Бассейн бм пермь официальный сайт: Плавательный бассейн | Бассейн БМ

Содержание

Пермские пловцы просят открыть бассейны для тренировок – Коммерсантъ Пермь

Родители юных пермских спортсменов-пловцов обратились в краевое заксобрание с заявлением, что чиновники Прикамья не выполняют указ Минспорта РФ. Об этом сообщила руководитель фракции «Справедливая Россия» в Законодательном собрании Пермского края Дарья Эйсфельд в своем Facebook. Речь идет о документе от 8 июля, в котором регионам рекомендовано возобновить проведение всероссийских и межрегиональных спортивных соревнований и, соответственно, возобновить тренировочные процессы для спортсменов.

«На официальном сайте Всероссийской федерации плавания размещен новый календарь спортивных мероприятий на 2020 год. Уже на начало октября выставлены даты серьезных соревнований, в которых сборная Пермского края должна принимать участие: чемпионаты и первенства федеральных округов РФ; отбор на финал X летней спартакиады учащихся России. Однако до настоящего времени спортсмены Пермского края не приступили к тренировкам, в то время как сборные других регионов (Казань, Ижевск, Екатеринбург, Уфа и другие) тренируются и готовятся к участию в значимых для спортсменов соревнованиях»,— пишет Дарья Эйсфельд.

Напомним, во второй половине марта из-за угрозы COVID-19 краевое правительство в соответствии с распоряжением федеральных властей начало отменять спортивные мероприятия всех уровней. Позже были приостановлены тренировки команд. С 5 июня тренировки вновь были разрешены, открылись спортивные арены и другие объекты, но только для профессиональных игроков, групп спортивного совершенствования высшего спортивного мастерства, а также для учащихся спортивных школ и школ олимпийского резерва. Позже возобновилась работа открытых стадионов.

На сайте краевого минспорта опубликован перечень спортивных организаций, допущенных до проведения тренировочного процесса, среди них — пермская спортивная школа водных видов спорта. Пермских бассейнов «БМ» и «Олимпия-Пермь» в данном списке нет. Однако, по словам лидера «Справедливой России», в «БМ» занимается 291 спортсмен, в «Олимпии» — 199.

В ответ на запрос чиновницы в краевое минспорта ведомство направило письмо, в котором сказано, что «БМ» не является организацией, осуществляющей деятельность по спортивной подготовке спортсменов.

В министерстве пояснили, что бассейн «БМ» действительно не занимается спортивной подготовкой спортсменов. «Дело в том, что этими полномочиями наделены только спортивные школы, а в „БМ“ работают коммерческие группы. КМС и МС, как и другие разряды, спортсмены выполняют на официальных соревнованиях. Основанием для отказа в открытии бассейна для тренировочного процесса спортсменов прослужило неверное обоснование, которое не предусмотрено в указе губернатора. Необходимо внести правки в заявку, чтобы получить допуск. При этом обращаем внимание, что тренировочный процесс возобновился только для групп спортивного совершенствования и высшего спортивного мастерства. Для всех остальных групп бассейны закрыты. Согласно рекомендациям Роспотребнадзора, открытие бассейнов возможно на третьем этапе снятия ограничений, Пермский край сейчас находится на втором этапе»,— прокомментировали в пресс-службе ведомства.

В Перми прошло открытое первенство города по плаванию «Мемориал Людмилы Моняковой».

24 марта, 12:33

В Перми прошло открытое первенство города по плаванию «Мемориал Людмилы Моняковой».

Как рассказали в комитете по физической культуре и спорту администрации Перми, в соревнованиях, которые состоялись в бассейне БМ, приняли участие спортсмены разных возрастных групп из Перми, Березников, Губахи, Осы, Чайковского, Краснокамска, Кирова, Воткинска. Удачно на этих соревнованиях выступили пловцы из краевого центра, собрав богатый «урожай» медалей.

Так, среди девушек разных возрастных групп, дисциплин и дистанций, победителями стали: Александра Курбатова (она победила на четырех дистанциях), Валерия Конева (она победила на трех дистанциях), Александра Санникова, Варвара Симонова, Дарья Медведенко, Анна Тудорович, Галина Жуланова, Дарья Сазина (все представители бассейна БМ), Маргарита Гусева (она победила на двух дистанциях), Дарья Муллакаева (обе воспитанницы бассейна «Олимпия»).

Серебряные медали завоевали: Варвара Симонова (она финишировала второй на трех дистанциях), Дарья Медведенко, Дарья Сазина (они показали второй результат на двух дистанциях), Евгения Пермякова, Мария Чумарина, Анна Тудорович (все представители бассейна БМ), Влада Коломыцева, Елизавета Оплетина (представители бассейна «Олимпия»).

Бронзовые медали достались: Александре Барсуковой («Олимпия»), Ксении Стрелковой (обе они финишировали третьими на двух дистанциях), Евгении Пермяковой, Валерии Коневой, Дарье Медведенко, Екатерине Брызгаловой, Александре Санниковой, Алине Литвиненко (все представители БМ), Дарье Муллакаевой, Маргарите Гусевой, Владе Коломыцевой (все представляют «Олимпию»), Ксении Фроловой, Дарье Тарасовой, Ольге Голдобиной (все представители ДЮСШ Свердловского района Перми).

Отлично выступили на этих соревнованиях и пермские юноши. Так, в разных возрастных группах, дисциплинах и дистанциях победителями стали: Никита Жуланов (он первенствовал на 4 дистанциях), Евгений Субботин (он первенствовал на трех дистанциях), Егор Субботин, Егор Субботин (они первенствовали на двух дистанциях), Эдуард Салихов, Михаил Хорунжий (все представители БМ), Константин Кочуров, Андрей Коношок (оба представители «Олимпии»).

Серебряные медали завоевали: Герман Ящак (он был вторым на трех дистанциях), Михаил Хорунжий (он был вторым на двух дистанциях), Егор Субботин, Сергей Селезнев, Данил Семериков, Роман Крафт, Павел Краснов, Валерий Артамонов, Дмитрий Двойников, Никита Семенов (все представители БМ), Константин Кочуров, Павел Матвиенко, Андрей Коношок (все представители «Орленка»), Дмитрий Шубин, Артур Мерзляков (он финишировал вторым на двух дистанциях). Двое последних — представители ДЮСШ Свердловского района Перми.

Бронзовые медали достались: Сергею Селезневу, Евгению Столярову, Кириллу Лунегову (все трое были третьими на двух дистанциях), Даниилу Козинцеву, Дмитрию Двойникову, Данилу Семерикову, Кириллу Лунегову, Эдуарду Салихову, Михаилу Хорунжий, Александру Тетеркину, Евгению Субботину, Савелию Слепову, Никите Семенову, Вячеславу Мелентьеву, Максиму Вяткину, Вячеславу Санникову, Артему Ключинскому, Юрию Шарыкину (все представители БМ), Даниилу Фоменко (ДЮСШ Свердловского района Перми), Павлу Матвиенко, Константину Кочурову (оба представителя «Олимпии»).

Дополнительная информация:
Сергей Онорин —
212-68-50, 8-904-84-83-602.

БМ Пермь официальный профиль: цена, отзывы

О клубе

Краткая информация

Фитнес-клуб «БМ» в Перми находится по адресу ул. Коминтерна, 25. Фитнес-клуб «БМ» предоставляет услуги: бассейн, тренажерный зал, фитнес, детский фитнес, тренировки с тренером. Стоимость занятий в месяц от 1800 q.

Спортивный комплекс БМ — здесь вы можете общаться о спорте и общих интересах. Цель и задача комплекса: привить здоровый образ жизни и занятия спортом. Привлечение молодёжи. Занятие в бассейне дает много положительных эмоций и дают массу других немаловажных преимуществ: делают вас сильнее, укрепляют сердце и сосуды, развивают гибкость, повышают выносливость, замедляют старение, повышают иммунитет.

Время работы

Сейчас открыто (07:00-23:00)

Понедельник 07:00-23:00

Вторник 07:00-23:00

Среда 07:00-23:00

Четверг 07:00-23:00

Пятница 07:00-23:00

Суббота 08:00-23:00

Воскресенье 08:00-23:00

Цены

1 месяц

8 посещений

Направления

Отзывы про БМ (0)

Авторизоваться, чтобы оставить ваш отзыв

Олимпийская дистанция.

Топ-10 «длинных» бассейнов ПФО | Чувашская республика

После олимпийского триумфа в Сочи Россия готовится к следующей, летней Олимпиаде, которая пройдет в 2016 году в Рио-де-Жанейро. На этом фоне показательно, как в одночасье стала знаменитой фраза футбольного комментатора Владимира Стогниенко: «Хотите играть как немцы – вкладывайте деньги в детские спортивные школы, а не в огромные трансферы».

После олимпийского триумфа в Сочи Россия готовится к следующей, летней Олимпиаде, которая пройдет в 2016 году в Рио-де-Жанейро. На этом фоне показательно, как в одночасье стала знаменитой фраза футбольного комментатора Владимира Стогниенко: «Хотите играть как немцы – вкладывайте деньги в детские спортивные школы, а не в огромные трансферы». В уверенной победе России в сочинском медальном зачете немалый вклад принадлежит легионерам, а молодыми звездами российского происхождения может похвастаться только разве что фигурное катание. Поэтому вопрос о том, а стал ли спорт доступнее, отнюдь не праздный.

Сегодня мы решили обратить внимание на плавание. Без золотых наград в плавании Россия, родина великих Александра Попова и Владимира Сальникова, остается четыре олимпиады подряд. Между тем, как удалось выяснить «ФедералПресс.Приволжье», найти полноразмерный бассейн с «олимпийской» (50 м) дистанцией в Приволжском федеральном округе не так просто. В нескольких региональных столицах таких бассейнов просто нет. Целый ряд школ олимпийского резерва в ПФО тренирует будущих чемпионов в 25-метровых «водоемах». «ФедералПресс.Приволжье» составил топ-10 лучших бассейнов Приволжского федерального округа с олимпийской дорожкой – 50 метров.


КСК «Олимп» при Казанском национальном исследовательском техническом университете

Официальный сайт

Один из крупнейших спортивных объектов Казани. В его состав входят крытый плавательный бассейн на 10 дорожек, универсальный спортивный зал с тренажерами, матами для единоборств, боксерским рингом и залом «сухого плавания», а также футбольный стадион.

В спорткомплексе тренируются университетские команды по разным видам спорта, а в бассейне – команда университета по водному поло и воспитанники детско-юношеских спортивных школ по водному поло и плаванию.

Во время Универсиады здесь проходили соревнования по водному поло и баскетболу. На Чемпионате Европы по подводному плаванию в бассейне «Олимп» были установлены три мировых рекорда.

Спортивный комплекс «Олимпия», Пермь

Официальный сайт

Крупнейший и самый современный спорткомплекс Пермского края включает в себя большой 50-метровый бассейн на 10 дорожек, прыжковый с гидромассажной зоной и детский бассейны. Это единственный в Прикамье бассейн, имеющий лицензию на проведение международных соревнований.

В «Олимпии» обучают плаванию детей и взрослых – ежегодно бассейн посещают более двух тысяч ребят, в том числе и воспитанники детских домов. Работают спортивные секции плавания, водного поло и плавания в ластах. Тренеры спорткомплекса подготовили спортсменок, достойно выступающих на первенствах России и всероссийских соревнованиях по синхронному плаванию. В «Олимпии» регулярно проводятся городские и краевые соревнования среди учеников школ и воспитанников детдомов.

Бассейн находится в совместной собственности Пермского края и Перми. В ближайшие годы планируется провести масштабную реконструкцию; возможно, здесь появится еще одна ванна, что позволит создать на базе «Олимпии» мощную базу для подготовки спортсменов к самым важным соревнованиям, включая Олимпийские игры, а также принимать соревнования любого уровня.

В бассейне можно заняться дайвингом, а спорткомплекс предлагает услуги фитнес-центра, центра кинезитерапии и SPA-центра.


Дворец водных видов спорта, Йошкар-Ола

Официального сайта нет.

Дворец водных видов спорта открыт в Йошкар-Оле в 2007 году. Это первое подобное спортивное сооружение в Марий Эл, позволяющее проводить соревнования любого уровня. Во дворце работают два бассейна – большая чаша с десятью 50-метровыми дорожками и малая чаша для занятий детей с полутора лет.

В ДВС тренируются ежедневно около 300 учащихся СДЮШОР по плаванию и синхронному плаванию. Кроме того, в бассейне работают группы по обучению плаванию детей и взрослых, по аквааэробике, а для самых маленьких – группы «Мать и дитя».

Дворец водного спорта «Сура», Пенза

Официальный сайт

«Сура» – современный центр подготовки спортсменов высшего спортивного мастерства и олимпийского резерва по плаванию, прыжкам в воду, триатлону и водному поло. Введен в эксплуатацию в июне 2010 года. К 2014 году в нем занимались уже более 1600 воспитанников школы олимпийского резерва. Здесь тренируют будущих чемпионов по плаванию, водному поло, прыжкам в воду и триатлону. Обучение бесплатное.

Дополнительные услуги – бассейн для прыжков в воду, детская ванна для обучения плаванию, зал «сухой» подготовки пловцов с тренажерами и игровой зоной, спортзал для подготовки спортсменов по прыжкам в воду, конференц-зал, детский городок с игровыми тренажерами.

Кроме того, в «Суре» есть секция аквааэробики, оздоровительные группы и даже обучающие занятия с родителями по программе «Грудничковое плавание».

Бассейн «Буревестник», Казань

Официального сайта нет.

Бассейн расположен на территории Деревни Универсиады. В 2011 году в «Буревестнике» состоялся международный турнир по водному поло Kazan Cup.

В бассейне работают детские спортивные группы по плаванию и водному поло, а также универсальный спортивный зал, спортивный зал для «сухого плавания» и тренажерный зал.

Бассейн ЦСК ВВС, Самара

Официальный сайт

Бассейн ЦСК ВВС – самый крупный плавательный комплекс в Самаре, в состав которого входят два бассейна: открытый и закрытый. Сегодня это один из трех открытых олимпийских бассейнов в стране. Закрытый бассейн до 2001 года из-за ошибки строителей имел длину всего 49,96 м, что делало невозможным проведение в нем соревнований. Однако масштабная реконструкция решила эту проблему.

На территории спортивного комплекса работают единственная школа спортивного плавания в Самаре, а также школа синхронного плавания. Среди тренеров – заслуженные мастера спорта и мастера спорта международного класса. Кроме того, в спорткомплексе дислоцируется одна из четырех в России спортивных рот Вооруженных сил РФ.

Бассейн «Саратов», Саратов

Официального сайта нет.

Самый крупный в Саратове бассейн (9 дорожек) является частью спортивного комплекса «Кристалл». Оборудован вышками высотой 3,5 и 10 метров. Каждый год весной бассейн «Саратов» закрывается на ремонт и открывается только в октябре.

В бассейне проводятся занятия по триатлону, морскому многоборью, плаванию, водному поло, синхронному плаванию, прыжкам в воду, скоростному плаванию в ластах и воднолыжному спорту.

Спортивная школа олимпийского резерва «Дельфин», Нижний Новгород

Официальный сайт

«Дельфин» открыт в 1968 году. Единственный в городе «олимпийский» бассейн на 8 дорожек имеет вышки для прыжков в воду от 3 до 10 метров, спортивный и тренажерный залы, оборудован трибунами для зрителей на 500 человек.

Сейчас в спортшколе занимается более тысячи человек по пяти видам спорта – плавание, водное поло, синхронное плавание, плавание в ластах, а также хоккей на траве. Еще около 350 детей занимаются в платных спортивно-оздоровительных группах. Наиболее перспективные юные спортсмены по окончании обучения зачисляются в группы начальной подготовки школы олимпийского резерва «Дельфин». Среди воспитанников школы – серебряные и бронзовые призеры российских и мировых чемпионатов.

Сейчас бассейн закрыт на ремонт.

Бассейн БМ, Пермь

Официальный сайт

Бассейн был построен в 1977 году по типовому проекту. Уже в 1980 году в нем провели капремонт – для отделки был использован мрамор. Кроме большого бассейна на 8 дорожек, есть детский «Аквамарин» (12 на 4 метра).

При БМ уже 10 лет работает спортивная школа плавания, в которой занимается около 200 детей. В школе работают два отделения – спортивного плавания и плавания в ластах. За время существования школы здесь подготовили трех мастеров спорта международного класса по подводному спорту, восемь мастеров спорта России по плаванию и 12 мастеров спорта России по подводному спорту. Чтобы попасть в школу, сначала нужно пройти обучение в абонементных группах.

Также в БМ есть тренажерный зал, игровой зал, студия фитнеса и йоги, проводятся занятия по аквааэробике.

Физкультурно-оздоровительный комплекс «Быстрица», Киров

Официального сайта нет.

Единственный в Кирове 50-метровый бассейн открыт в августе прошлого года. До этого воспитанники школы олимпийского резерва Кирова вынуждены были тренироваться в 25-метровых бассейнах.

В состав физкультурно-оздоровительного комплекса вошли две чаши бассейна – большая и малая размером 12,5 на 6 метров. Кроме того, в комплексе разместились две сауны и тренажерный зал.

Уже с сентября прошлого года в «Быстрице» начали тренироваться учащиеся областной спортшколы олимпийского резерва. В малом бассейне проводятся занятия по программе «Мать и дитя» и обучаются плаванию пятилетние дети.

Вильдан Шайхулин ВКонтакте, id5761639

Смешные анекдоты
Лучшие анекдоты со всего рунета. Присоединяйтесь..))

Бассейн БМ(г. Пермь)
Спортивный комплекс БМ Здесь вы можете общаться о спорте и общих интересах. Цель и задача группы: 1. Здоровый образ жизни 2. Занятия спортом 3. Привлечение молодёжи. Занятие в бассейне дает много положительных эмоций и дают массу других немаловажных преимуществ: ▪ делают вас сильнее ▪ укрепляют сердце и сосуды ▪ развивают гибкость ▪ повышают выносливость ▪ замедляют старение ▪ повышают иммунитет ▪ помогают контролировать вес тела ▪ снимают стрессы придают уверенность в себе

Сообщество игры State of Survival
Приветствуем, Выживший! В мире царит смертельный вирус. Возглавь выживших и сражайся со смертельной инфекцией вместе со своими солдатами. В нашей группе ты можешь: *Узнать о последних обновлениях и новостях игры ‘State of Survival’! *Участвовать в конкурсах и получать призы! *Общаться с союзниками и другими выжившими и задавать вопросы по игре! *Найти полезную информацию и гиды по игре! *Поделиться своими достижениями и отзывами! В нашем сообществе не допускается : — грубость по отношению к участникам — разжигание религиозной и межнациональной розни — публикация материалов 18+ — обсуждение конкурентных проектов — не аргументированная критика администрации ресурса — продавать или передавать аккаунты — торговать игровым имуществом за реальные деньги — рассылать спам, включая ссылки на сторонние сайты — ругаться матом Команда State of Survival

Термальный комплекс в Перми (бани народов Мира)
Выявление потребности жителей г. Перми и Пермского края в Термальном комплексе с теплым бассейном под открытым небом. (по аналогии с Воткинскими и Ижевскими Термами).

Образование и воспитание
Онлайн-журнал МАН «Интеллект будущего» для педагогов, родителей и детей Реклама https://vk.cc/4Hh37h

Интерьер и Декор
Лучшие идеи декора и дизайна. Уют в доме. Читайте нас каждый день!

Castle Clash: Схватка Гильдий // Битва Замков
Добро пожаловать в официальное сообщество игры Битва Замков // Castle Clash! Здесь любой Замковладелец может общаться с другими игроками, участвовать в конкурсах и узнавать самую последнюю информацию о любимой игре.

Vikings: War of Clans
Добро пожаловать в официальную группу игры Vikings: War of Clans! Здесь вы найдете новости о последних обновлениях, получите ответы на вопросы по игровому процессу, а также сможете поучаствовать в конкурсах. Не останавливаться на достигнутом и неустрашимо шагать вперёд – вот девиз истинных викингов! Держать руку на пульсе событий и знать о главном – достойная мудрость великого правителя! Вступайте в ряды доблестных Ярлов! Будьте в курсе происходящего вместе с официальной группой игры Vikings: War of Clans! Ты — викинг, ты — герой!

Имбирь
Юмор и немножко сарказма

Дубова Диана — тренер по конному спорту и поэт
Записки сумасшедшего тренера 🙂 Меня зовут Дубова Диана Владимировна, я тренер по конному спорту, коневладелец, продавец халвы, поэт и писатель. В этом сообществе я расскажу вам о своей жизни и вещах которые меня беспокоят или радуют. Немного обо мне: Выпускница Хреновского училища тренеров-наездников Воронежской области — ПУ №51, специальность – тренер-наездник лошадей, жокей III категории, инструктор по лечебной верховой езде, 2010 год. Бакалавр Московской Государственной Академии Ветеринарной Медицины и Биотехнологий им. К. И. Скрябина, факультет «Зооинженерии и Агробизнеса», специализация – «коневодство и конный спорт» 2014 год. Стаж непрерывной работы с лошадьми – 16 лет, стаж тренерской деятельности — 14 лет. Мои ученики и лошади регулярно становятся призерами гладких скачек а так-же — соревнований по конкуру (преодоление препятствий) различного уровня сложности на территории Пермского Края, как в детских, так и во взрослых любительских зачетах. В гладких скачках мы занимаем призовые места не только на территории Пермского Края, но и за его пределами — в Свердловской области, Уфе и Казани. Помимо своей основной «лошадиной» профессии, я с детства пишу стихи и прозу. В свободное от работы время занимаюсь благотворительной деятельностью — помогаю приюту для бездомных животных, и просто бездомным животным, которые постоянно сами по себе появляются на моем жизненном пути. Видимо бог их сам ко мне посылает и помогать им — моё предназначение. У меня дома живет собака по имени Морковка родившаяся на улице под гаражом. Она моя лучшая подруга и утешитель в самые сложные минуты жизни…

МАСТЕРСКАЯ ЗВУКОРЕЖИССЕРА
Мы не скидываем — «волшебные частоты» Почему? — потому что их нет Мы не скидываем — куча разных плагинов Почему? — Что бы не путать новичков Мы не скидываем — «Скачать мастеринг» Почему? — Потому что его не скачать Мы не скидываем — сведение за 5 минут Почему? — Потому что такого не бывает Наша информация повторяется Почему? — Что бы лучше отложилась в голове Нам не нужны администраторы Почему? — Никому не доверяем контент Мы идем на контакт с подписчиками Почему? — Потому что мы их уважаем Все видео ролики просматривает админ Почему? — В интернете куча дезинформации Откуда мы берем контент? Отовсюду где можно Мы никому не навязываем свое мнение Почему? — Потому что, у всех оно разное (с)

Top War: Игра Битвы
Top War: Игра Битвы — первая игра, которая совмещает стратегию! Традиционные стратегические игры трудно освоить и ещё сложнее в них играть! Но здесь, в Top War, мы объединили все самое интересное: Простой в освоении геймплей и кучу возможностей выстроить стратегию битв, которые под силу только самым крепким войнам! Правила может легко понять каждый за 1 минуту. Создавайте и синтезируйте! Узнайте много нового о типах войск, получении опыта, усиления героев. Впереди Вас ждут десятки зданий, новые типы войск, самые сильные герои и многое другое!

Фотошкола LABORATORY | Фотокурсы Пермь
LABORATORY – фотошкола, где тебя научат делать классные снимки и обрабатывать их. С 2014 года обучаем фотографии новичков и профессионалов. 📸Приходи к нам на ПРОБНЫЙ УРОК, мы уверены, тебе понравится! https://labphotoschool.tilda.ws/ Почему фотошкола LABORATORY? 🔸Обучайся у профессионалов своего дела – в нашей команде одни из сильнейших преподавателей города. И они готовы поделиться с тобой своими знаниями и умениями. 🔸 Получи реальные практические навыки – в «Лаборатории» ты будешь много практиковаться: работать с настоящими моделями, практиковать искусство фотографии в среде, в студии, интересных локациях, работать со светом. А по окончании курса тебя ждет дипломный проект, который смело может стать твоим первым портфолио! 🔸 Занимайся с комфортом – наши занятия проходят в центре города: собственные фотостудии, компьютерный класс и персональное рабочее место для обработки фотографий, тебе даже не обязательно покупать фотоаппарат, чтобы пойти учиться к нам – наш фотопрокат предоставит тебе любую фототехнику на время обучения! ЗАПИСАТЬСЯ НА ОБУЧЕНИЕ • по телефону: +7 (922) 350-63-77 • сообщением: vk.com/lab_school СКИДКИ 5% — студентам ВУЗов 7% — выпускникам на следующие курсы 15% — при записи на курс вместе с другом 20% — на фотостудию и фотопрокат во время обучения НАВИГАЦИЯ ПО ГРУППЕ (РУБРИКИ) – подписывайся и оставайся в курсе самого интересного! ✏О школе #КурсыLaboratory – ближайшие и текущие курсы #ПреподавателиLaboratory – наши мастера фотографии, которые будут вас учить #СтудентыLaboratory – работы студентов и выпускников #БэкстейджLaboratory – закулисье занятий ✏О фотографии #LaboratoryВдохновляет – вдохновение в каждом снимке #LaboratoryРекомендует – кино, видео, книги, сайты #LaboratoryГид – выставки, конкурсы

Бизнес-сообщество Like Центр
Like Центр — это: • Одна из образовательных компаний в России, основанная в 2015 году известным предпринимателем Аязом Шабутдиновым • Инвестиционный фонд и трекинг стартапов, цель которого — создание уникального бизнес-сообщества #likefamily • Бизнес-программы для начинающих и действующих предпринимателей и тех, у кого еще нет бизнеса (образовательная лицензия № 040782 выдана 29. 05.20 Департаментом образования и науки Москвы) — В 2020 году Like Центр занял 5 место в рейтинге EdTech-компаний России (РБК) и вошел в топ-100 лучших EdTech-компаний России и СНГ (HolonIQ) — За 5,5 лет наши мероприятия посетили более 1,4 млн человек — Обучение по программам прошли более 400 тысяч предпринимателей — Активные бизнес-сообщества Like Центра открыты в 163 городах России и СНГ: https://vk.com/topic-88954528_36920260 Спасибо, что выбираешь развитие! Здесь ты найдешь: — идеальное окружение для роста; — полезный контент и информацию о мероприятиях; — отклик и обратную связь. Хочешь познакомиться с нами поближе? Приходи на «Концентрат»: https://vk.cc/aAG1zi Внимание! Любая продажа материалов на других сайтах — мошенничество. Напоминаем, что все наши продажи осуществляются только через официальный сайт likecentre.ru, столы продаж на мероприятиях Like Центра, отдел продаж и партнеров франчайзи.

«Я помогаю детям» Благотворительный фонд
Благотворительный фонд «Я помогаю детям» © , Пермь 🆘Самая быстрая помощь Детям из: 🔹 неблагополучных 🔹 малоимущих 🔹 нуждающихся многодетных семей ⏩ Спасаем, кормим, одеваем! 💛Их счастье начинается с тебя г. Пермь, ул. Пермская, 53 +7(342)202-60-60. ПН-ПТ: 09:00-17:00; СБ-ВС: выходной. Реквизиты: Пермская региональ­ная общественная организация «Я помогаю­ детям», ИНН 5905996820, Волго-Вятский банк Сбербанк РФ г. Нижний Новгород, Р/С 40703810049770002489, БИК 042202603, К/С 30101810900000000603.

Мебель в Перми
сообщество для творческих людей

LIKE Центр Пермь | Бизнес-сообщество Лайк
LIKE Центр Пермь — это центр поддержки и развития предпринимательства 📌 6 лет в Перми 📌 Более 3 000 выпускников 📌 Более 6 000 человек посетили наши мероприятия 📌 Рост чистой прибыли на одного участника +49,3% Наша цель – создание рентабельной, воспроизводимой, масштабируемой бизнес-модели каждым🔥 Like Центр Пермь – уникальное пространство, где есть все драйверы роста твоего бизнеса. Здесь ты сможешь: ✔ Получить знания: — на открытых мероприятиях, посвященных узким темам бизнеса — на полноценных образовательных программах ✔ Задать вопросы экспертам и получить достоверные и актуальные ответы ✔ Познакомиться с топовыми предпринимателями и профессионалами Перми и пообщаться с ними «на расстоянии вытянутой руки» ✔ Найти партнеров, клиентов, сотрудников, наставников среди участников курсов и мероприятий ✔ Привлечь внимание к своему проекту аудитории и инвесторов. Привлечь инвестиции ✔ Воспользоваться услугами проверенных подрядчиков и найти сильных партнеров для совместного продвижения Будь с нами!

Мастер-универсал ремонт и отделка ! Пермь
Бежит кран? Пропал свет? Или затеяли ремонт? Тогда Вам к нам! Наши цены вас очень приятно удивят, звоните или пишите, будем очень рады!!!

Тинькофф
Третий банк России по числу клиентов. Тут — акции, анонсы и советы по всем продуктам экосистемы, а заодно полезные статьи для хорошей жизни.

E.squire
Умный журнал для успешных людей! Здесь мы будем развиваться вместе. Новости, исторические фото и необычности нашего мира. Заходите и удивляйтесь! Ну и не без бизнеса и обучения!

В краснокамском бассейне прошли самые крупные соревнования среди пловцов

Главная / Новости / В краснокамском бассейне прошли самые крупные соревнования среди пловцов

16.

11.2012

В краснокамском бассейне прошли самые крупные соревнования среди пловцов
10 ноября в бассейне «Дельфин» прошла Матчевая встреча городов Пермского края по плаванию. В соревнованиях приняли участие 210 юных пловцов 2000-2005 годов рождения из 8 команд: г.Пермь «Олимпия», г.Пермь «БМ», г. Пермь ДЮСШ Свердловского района, г. Пермь «Кама»,  г.Березники «Кристалл», г. Соликамск, г. Краснокамск «Дельфин», с. Усть-Качка и более 150-ти зрителей и болельщиков.

7 команд боролись за звание Победителя в эстафетном плавании 4х50 метров вольным стилем.

В упорной борьбе победителями среди краснокамцев стали:

Сорокина Екатерина — 400м в/ст.,

Безматерных Мария — 400м в/ст.,

Чернышев Никита — 400м в/ст.,

Склюев Георгий — 400м в/ст.,

 Абатуров Георгий — 400м в/ст.,

Маврин Александр — 200м кмпл.

Призерами соревнований стали:

 Сергеева Анна — 2 место 50м в/ст.,

Садыков Руслан — 2 место 400 в/ст.,

Малышев Станислав — 2 место 400м в/ст.,

Оборин Данил — 3 место 400м в/ст.,

Бояршинов Андрей — 2 место 200м кмпл.

Наша эстафетная команда, в состав которой входят Безматерных Мария, Бояршинов Андрей, Сорокина Екатерина, Абатуров Георгий стала победительницей. 2 место заняла команда города Березники, 3 место — Пермская команда «БМ».

Победители были награждены медалями и кубками.

Благодарим судейскую бригаду: Бирюкову Л.В., Чикаренко Л.Е., Дебрецени У.К, Гарину И.М., Лобанова Е., Рочева Р., Перепелицину И.Я., Агеева А., Тимкова А., Аверину В., Протасевич С., Панова А., Сорокину Д. за слаженную работу во время  проведения соревнований.

 

 

Архив новостей

Май Июнь Июль Август Сентябрь Октябрь Ноябрь Декабрь 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 

 

Большому кораблю — большое плавание!

  • 24 марта 2017, 08:10

Еще и года нет новому бассейну, а кадеты-пловцы раз за разом показывают блестящие результаты!

Последние два четверга можно назвать «рыбными днями». Кто постарше, помнит, что это такое. Однако, на этот раз я имела в виду нечто иное: во-первых, рыбный потому. что оба четверга кадеты провели в воде; во-вторых, провели с пользой, добившись отличных результатов в соревнованиях по плаванию.

Началось все в акватории родного бассейна. В гости к воспитанникам Пермского кадетского корпуса Приволжского федерального округа имени Героя России Федора Кузьмина приехали ребята из усть-качкинской школы. Кстати, не в первый раз. Соревнования между соседями проходят почти каждый месяц. Девять кадет и чуть больше десятка усть-качкинцев. Немного, но это никак не повлияло на градус соревнований. Борьба за место на пьедестале шла весьма серьезная.

Заплывы на 50 м вольным стилем (кролем) и брассом проходили в двух возрастных категориях: 6-8 и 9-11 классы. В итоге на первом месте в обоих заплывах – и кролем, и брассом – оказался кадет 10 взвода (9Б класс) Ростислав Шипулин (26’47” и 35’54” соответственно), на втором месте с результатом 29’64” в вольном стиле – Никита Казаков (8 взвод, 8В класс), на третьем – Александр Утробин (18 взвод, 11В класс; 31’21”). Кстати, Н. Казаков относится к младшей возрастной категории. но плыл со старшими и даже показал призовой результат.

Перейдем к брассу. Как мы уже сказали, лучше всех этим стилем плавает все тот же Шипулин. Второе место кадеты уступили сопернику из Усть-Качки, а третье место с результатом 42’77” занял Станислав Мережинский (15 взвод, 10В класс).

Отличились и наши девочки. Семикласснице Александре Швецовой из второго взвода удалось дважды за этот день подняться на пьедестал. Сначала на самую верхнюю ступень – первое место в заплыве вольным стилем с результатом 40’18”, потом – ступенькой ниже: 56’01” брассом и заслуженное второе место!

А ровно через неделю, 23 марта в бассейне БМ на открытом первенстве города Перми по плаванию наши ребята просто ошеломили нас! Эти соревнования для кадет стали судьбоносными. Во-первых, воспитанники Пермского кадетского корпуса впервые за 20 лет участвовали в выездных соревнованиях по плаванию! Во-вторых, на соседних дорожках плыли, в основном разрядники и мастера спорта по плаванию. Согласитесь, соперники более чем серьезные. В-третьих, количество участников первенства, которое, кстати, носит статус краевых соревнований, превысило 1000 человек.

На призовые места кадеты особо не рассчитывали. Но результаты каждого кадета-пловца позволили им выполнить нормативы разрядников. так, в заплыве кролем на спине на 50 м кадеты Эльвин Гашимов (10 взвод, 9Б класс; 0’48’03”), Иван Кайгородов (4 взвод, 7Г класс; 0’46’05”), и Сергей Останин (13 взвод, 10А класс; 04646) получили второй юношеский разряд. Обладателями первого юношеского стали Данил Кожевников (5 взвод, 8А класс; 0’41”89”), Федор Матвеев (4 взвод, 7Г класс; 0’38’44”), Александр Столяров (9 взвод, 9А класс; 0’39’85”), Александра Швецова (2 взвод, 7Б класс; 0’47’94”).

И вновь отличился Ростислав Шипулин! Проплыв 50 м баттерфляем за 0’29’10”, 15-летний подросток выполнил норматив на второй взрослый разряд по плаванию. Каких-то трех сотых секунды не хватило ему до первого взрослого. Но мы уверены, если не отступать, если систематически тренироваться (а в кадетском корпусе теперь, как вы знаете. есть для этого все условия), если верить в себя, то и первый взрослый разряд, и другие спортивные регалии не заставят себя долго ждать.

Bm Bioscience Technology Gmbh Профиль: Подробная информация и контактная информация

Отрасль и категория РестораныТайские рестораныАфриканские рестораныСредиземноморские рестораныМясной магазинФранцузские рестораныФастфуд РестораныАмериканские рестораныАзиатские рестораныКитайские рестораныЯпонские рестораны и сушиИспанские рестораныСредневосточные рестораныИндийские рестораныИндийские рестораныЕвропейские рестораныМексиканские рестораныРыба и рестораны морской кухниЛатинские рестораныЗдоровые блюда ДоставкаЗдоровое и диетическое питаниеФрукты и овощи — рынки и магазиныМагазины мяса, рыбы и морепродуктовБулочные и десертыМороженоеМолочные продукты — Фермы и магазиныВинные магазины и винодельниПивоварниПивоварниПродукты для снятия закусокСпеции, приправы и соусыОрехи и семечкиКосметические салоныОздоровительные салоныОбслуживание салонов косметических салонов Магазины косметикиПарикмахерскиеСалоны для татуировок и пирсингаСалоны красоты — оборудование и расходные материалыШколы красотыРешения по упаковкеРешения по организации свадеб и вечеринокУслуги по уходу за дымоходомМеста свадьбыУслуги по очистке оконПолиграфические услугиПереводные услугиМеста для проведения мероприятийДиджеи и организаторы мероприятийРемонт для уборки автомобилейУборка автомобилейПромышленные услуги по очистке ковров Ремонт и обслуживание электроникиРемонт и услуги телефоновПокупка магазиновУпаковка и упаковкаСкладирование и хранениеСбор мусора и утилизация отходовЭкологические услугиДругие инженерные услугиГеотехнические инженерные услугиУслуги в области гражданского строительстваЭлектротехнические услугиМорские инженерные услугиТранспортные инженерные услугиПисатели и копирайтерыСервисы охраны и патрулирование Услуги по переоборудованию и пошиву одеждыМагазин старинной одеждыМагазины для дайвингаПортной на заказОбувь и другая обувьМагазины часов и ювелирных изделийСлужба ремонтаЧасы, головные уборы и аксессуарыБагажи, сумки и дамские сумочкиСвадебные и свадебные принадлежностиКупальные костюмыПоставщики нижнего белья и нижнего бельяМагазины модных дизайнеровПоставщики товаров для фитнесаПоставщики магазинов бытовой химииМагазины бытовой химии И магазиныПоставщик оборудования для игровых площадокПарикмагазиныХобби-магазиныМагазин по ремонту велосипедовПоставщик поддоновМагазин автомобильных аккумуляторовУслуги по аренде велосипедовТовары для озелененияМагазины посудыИгрушки и игровые магазиныФлористыМагазины товаров для вечеринокПрокат для вечеринокМагазины подарковВитамины и пищевые добавкиМагазины торговых центров и магазиновКамеры и магазины фотоаппаратуры StoresClean ИНГ оборудование и SuppliesAlarms, наблюдения и безопасности SystemsLocksmithsLighting StoresReligious GoodsElectric Поставки и мощности GenerationGyms, Фитнес и здоровье CentersYoga StudiosAdult Развлечения ClubsMartial Искусство GymsPaintball CenterComic Книга StoreArt GalleriesComedy ClubWedding PhotographersAquariumGun shopBowling AlleyRecording StudioBotanical GardenTennis ClubZooSkydiving CenterBasketball ClubSailing ClubPlaygroundsLaser Tag CenterBoxing GymSoccer ClubDiving CenterHaunted HousesSwimming schoolCrossfit CentersBaseball ClubMeditation & Retreat ЦентрыКинотеатры и видеотеатрыТеатры и театральные услугиМузеиМузыкальные инструменты и музыкальные магазиныМузыканты, оркестры и музыкальные группыКнижные магазиныИскусство и музыкальные издательстваТанцевальные и ночные клубыАркады и парки развлеченийКазино и ставкиФотографы и фотостудииВидеоигры Зоологический садУслуги мастеровBa th Ремонт и модернизацияМагазин плиткиРемонт и обслуживание бытовой техникиМебельные магазиныМебель на заказУслуги по озеленению и газонамУслуги на деревеСоздатели шкафовМебель и оборудование для ванных комнатКухонная мебель и оборудованиеКовры, коврики и другие напольные покрытияЖалюзи, шторы и драпировкиОбстановка картинМонтажные работы на тканевой основеДомашние товарыДизайн интерьера и отделки салона AssociationsPlumbing ServicesWindows и двери ShopsPools и джакузи ServicesPools и джакузи StoresArchitects и архитектурные ServicesReady бетонной смеси SupplierMonuments и MemorialsMasonry Поставка StoreConstruction ServicesGeneral ContractorsHome Строители и Ремонт ContractorsFoundation ContractorsFlooring ContractorsMechanical ContractorsMasonry ContractorsWaterproofing ServicesPainting, Штукатурка и настенные CoveringDrywall и изоляция ContractorsConstruction AssociationsRoofing ContractorsElectrical & Электропроводка ContractorsConcrete WorkAsphalt & P Aving ServicesМагазины асфальта и дорожных покрытийДругие розничные торговцы стройматериаламиМагазины строительных материалов из дереваРаскопки, бульдозеры и сносСюрвейерские услугиТяжелое строительное оборудованиеМагазин автозапчастейАвтомобильные услуги по удалению вмятинАвтомагазиныДилеры тележек для гольфаДилеры и аренда мотоцикловМагазин подержанных автозапчастейАвтосалоныАвтосалоны Ремонтные мастерскиеДома на колесах, трейлеры и дома на колесах — дилеры и аренда АдвокатыПоверенные по делам о банкротствеПатентные поверенныеОбщие практикиПоверенные по трудоустройствуИммиграционный поверенный neysLegal AssociationsInsurance Закон AttorneysNotariesCourthousesStenographers & Транскрипция ServicesProcess ServersTitle Аннотация и расчетов OfficesPathologistsMedical Поставка RetailersDentists и стоматологический ClinicsAllergistsRegenerative ClinicsOrthodontistsPeriodontistsEndodontistsPediatric DentistsCosmetic DentistsDental LaboratoryCardiology ClinicsUrology ClinicsNeurology ClinicsDermatology ClinicsOrthopedic ClinicsOncology ClinicsAudiology ClinicsGastroenterology ClinicsCBD и медицинской MarijuanaAcupuncture clinicAbortion ClinicsOptometristsMedical ResearchSleep ClinicsBlood Банки и Донорство CentersENT SpecialistsHealth & Медицина AssociationOphthalmologistsChiropractorsNutritionists и потеря веса SpecialistsPlastic хирургии ClinicsNephrology ClinicClinics — Хирурги и врачиРеабилитация и наркозависимость — Центры и терапевтыПсихиатры и психиатрические больницыПсихологи и консультационные услугиОрганизационная терапияУслуги по лечению бесплодия, родовспоможения и материнстваСпортивная медицина и физиотерапияDrug Sto Рез и PharmaciesHome Здоровье CareOccupational HealthPediatristsNursing & Личные CareMedical LaboratoriesRadiology ClinicPodiatristsAlternative TherapyFine Искусство SchoolsPreschools и KindergartensEducational ConsultantsComputer Обучение SchoolsMusic Школы и InstructorsBartending SchoolsPreparatory SchoolsAdult Образование SchoolsDaycare CentersCharter SchoolsDance SchoolsResearch InstitutesMiddle SchoolsPrimary SchoolsSpecial Потребности EducationMontessori SchoolsMilitary SchoolsHigh SchoolsReligious SchoolsEducational AssociationsUniversity & College Alumni AssociationsElementary SchoolsOther SchoolsColleges & UniversitiesLanguage & Speaking SchoolsLearning , Репетиторство и курсыГимнастикаТанцевальные студии и школыКурсы для гольфа и загородные клубыСпорт и оздоровительные лагеряСпорт и досуг — клубы, поля и площадкиТакси-таксиЛимузиныПеревозчики и тяжеловесные перевозкиГрузовые перевозки и логистикаТранспортные и морские перевозкиАвтобусы, маршрутные автобусы и местные транзитные курьеры КомпанииНедвижимость — Агенты и менеджерыУправление недвижимостьюДевелоперские компанииИнвестиции в недвижимостьАгентство в аренде недвижимостиАгентство в аренде недвижимостиАссоциации на недвижимостьОценка недвижимости и осмотр домаОфисные помещенияБизнес-ассоциацииИнвестиционные консультанты и финансовые консультантыБизнес-брокерыПрофессиональные и управленческие услугиБизнес-консалтингБизнес-коучингАгентства по трудоустройству и кадровые агентства ПодготовкаБанки и банкоматыКредиты и финансированиеПроцесс платежей и точки продажПланирование выхода на пенсиюЗалог в залог Агентства по взысканию долговСтрахование — агенты, перевозчики и брокерыИнвестиционные фирмы и венчурный капиталКредитные союзы и сберегательные учрежденияСлужбы кредитной отчетностиУслуги по хранению денежных переводовЭскроузыкальные компанииКриптовалютные фермыФермы и сельское хозяйство ultry & Egg FarmsAnimal FeedAgriculture & Farm AssociationsPest Услуги и сельского хозяйства ChemicalsIrrigation Systems & ServicesHotelsBed и BreakfastResortsMotelsTravel AgenciesTour OperatorsTravel AssociationsRV Parks & CampgroundsIcePet ShopsAnimal SheltersVeterinarians & Animal HospitalsVeterinary AssociationsAnimal TrainingPet Boarding & SittingPet CemeteriesSocial Услуги и NGOsCommunity CenterYMCA CampsHomelessness ShelterAdoption агентства и Foster CareDomestic Насилие NGOsFood BanksScout CampsBoys & Girls КлубыФонды сообществБольшие братья и старшие сестрыДетективы и службы расследованийЖилищные программыБиблиотекиПолитические организацииВсе органы исполнительной власти, законодательные и государственные учрежденияПаркиОбучение безопасностиПолицейские и шерифыПожарные департаменты и противопожарная защитаСкорые и спасательные службыСервисы по размещению и облачной инфраструктуреСервисы по разработке мобильных приложенийКомпании по разработке программного обеспечения т MarketingSearch Двигатель OptimizationSocial Медиа AgenciesTelemarketingSales AgenciesCommercial PrintingPromotional MerchandisingMarket Research & Opinion PollingPublic Отношения AgenciesDigital & Marketing AgenciesSigns & Commercial ScreensOutdoor Реклама ServicesRadio & Television ProductionRadio сети & StationsTelevision BroadcastingCable & Интернет ProvidersTelecommunicationsNewspapers & MagazinesMedia & Telecom AssociationsMedical Поставка ManufacturersAuto частей ManufacturersMachinery части manufacturerGarden оборудование и SuppliesFarm оборудованиеЛабораторная оборудование & Расходные материалыХолодильное оборудование и материалыОфтальмологические и оптические инструменты и линзыУпаковочные и герметизирующие устройства и материалыБумага и картонОборудование для ресторановПроизводство электронных компонентовФармацевтическая продукцияЛазеры и изделия из стекла 1 Обработка кожиГлина и керамические изделияМрамор, гранит и изделия из камняМинералы, изделия из земли и рудыПроизводство строительных материалов sEnergy — Оборудование и материалыОборудование для солнечной энергииУслуги в области солнечной энергииВетроэнергетическое оборудование и услугиЗапчасти и услуги для самолетовРакеты, взрывчатые вещества и фейерверк — Добыча и сбыт МеталлоломХимическая продукцияПроизводство металлопродукцииМагазин металлопродукцииСварочные услугиУслуги по изготовлению металлических изделийКабели и проволокаБаки для хранения металловТрубки, трубки, фитинги и клапаныМеталлическая кровляНожи, лезвия и пилыПродукция из нержавеющей сталиПромышленное оборудование и расходные материалыПроизводство литья под давлением ШтамповкиПереработка алюминия и продуктыЖелезнодорожные сервисные компанииAdult & PornPsychicBoat Rental & Ch Artering ServicesСолнечная энергетическая компанияСтанция для зарядки электромобилейКнигиздательКоммунальные предприятияУслуги по уходу за пожилыми людьми и вспомогательное проживаниеСервисы для самостоятельного проживанияУслуги эскорта для взрослыхПаркованные доменыСервисы знакомствМастерские по ремонту лодок и яхтДилеры по продаже лодок и яхтЛодочные туры и круизыПоддержка полиграфических услугОрганизации для ритуальных услуг и кладбищПлатформа для обучения легковых автомобилей и школ И курсы

Расположение CaliforniaTexasNew YorkFloridaIllinoisPennsylvaniaMassachusettsNew JerseyOhioNorth CarolinaGeorgiaVirginiaWashingtonMichiganColoradoWisconsinMarylandArizonaIndianaTennesseeOregonMinnesotaMissouriConnecticutSouth CarolinaAlabamaDistrict Из ColumbiaLouisianaKentuckyNew HampshireUtahIowaOklahomaNevadaKansasNew MexicoMaineNebraskaArkansasMississippiIdahoVermontMontanaRhode IslandWest VirginiaHawaiiSouth DakotaDelawareNorth DakotaAlaskaWyomingEnglandScotlandWalesNorthern IrelandHamburgBavariaNorth Рейн-westphaliaBaden-württemberg RegionHesseSaxonyBremenLower SaxonySchleswig-holsteinRheinland-pfalzBrandenburgSaarlandThuringiaSaxony-anhaltMecklenburg-vorpommernLand BerlinÎle-де-franceHauts-де-franceAuvergne-Rhone-alpesNouvelle-aquitaineProvence-Alpes-Côte D» azurOccitanieGrand EstBrittanyPays De La LoireCentre-val De LoireBourgogne-franche-comteNormandyCorsicaUmbriaLatiumLombardyEmilia-RomagnaTuscanyVenetoSicilyCalabriaCampaniaApulardiaFriuli Venezia GiulaiaPino-AlleiaPino-Alaia к AdigeAbruzzoBasilicateLiguriaThe MarchesMoliseMadridCataloniaBasque CountryAndalusiaValenciaAragonMurciaGaliciaCanary IslandsCastille И LeónPrincipality Of AsturiasCastille-ла ManchaCantabriaLa RiojaExtremaduraNavarreBalearic IslandsCeutaMelillaNorth HollandSouth HollandProvincie UtrechtProvincie GelderlandNorth BrabantGroningenLimburgProvincie OverijsselProvincie ZeelandFrieslandProvincie DrentheProvincie FlevolandZurichBasel-cityBernGenevaVaudSaint GallenZugTicinoNeuchâtelAargauSchaffhausenSolothurnFribourgGrisonsLucerneSchwyzThurgauValaisBasel-landschaftGlarusAppenzell InnerrhodenAppenzell AusserrhodenNidwaldenJuraUriObwaldenLesser Польша VoivodeshipLower SilesiaGreater PolandMazoviaPomeraniaSilesiaWest PomeraniaLublinKujawsko-pomorskiePodlasieSubcarpathian VoivodeshipŚwiętokrzyskieOpole VoivodeshipLubuszWarmia-masuriaŁódź VoivodeshipLesser PolandBrussels CapitalFlandersWalloniaMoscowSt. -petersburgKrasnodarskiy KrayNovosibirsk OblastTatarstan RepublicVoronezhskaya Oblast’Primorskiy (морской) KrayVladimirskaya Oblast’Volgograd OblastUdmurtiya RepublicSaratovskaya OblastIrkutsk OblastBashkortostan RepublicKaliningradskaya Oblast’Omskaya Oblast’Tul’skaya Oblast’KhabarovskKostroma OblastChuvashiaOrenburg OblastPenzenskaya Oblast’Tomsk OblastKemerovo OblastSmolenskaya Oblast’RostovLipetsk OblastIvanovskaya Oblast’MurmanskKaluzhskaya Oblast’Moscow OblastKurskaya область ‘Пермь KraiBelgorod OblastVologodskaya Oblast’KareliaPskov OblastKhanty-mansiaSverdlovskaya Oblast’ChelyabinskTambovskaya Oblast’Mordoviya RepublicBuryatiya RepublicNizhny Новгород OblastKomiKrasnoyarskiy KrayYaroslavskaya Oblast’Altai KraiKhakasiya RepublicNorth OssetiaDagestanYamalo-nenetsLeningradskaya Oblast’Magadan OblastTyumen’ OblastArkhangelskayaRyazan OblastKabardino-Балкария RepublicTver ‘OblastStavropol’ KrayUlyanovsk OblastAmur OblastChukotKalmykiya RepublicKirovskaya Oblast’Astrakhanskaya область ‘ Самара OblastBryansk OblastKarachayevo-Черкесия RepublicJewish автономный OblastRepublic Из TyvaSakhalin OblastNovgorod OblastChechnyaKurgan OblastMariy-эль RepublicOrel OblastStockholmSkåneVästra GötalandUppsalaVästerbottenÖstergötlandÖrebroVästmanlandJönköpingHallandVästernorrlandKalmarKronobergNorrbottenVärmlandSödermanlandJämtlandGävleborgBlekingeDalarnaGotlandViennaSalzburgStyriaTyrolUpper AustriaCarinthiaVorarlbergLower AustriaBurgenlandBudapestPest MegyeHajdú-biharCsongrad MegyeBaranyaBorsod-Абауй-zemplénGyőr-Мошон-sopronBács-kiskunFejérHeves MegyeVeszprem MegyeKomárom-esztergomVasSzabolcs-Сатмар-beregJász-Надькун-szolnokBekesSomogy MegyeZalaNograd MegyeTolna MegyeSouth MoravianMoravskoslezsky Край Трал FinlandPäijänne TavastiaNorthern SavoLaplandSatakuntaNorth KareliaSouth KareliaOstrobothniaTavastia ProperSouthern OstrobothniaSouthern SavoniaCentral OstrobothniaKymenlaaksoKainuuOslo CountyHordaland FylkeTrøndelagRogaland FylkeTroms FylkeBuskerudVest-Агдер FylkeAkershusNordland FylkeMore Og Romsdal FylkeHedmarkOpplandVestfoldTelemarkØstfoldAust-agderFinnmarkSogn Og Фьюране FylkeLeinsterMunsterConnaughtUlsterLisbonPortoMadeiraBragaFaroPortalegreAveiroSetúbalÉvoraAzoresLeiriaSantarémViana Do CasteloViseuCastelo BrancoVila RealGuardaBejaBragançaCoimbraBucurestiJudetul ClujJudetul TimisConstantaJudetul BrasovJudetul SibiuAradBihorDoljPrahovaHunedoaraJudetul AlbaJudetul MuresMaramureşJudetul ArgesJudetul BuzauTulceaJudetul BrailaJudetul BacauTeleormanIlfovJudetul ValceaJudetul NeamtGiurgiuSuceavaSatu MareJudetul CalarasiGorjClujVranceaJudetul Бистрица-nasaudJudetul MehedintiJudetul DambovitaJudetul BotosaniJudetul СаладжОлтХаргитаJudetul Caras-severinVasluiTimisCovasnaJudetul Galati AtticaCentral MacedoniaEpirusCreteSouth AegeanIonian IslandsEast Македония И ThracePeloponneseThessalyCentral GreeceNorth AegeanWest MacedoniaWest GreeceBratislavaKosiceBanska BystricaZilinaNitraTrencinPresovTrnavaCierneCity Из ZagrebSplit-dalmatiaDubrovacko-Neretvanska ZupanijaZadarska ZupanijaPrimorsko-Goranska ZupanijaOsjecko-Баранья ZupanijaIstriaVarazdinska ZupanijaSlavonski Брод-posavinaKarlovacka ZupanijaZagreb CountyBjelovarsko-Билогора ZupanijaMegimurska ZupanijaSisacko-Мославина ZupanijaKoprivnicko-Крижевачка ZupanijaVukovar-sirmiumPozesko-Славонская ZupanijaLicko-Сенжска ZupanijaKrapinsko -zagorska ZupanijaSibensko-Книнская ZupanijaViroviticko-Подравина ZupanijaLjubljanaObcina StoreMariborObcina Race-framVipavaObcina BledCeljeKoperKomenKranjNova GoricaMestna Obcina Ново MestoPiranPtujVelenjeMurska SobotaŠkofja LokaObcina DomzaleKamnikTrzinPostojnaSlovenj GradecIzolaObcina TolminObcina KrskoObcina Renče-vogrskoObcina SezanaGrosupljeTrbovljeMedvodeLogatecSlovenska Бистрица Obcina AjdovscinaObcina BovecRadovljicaObcina RuseVrhnikaObcina BreziceObcina Рогаска SlatinaObcina ZalecObcina Ravne Na KoroskemJeseniceIdrijaObcina SencurObcina KobaridLendavaObcina LaskoObcina MengesObcina CrnomeljObcina Šempeter-vrtojbaLjutomerObcina KocevjeSlovenske KonjiceTrebnjeCerknicaGornja RadgonaObcina TrzicIlirska BistricaKyiv CityKharkivs’ka Oblast’L’vivs’ka Oblast’DnipropetrovskPoltavs’ka Oblast’Donets’ka Oblast’OdessaKhersons’ka область ‘Сумская область’Черновицкая область’Тернопольская область’Волынская область’Ивано-Франковская область’Черкасская область’Винницкая область’Киев Город СевастопольАвтономная республика КрымЧерниговЖитомирская областьЛятомирская область ZaporizhiaHarjumaaTartuPärnumaaIda-virumaaViljandimaaSaareLääne-virumaaLääneVõrumaaJärvamaaValgamaaJõgevamaaRaplamaaPõlvamaaHiiumaaSofia-capitalPlovdivVarnaBurgasOblast Стара ZagoraBlagoevgradOblast Велико TarnovoOblast PlevenOblast ShumenGabrovoPazardzhikOblast SlivenOblast VratsaOblast DobrichOblast VidinHaskovoPern ikRigaBauskas NovadsLiepajaJelgavaVentspilsJurmalaValmieraOgreSiguldas NovadsCesu NovadsRezekneKuldigas NovadsJēkabpils MunicipalityTukuma NovadsSaldus MunicipalityTalsi MunicipalitySalaspils NovadsDobeles NovadsMadona MunicipalityAizkraukles NovadsVilniusKaunasKlaipėda CountySiauliaiPanevėžysAlytusTelsiaiMarijampolė CountyUtenaTauragė CountyLuxembourgEsch-сюр-alzetteGrevenmacherEchternachDiekirchWiltzMerschCapellenRemichViandenBelgradeVojvodinaNisavaSumadijaMoravaRasinaRaskaMacvaPodunavljeKolubaraJablanicaPomoravljePcinjaZlatiborPirotZajecarCapital RegionNortheastSouthSouthern PeninsulaWestfjordsWestEastMinsk CityVitebskBrestMogilevGomelGrodnenskayaMinskIl ремней VallettaTas-sliemaVictoriaIl-melliehaBirkirkaraIl-mostaIl-gziraL-imgarrAttardL-imdinaQormiIr-rabatIn-naxxarLuqaTal-pietaIl-marsaSaint Павла Bayıl-furjanaMarsaxlokkIl -munxarTiranaQarku I DurresitQarku I ShkodresQarku I GjirokastresQarku I VloresQarku I FieritQarku I ElbasanitQarku I BeratitKotorPodgoricaBudvaHerceg NoviTivatBar CetinjeUlcinjFederation Of B & hRepublika SrpskaBrčkoOpstina KarposOhridBitolaKumanovoTetovoPrilepVaduzSchaanTriesenBalzersRuggellEschenTriesenbergMaurenMonacoCastletownChişinău MunicipalityMunicipiul BaltiAndorra La VellaLa MassanaOrdinoEncampSant Julià De LoriaCanilloGibraltarTórshavnCastello Di San Marino CittaSerravalleSvalbardMariehamnOntarioBritish ColumbiaQuebecAlbertaManitobaNova ScotiaSaskatchewanNew BrunswickPrince Эдвард IslandYukonNorthwest TerritoriesNunavutNewfoundland И LabradorNew Южная WalesVictoriaQueenslandSouth AustraliaWestern AustraliaAustralian Capital TerritoryTasmaniaNorthern TerritoryMaharashtraNational капитала территории DelhiTamil NaduTelanganaWest BengalGujaratKarnatakaRajasthanUttar PradeshHaryanaChandigarhMadhya PradeshKeralaPunjabAssamOdishaBiharUttarakhandAndhra PradeshJharkhandChhattisgarhHimachal PradeshJammu И KashmirUnion территории PuducherryMeghalayaSikkimTripuraAndaman И NicobarManipurGoaMizoramNagalandArunachal PradeshDaman И ДиуРио Де JaneiroSao PauloParanaFederal DistrictCearaMinas GeraisBahiaSanta CatarinaRio Grande Do SulPernambucoRio Grande Do NorteEspirito SantoGoiasAmazonasAlagoasMato Grosso Do SulMaranhaoSergipeMato GrossoParaíbaRondoniaParaPiauiRoraimaTocantinsAmapaAcreAucklandWellingtonCanterburyWaikatoOtagoBay Из PlentyNelsonManawatu-wanganuiTaranakiNorthlandHawke в BaySouthlandGisborneMarlboroughWest CoastTasmanMexico CityJaliscoQuintana RooEstado De Baja California CaliforniaGuanajuatoYucatánCampecheBaja SurSonoraAguascalientesMorelosMichoacánCoahuilaDurangoSinaloaNuevo LeónChihuahuaVeracruzChiapasTabascoColimaTamaulipasNayaritEstado De MexicoHidalgoOaxacaPueblaZacatecasGuerreroTlaxcalaQuerétaroSan Луис PotosíWestern CapeGautengKwazulu-natalEastern CapeOrange Free StateMpumalangaLimpopoNorthern CapeProvince Of North WestShanghaiGuangdongZhejiangSichuanJiangsuShandongTianjinFujianHubeiHenanChongqingLiaoningYunnanAnhuiHeilongjiangJilinJiangxiGuangxiHebeiHunanHainanGuizhouShanxiGansuNingsia Hui автономного Регион СиньцзянТибетЦинхайАвтономный район Внутренняя МонголияМетро МанилаЦентральные ВисайиДаваоКалабарзонСеверный МинданаоКордильерыЗападные ВисайиЦентральный ЛусонСокчксаргенКарагаБиколПолуостров ЗамбоангаИлокосМимаропаВосточные ВисайиАвтономные острова Ф. d.CordobaMendozaBuenos AiresSanta FeSaltaSantiago Дель EsteroChacoTierra Дель FuegoNeuquenSanta CruzSan JuanCorrientesRio NegroMisionesSan LuisTucumanEntre RiosChubutLa PampaFormosaLa RiojaJujuyCatamarcaKuala LumpurSelangorJohorSabahSarawakPerakPenangPahangNegeri SembilanPutrajayaKelantanMelakaTerengganuKedahLabuanKepongPerlisJakartaNorth SumatraEast JavaWest JavaBantenYogyakartaBaliCentral JavaRiau IslandsSouth SulawesiRiauSouth SumatraLampungWest SumatraNorth SulawesiWest KalimantanEast KalimantanAcehSouth KalimantanBengkuluCentral KalimantanEast Нуса TenggaraSoutheast SulawesiPapuaGorontaloWest PapuaWest Нуса TenggaraNorth MalukuNorth KalimantanIstanbulAnkaraIzmirAntalyaTrabzonBatmanBursaMuğlaAdanaGaziantepEskişehirKonyaDenizliKocaeliKayseriCanakkaleAydınYalovaSamsunEdirneSakaryaMersinSivasIspartaTekirdağAksarayVanHatayDiyarbakirAfyonkarahisarDuezceKarsBalıkesirArtvinOsmaniyeKaramanSinopNigdeElazığNevsehirŞanlıurfaErzurumAdiyamanBurdurMalatyaBoluKırşehirKırıkkaleBartınÇorumKütahyaOrdu KastamonuMardinZonguldakKahramanmaraşTokatTunceliAmasyaRizeIğdırTokyoKyotoKanagawaAichiFukuokaHokkaidoHiroshimaOkinawaChibaNaraSaitamaIbarakiIshikawaNagasakiOkayamaKagoshimaKumamotoNiigataShizuokaKochiHyōgoTokushimaToyamaWakayamaNaganoSagaTochigiYamagataKagawaGifuOitaFukuiYamaguchiMieMiyagiFukushima-kenYamanashiIwateAomoriShimaneAkitaMiyazakiGunmaCentral Сингапур Сообщество по вопросам развития CouncilKampong Пасир RisBangkokChiang Mai ProvincePhuketChangwat Чон BuriChangwat KrabiChangwat Prachuap Khiri KhanChangwat RayongChangwat Chiang RaiChangwat Сурат ThaniChangwat Pathum ThaniChangwat Пхра Накхон Си AyutthayaChangwat Kamphaeng PhetChangwat KanchanaburiChangwat Хон KaenChangwat Накхон RatchasimaChangwat NonthaburiChangwat PhangngaChangwat SongkhlaChangwat PhetchaburiChangwat Удон ThaniChangwat Накхон PathomChangwat Сэмута PrakanChangwat TrangChangwat NanChangwat LampangChangwat RatchaburiChangwat Накхон СаванЧангват СуринЧангват ЧантабуриЧангват ПхитсанулокЧангват Накхонситхаммарат Changwat TakChangwat ChachoengsaoChangwat Ubon RatchathaniChangwat RanongChangwat SaraburiChangwat Нонг KhaiChangwat ChumphonChangwat Лоб BuriChangwat TratHanoiHo Chi MinhDa NangTinh Khanh HoaHaiphongTinh Куанг NamTinh Thua Тиен-hueTinh Lam GjongCan ThoTinh Ba Ria-Вