в соответствии с разделом 203 Трудового кодекса.

    7.

    Какая процедура выполняется после подачи заявления о заработной плате?

    После того, как ваше заявление будет заполнено и подано в местный офис Отдела по соблюдению трудовых норм (DLSE), оно будет передано заместителю комиссара по вопросам труда, который определит, исходя из обстоятельств заявления и представленной информации, как лучше всего продолжить.Первоначальным действием, предпринятым в отношении претензии, может быть направление на конференцию или слушание или отклонение претензии.

    Если будет принято решение о проведении конференции, стороны будут уведомлены по почте о дате, времени и месте конференции. Цель конференции — определить обоснованность претензии и посмотреть, можно ли разрешить претензию без слушания. Если претензия не решается на конференции, следующим шагом обычно является передача дела на слушание или прекращение его рассмотрения из-за отсутствия доказательств.

    В судебном заседании стороны и свидетели дают показания под присягой, процесс протоколируется. После слушания сторонам будет вручено приказ, решение или решение (ODA) Уполномоченного по вопросам труда.

    Любая из сторон может обжаловать ОПР в гражданском суде соответствующей юрисдикции. Суд передаст дело в суд, и каждая сторона будет иметь возможность представить доказательства и свидетелей. Доказательства и доказательства, представленные на слушании Уполномоченного по труду, не будут основанием для решения суда.В случае апелляции работодателя DLSE может представлять сотрудника, который финансово не может позволить себе адвоката в судебном разбирательстве.

    См. Брошюру «Правила и процедуры обработки заявлений о заработной плате» для получения более подробной информации о процедуре подачи заявлений о заработной плате.

    8.

    Что я могу сделать, если я выиграю слушание, а работодатель не оплачивает или не обжалует приказ, решение или решение?

    Когда приказ, решение или награда (ODA) вынесены в пользу работника и нет апелляции, и работодатель не выплачивает ODA, Отдел по соблюдению трудовых стандартов (DLSE) заставит суд включить ODA в качестве судебное решение против работодателя.Это решение имеет такую ​​же силу и действие, как и любое другое денежное решение, вынесенное судом. Следовательно, вы можете попытаться собрать решение самостоятельно или передать его DLSE.

    9. Что я могу сделать, если мой работодатель мстит мне за то, что я спросил его о невыплате минимальной заработной платы?

    Если ваш работодатель дискриминирует вас или преследует вас каким-либо образом, например, он увольняет вас, потому что вы спросили его, почему вам не платили минимальную заработную плату, или потому что вы подать иск или угрожать подать иск Уполномоченному по труду, вы можете подать жалобу о дискриминации / преследовании с офисом комиссара по труду.Кроме того, вы можете подать иск в суд против своего работодателя.

    Т-клеточная память, специфичная для SARS-CoV-2, поддерживается у выздоравливающих пациентов с COVID-19 в течение 10 месяцев с успешным развитием Т-клеток памяти, подобных стволовым клеткам

    Когорта исследования

    Мы набрали 101 человека с SARS-CoV- 2 инфекции. Пиковая степень тяжести заболевания оценивалась в соответствии с категорией тяжести заболевания NIH 19 : бессимптомное ( n = 7), легкое ( n = 46), умеренное ( n = 25), тяжелое ( n ). = 14) и критическое ( n = 9).Образцы цельной крови были взяты продольно (2–4 временных точки) у 56 пациентов или единовременно у 45 пациентов. Цельную кровь собирали через 1–317 дней после появления симптомов (DPSO). Наконец, всего было проанализировано 193 образца PBMC. Из 193 образцов PBMC 37 образцов были получены в острой фазе, когда вирусная РНК еще обнаруживалась (1–33 DPSO), и 156 образцов были получены в фазе выздоровления после отрицательной конверсии вирусной РНК (31–317 DPSO). В текущем исследовании мы определили острую фазу как 1–30 DPSO, а фазу выздоровления как 31–317 DPSO.Демографические и клинические характеристики включенных в исследование пациентов представлены в дополнительной таблице 1. Доля пациентов с бессимптомными, легкими, средними, тяжелыми и критическими заболеваниями в T1 (31–99 DPSO), T2 (100–199 DPSO) и T3. (≥200 DPSO) представлены в дополнительной таблице 2. Подробная информация об образцах крови, использованных в каждом анализе, суммирована в дополнительных данных 1.

    Т-клеточные ответы, специфичные для SARS-CoV-2, сохраняются через 10 месяцев после заражения

    Первый , мы выполнили прямые ex vivo интерферон-γ (IFN-γ) иммуноферментный анализ (ELISpot) после стимуляции PBMC с перекрывающимися пептидными (OLP) пулами, охватывающими спайк (S), мембрану (M) и нуклеокапсид (N) белки SARS-CoV-2.Количество пятен S-, M- и N-специфичного IFN-γ увеличивалось во время острой фазы. Впоследствии наблюдалась тенденция к снижению до 60–120 DPSO, и ответы IFN-γ сохранялись в течение 10 месяцев (рис. 1a). Эту кинетику также наблюдали при суммировании количества пятен S-, M- и N-специфического IFN-γ (рис. 1а). В каждом образце PBMC все три пула OLP равномерно вносили вклад в ответы IFN-γ без доминирования антигена (рис. 1b). Мы разделили образцы выздоравливающих на три группы на основе DPSO при отборе образцов: T1 (31–99 DPSO), T2 (100–199 DPSO) и T3 (≥200 DPSO).Мы не обнаружили существенной разницы в количестве пятен IFN-γ между группами (рис. 1c), а также поддержание равномерного вклада антигенов в ответ IFN-γ среди групп (дополнительный рис. 1). Затем мы сосредоточились на образцах, отслеживаемых в продольном направлении, от 39 человек в фазе выздоровления. S-, M- и N-специфические и суммарные количества пятен IFN-γ были стабильными во время фазы выздоровления (рис. 1d). Когда мы сравнивали парные образцы от одного и того же пациента в двух временных точках (t1, 31-100 DPSO; t2, ≥ 200 DPSO), мы не обнаружили значительной разницы в количестве пятен IFN-γ (рис.1д).

    Рис. 1. Специфические для SARS-CoV-2 ответы IFN-γ в течение 10 месяцев после заражения.

    образцов PBMC ( n = 159) от людей с инфекцией SARS-CoV-2 ( n = 87) и образцы до пандемии PBMC ( n = 8) от здоровых доноров ( n = 8) стимулировали OLP S, M или N (1 мкг / мл) в течение 24 ч, и пятнообразующие единицы IFN-γ-секретирующих клеток исследовали с помощью ELISpot. a Диаграммы разброса, показывающие взаимосвязь между ответами DPSO и IFN-γ.Черная линия представляет собой гладкую непараметрическую функцию LOESS, а серая заливка представляет 95% доверительный интервал. b Состав S-, M- или N-специфических ответов IFN-γ среди общих ответов IFN-γ у каждого индивидуума. c IFN-γ ответы сравнивали между T1 ( n = 49, 31–99 DPSO), T2 ( n = 41, 100–199 DPSO) и T3 ( n = 31, ≥200 DPSO. ). Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (IQR). d, e IFN-γ ответы были проанализированы в продольно отслеживаемых образцах ( n = 103) от 39 человек. d Диаграммы разброса, показывающие взаимосвязь между ответами DPSO и IFN-γ. Ответы и IFN-γ сравнивали между парными образцами в двух временных точках ( n = 15; t1, 31–100 DPSO; t2, ≥200 DPSO). Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Краскела-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна ( c ) или критерия знакового ранга Вилкоксона ( e ). n.s, не имеет значения.

    Чтобы отдельно исследовать Т-клеточные ответы CD4 + и CD8 + , специфичные для SARS-CoV-2, мы оценили Т-клеточные ответы, специфичные для SARS-CoV-2, с помощью анализов AIM 5,20,21 после стимуляции PBMC с пулами OLP S, M и N.Клетки CD137 + OX40 + считались SARS-CoV-2-специфическими клетками среди CD4 + Т-клеток, а CD137 + CD69 + клетки считались SARS-CoV-2-специфическими клетками среди CD8 . + Т-клеток 5 (рис. 2а, б). Мы подтвердили сильную положительную корреляцию между частотой клеток CD137 + OX40 + и частотами альтернативных клеток AIM + (OX40 + CD154 + или CD137 + CD154 + клеток) среди CD4 + Т-клетки (дополнительный рис.2). Частота S-, M- и N-специфических клеток CD137 + OX40 + среди Т-лимфоцитов CD4 + увеличивалась во время острой фазы, снижалась до 60 DPSO, а затем сохранялась в течение 10 месяцев (рис. 2в). Когда частота S-, M- и N-специфичных клеток CD137 + OX40 + была суммирована, наблюдалась аналогичная кинетика (рис. 2c). Частота CD137 + CD69 + клеток среди CD8 + Т-клеток была относительно низкой по сравнению с частотой CD137 + OX40 + клеток среди CD4 + Т-клеток, но демонстрировала аналогичную кинетику (Рис. .2в). Мы также наблюдали положительную корреляцию между частотой CD137 + OX40 + клеток среди CD4 + Т-клеток и частотой CD137 + CD69 + клеток среди CD8 + Т-клеток (дополнительный рис. 3).

    Рис. 2: Кинетика SARS-CoV-2-специфического маркера, индуцированного активацией (AIM) + Т-клеток.

    образцов PBMC ( n = 146) от людей с инфекцией SARS-CoV-2 ( n = 82) стимулировали OLP S, M или N (1 мкг / мл) в течение 24 часов.Частота AIM + (CD137 + OX40 + ) клеток среди CD4 + Т-клеток и частота AIM + (CD137 + CD69 + ) клеток среди CD8 + T клетки были проанализированы. Типичные графики проточной цитометрии, показывающие частоту клеток AIM + среди CD4 + ( a ) или CD8 + ( b ) Т-клеток. c Диаграммы разброса, показывающие взаимосвязь между DPSO и частотой клеток AIM + среди CD4 + (слева) или CD8 + (справа) Т-клеток.Черный цвет — это сглаженная непараметрическая функция LOESS, а серый цвет представляет 95% доверительный интервал.

    Мы также измерили уровень антител IgG, специфичных к SARS-CoV-2 S-рецептор-связывающему домену (RBD), и нейтрализующую активность SARS-CoV-2 в образцах плазмы выздоравливающих пациентов с COVID-19. Мы обнаружили, что уровень RBD-специфических антител со временем снижался, в то время как уровень нейтрализующей активности сохранялся (дополнительный рис. 4a). При статистическом анализе временных точек T1 (31–99 DPSO), T2 (100–199 DPSO) и T3 (≥200 DPSO) уровень RBD-специфических антител значительно снизился, а уровень нейтрализующей активности — нет (дополнительный рис. .4б). Мы не наблюдали значимой корреляции между долгосрочными (≥200 DPSO) SARS-CoV-2-специфическими Т-клеточными ответами, оцененными с помощью IFN-γ ELISpot и анализами AIM, и уровнями антител (дополнительный рисунок 4c, d). В совокупности эти результаты показывают, что Т-клеточные ответы, специфичные для SARS-CoV-2, продолжаются более 10 месяцев у выздоравливающих пациентов с COVID-19, хотя ответ антител, специфичных для SARS-CoV-2, может снижаться.

    SARS-CoV-2-специфические T

    SCM клетки развиваются после заражения

    Затем мы исследовали статус дифференцировки SARS-CoV-2-специфичных AIM + Т-клеток на основе экспрессии CCR7 и CD45RA в CD4 + (рис.3a) и CD8 + (рис. 3b) популяции Т-клеток. Среди SARS-CoV-2-специфичных AIM + CD4 + Т-клеток доля CCR7 + CD45RA (T CM ) клеток поддерживалась в среднем примерно на 50% в течение периода исследования. и доля клеток CCR7 CD45RA (T EM ) увеличивалась в среднем до ~ 35% до 60 DPSO, а затем поддерживалась после этого (фиг. 3c). CCR7 CD45RA + (T EMRA ) клетки были второстепенной популяцией (<5%; рис.3в). Примечательно, что доля клеток CCR7 + CD45RA + , которые включают как наивные клетки, так и клетки T SCM , составляла в среднем ~ 30% в острой фазе, снижаясь до ~ 10% в среднем на 60 DPSO, а затем сохранялась. после этого (рис. 3c).

    Рис. 3. Статус дифференцировки Т-клеток AIM + , специфичных для SARS-CoV-2.

    и образцов PBMC ( n = 146) от людей с инфекцией SARS-CoV-2 ( n = 82) стимулировали OLP S, M или N (1 мкг / мл) в течение 24 часов. и экспрессия CCR7 и CD45RA была проанализирована в AIM + (CD137 + OX40 + ) CD4 + ( a, c ) и AIM + (CD137 + CD69 + ) CD8 + ( b, d ) Т-клеток.Стратегии стробирования для идентификации каждого подмножества памяти среди Т-клеток AIM + CD4 + ( a ) или AIM + CD8 + ( b ). Диаграммы разброса, показывающие взаимосвязь между DPSO и долей указанных подмножеств среди Т-клеток AIM + CD4 + ( c ) или AIM + CD8 + ( d ). и образцов PBMC ( n = 68) от выздоравливающих пациентов с COVID-19 ( n = 59) стимулировали OLP S, M или N (1 мкг / мл) в течение 24 часов с частотой T клеток SCM (CCR7 + CD45RA + CD95 + ) анализировали в Т-клетках AIM + CD4 + (верхний) и AIM + CD8 + (нижний).Слева: стратегия стробирования для идентификации ячеек T SCM . Справа — точечные диаграммы, показывающие взаимосвязь между DPSO и долей клеток T SCM среди AIM + CD4 + или AIM + CD8 + Т-клеток. Черная линия представляет собой гладкую непараметрическую функцию LOESS, а серая заливка представляет 95% доверительный интервал ( c, d, e ).

    Среди SARS-CoV-2 AIM + CD8 + Т-клеток доля CCR7 + CD45RA (T CM ) клеток составляла в среднем ~ 20% в острой фазе и постепенно снижалась в течение периода исследования (рис.3d). Доля клеток CCR7 CD45RA (T EM ) увеличивалась в среднем до 50% до 60 DPSO и поддерживалась после этого (фиг. 3d). Доля клеток CCR7 CD45RA + (T EMRA ) и клеток CCR7 + CD45RA + поддерживалась (в среднем ~ 25% и 25-35% соответственно) в течение периода исследования (рис. . 3d).

    Мы дополнительно исследовали, включают ли клетки CCR7 + CD45RA + клетки T SCM , которые обладают способностью к самообновлению и мультипотентностью для дифференцировки в различные подмножества Т-клеток, исследуя CD95, маркер T SCM . ячейки 15,16 .Как в AIM + CD4 + , так и в AIM + CD8 + Т-клетки, клетки CD95 + были доминирующей популяцией среди клеток CCR7 + CD45RA + (рис. 3e), что указывает на то, что CCR7 + CD45RA + клеток среди AIM + CD4 + или AIM + CD8 + Т-клетки — это в основном клетки T SCM . Частота T SCM клеток среди Т-клеток AIM + CD4 + и AIM + CD8 + постепенно увеличивалась до 120 DPSO, когда она достигла стабильного плато (рис.3д). Мы не обнаружили существенной разницы в частоте T SCM клеток среди AIM + CD4 + и AIM + CD8 + Т-клеток между T1 (31–99 DPSO), T2 (100–199 DPSO). , и T3 (≥200 DPSO; дополнительный рис. 5a, b).

    Успешное развитие SARS-CoV-2-специфичных клеток T

    SCM подтверждено прямым окрашиванием ex vivo MHC-I мультимера

    Для проверки результатов анализов AIM на основе стимуляции in vitro мы обнаружили SARS-CoV-2 -специфические Т-клетки CD8 + путем прямого окрашивания ex vivo мультимера MHC-I и исследовали статус дифференцировки клеток мультимера MHC-I + .Мы использовали мультимер HLA-A * 02, нагруженный пептидом SARS-CoV-2 S 269 (YLQPRTFLL), который имеет низкую степень гомологии с коронавирусами простуды человека (ccCoVs) 22,23 . Клетки MHC-I multimer + были обнаружены в течение периода исследования до 234 DPSO (рис. 4a, b), и мы определили пропорции T CM (CCR7 + CD45RA ), T EM (CCR7 CD45RA ), T EMRA (CCR7 CD45RA + ) и T SCM (CCR7 + CD45RA + CD95 + ) среди ячеек мультимер + ячеек (рис.4в). Мультимеры MHC-I, специфичные для вируса гриппа A (IAV) и цитомегаловируса (CMV), также использовали для окрашивания PBMC от здоровых доноров. Подобно данным AIM + CD8 + Т-клетки, клетки T EM и T EMRA были доминирующими популяциями среди SARS-CoV-2-специфичных мультимерных клеток MHC-I + , тогда как T Клетки CM были незначительной популяцией в течение периода исследования (рис. 4d). Среди IAV- и CMV-специфичных клеток мультимера + MHC-I от здоровых доноров преобладали клетки T EM и T EMRA , тогда как клетки T CM обнаруживались редко.Клетки T SCM также были обнаружены среди SARS-CoV-2-специфичных клеток мультимера + MHC-I в течение периода исследования, но не среди IAV- и CMV-специфических клеток (рис. 4d). В частности, частота клеток T SCM среди SARS-CoV-2-специфичных клеток MHC-I multimer + была высокой — 60–125 DPSO.

    Рис. 4. Частота и статус дифференцировки Т-клеток MHC-I, специфичных для SARS-CoV-2, + .

    образцов PBMC ( n = 15) от людей с инфекцией SARS-CoV-2 ( n = 11) были проанализированы методом проточной цитометрии. a Типичные графики проточной цитометрии, показывающие ex vivo обнаружение SARS-CoV-2 S 269 мультимера + CD8 + Т-клеток в воротах CD3 + Т-клеток. b График разброса, показывающий взаимосвязь между DPSO и частотой SARS-CoV-2 S 269 мультимерных + клеток среди общего количества CD8 + Т-клеток. Образцы от одного пациента соединены сплошными линиями. Экспрессию CCR7, CD45RA и CD95 анализировали в Т-клетках SARS-CoV-2 S 269 + CD8 + .Также были проанализированы клетки IAV MP 58 multimer + ( n = 5) и CMV pp65 495 multimer + ( n = 6) из PBMC здоровых доноров. Репрезентативные графики проточной цитометрии ( c ) показывают долю указанных подмножеств среди клеток мультимера + , а диаграммы разброса ( d ) показывают взаимосвязь между DPSO и долей указанных подмножеств среди SARS-CoV-2 S 269 мультимер + ячеек.Образцы от одного пациента соединены сплошными линиями. Также представлены сводные данные, показывающие долю указанных подмножеств среди клеток мультимера IAV + и мультимера CMV + ( d ). Горизонтальные линии обозначают медианное значение. e Репрезентативный график проточной цитометрии (вверху) и сводные данные (внизу), показывающие процент клеток PD-1 TIGIT среди SARS-CoV-2 S 269 мультимер + CD8 + T SCM клеток и всего SARS-CoV-2 S 269 мультимеров + CD8 + Т-клеток.Статистический анализ проводился с использованием двустороннего знакового рангового критерия Вилкоксона ( e ).

    Недавнее исследование выявило два разных подмножества CCR7 + -подобных предшественников стволовых клеток: CCR7 + PD-1 TIGIT клетки со стволовыми клетками и CCR7 + PD-1 + TIGIT + клеток с исчерпанными признаками 23,24 . Поэтому мы сравнили процентное содержание клеток PD-1 TIGIT среди клеток MHC-I multimer + CD8 + T SCM с процентом среди мультимеров MHC-I + CD8 + Т-клетки.Мы обнаружили, что частота клеток PD-1 TIGIT была значительно выше среди клеток MHC-I multimer + CD8 + T SCM (рис. 4e), подтверждая, что SARS-CoV-2 -специфические клетки T SCM являются настоящими стволовыми клетками памяти.

    Мы провели дополнительные эксперименты, чтобы изучить подробные свойства стволовых клеток SARS-CoV-2-специфичных клеток T SCM . Мы использовали PBMC, полученные от 110 до 140 DPSO ( n = 3), и отсортировали SARS-CoV-2 AIM + (CD137 + ) CD8 + T SCM (CCR7 + CD45RA + CD95 + ) клеток.Затем мы пометили их CellTrace Violet (CTV), стимулировали их пулом S OLP в течение 7 дней и оценили их распространение. Мы наблюдали устойчивую пролиферацию SARS-CoV-2-специфичных клеток T SCM (дополнительный рис. 6a). Мы также исследовали, дифференцируются ли клетки T SCM , специфичные для SARS-CoV-2, в другие подмножества памяти после стимуляции пулом S OLP в течение 7 дней, и обнаружили, что клетки T SCM дифференцировались в различные подмножества памяти, составляющие ~ 72% T EM , 10% T EMRA , 7% T CM и 10% T SCM ячеек (дополнительный рис.6б). Мы также оценили способность к самообновлению клеток T SCM после стимуляции IL-15, гомеостатическим цитокином, в течение 5 дней и наблюдали устойчивую пролиферацию SARS-CoV-2-специфичных CD4 + и CD8 + T SCM ячеек (дополнительный рис. 6c). Основываясь на наших результатах, что SARS-CoV-2-специфические клетки T SCM демонстрируют мощную пролиферативную способность и мультипотентность для восстановления различных подмножеств памяти, мы ожидаем, что SARS-CoV-2-специфические Т-клетки памяти могут надежно пролиферировать и дифференцироваться в эффекторные клетки. клетки при повторном контакте с SARS-CoV-2.

    Полифункциональность и способность к пролиферации сохраняются в Т-клетках, специфичных для SARS-CoV-2 в течение длительного периода времени

    Как мы наблюдали образование клеток T SCM , специфичных для SARS-CoV-2, обладающих способностью к самообновлению и мультипотентностью, мы Цель исследования — изучить кинетику полифункциональности Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2, в течение периода исследования. С этой целью мы выполнили внутриклеточное окрашивание цитокинов IFN-γ, IL-2, TNF и CD107a после стимуляции OLP-пулами S, M и N и проанализировали полифункциональность CD4 + и CD8 + Т-клеток. (Инжир.5а). Мы определили полифункциональные клетки как клетки, проявляющие положительную реакцию на ≥2 эффекторных функций. Среди SARS-CoV-2-специфичных CD4 + и CD8 + Т-клеток средняя доля полифункциональных клеток составляла 25-40% и 30-50%, соответственно, 60 DPSO и поддерживалась до 254 DPSO (рис. 5б). Мы не обнаружили существенной разницы в частоте полифункциональных клеток среди Т-лимфоцитов CD4 + и CD8 + , специфичных для SARS-CoV-2, между T1 (31–99 DPSO), T2 (100–199 DPSO) и T3 ( ≥200 DPSO; рис.5в). Сохраненная полифункциональность среди SARS-CoV-2-специфичных CD4 + и CD8 + Т-клеток также наблюдалась, когда полифункциональность оценивалась по количеству положительных эффекторных функций (рис. 5d).

    Рис. 5. Полифункциональность и способность к пролиферации Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2.

    образцов PBMC ( n = 90) от людей с инфекцией SARS-CoV-2 ( n = 39) стимулировали OLP S, M или N (1 мкг / мл) в течение 6 часов.Окрашивание внутриклеточных цитокинов проводили для изучения частоты полифункциональных клеток, проявляющих положительную реакцию на ≥2 эффекторных функций среди SARS-CoV-2-специфичных CD4 + и CD8 + Т-клеток. a Типичные графики проточной цитометрии, показывающие частоту полифункциональных клеток среди CD4 + (слева) и CD8 + (справа) Т-клеток. b Диаграммы разброса, показывающие взаимосвязь между DPSO и частотой полифункциональных клеток среди Т-лимфоцитов CD4 + , специфичных для SARS-CoV-2 (верхний) или CD8 + (нижний).Черная линия представляет собой гладкую непараметрическую функцию LOESS, а серая заливка представляет 95% доверительный интервал. c Доля полифункциональных клеток среди SARS-CoV-2-специфических CD4 + (слева) или CD8 + (справа) Т-клеток сравнивалась между T1 ( n = 17, 31–99 DPSO), T2 ( n = 39, 100–199 DPSO) и T3 ( n = 25, ≥200 DPSO). Данные представлены в виде медианы и IQR. d Круговые диаграммы, показывающие долю клеток, положительных для данного количества функций, среди Т-клеток CD4 + (слева) или CD8 + (справа), специфичных для SARS-CoV-2.Каждая дуга на круговой диаграмме представляет указанную функцию. e CTV-меченные PBMC ( n = 18), полученные после 200 DPSO, были стимулированы пулом S OLP (1 мкг / мл) в течение 120 часов и частотой CTV low и Ki-67 + клеток среди Анализировали CD4 + и CD8 + Т-клетки. Представлены репрезентативные графики (вверху) и сводные данные (внизу). Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Краскела-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна ( c ) или двустороннего знакового рангового критерия Вилкоксона ( e ).n.s, не имеет значения.

    Мы также исследовали способность к пролиферации, индуцированной антигеном, Т-лимфоцитов памяти, специфичных для SARS-CoV-2. Мы выполнили анализы разведения CTV и окрашивание Ki-67 с использованием PBMC, полученных после 200 DPSO. CD4 + и CD8 + Т-клетки проявляли значительный пролиферативный ответ после стимуляции in vitro пулом S-OLP (рис. 5e), что указывает на то, что SARS-CoV-2-специфические Т-клетки памяти вызывают быстрые ответные реакции на вирусные повторные реакции. -экспозиция.

    Учитывая сохраненную полифункциональность и способность к пролиферации Т-клеток памяти, специфичных для SARS-CoV-2, текущие данные показывают, что Т-клетки памяти вносят вклад в защитный иммунитет против повторного заражения даже через 10 месяцев после первичного заражения.

    Т-клеточная память, специфичная для SARS-CoV-2, сохраняется независимо от тяжести заболевания

    Для определения влияния тяжести заболевания во время острой инфекции на формирование долгосрочного (≥200 DPSO) SARS-CoV-2 -специфической Т-клеточной памяти, мы сравнили долгосрочные Т-клеточные ответы, специфичные для SARS-CoV-2, между бессимптомной / легкой группой пациентов и умеренной / тяжелой / критической группой пациентов. В этом сравнении мы проанализировали величину ответа, оцененную с помощью тестов IFN-γ ELISpot и AIM, а также долю полифункциональных клеток и клеток T SCM среди SARS-CoV-2-специфических Т-клеток памяти.Мы не обнаружили существенной разницы ни в одном из параметров между двумя группами (дополнительный рис. 7a – d).

    Недавнее исследование показало, что через 6 месяцев после заражения бессимптомные люди имеют более низкие Т-клеточные ответы, специфичные для SARS-CoV-2, чем люди, выздоровевшие после симптоматической инфекции 25 . В другом исследовании сообщалось о схожих ответах Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2, между бессимптомными людьми и пациентами с симптомами COVID-19, но у бессимптомных людей ответы Т-клеток могут снижаться быстрее 26 .Поэтому мы сравнили долговременную (≥200 DPSO) Т-клеточную память между бессимптомными и симптоматическими группами. Мы не смогли найти существенной разницы в количестве пятен IFN-γ между двумя группами (дополнительный рисунок 8).

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *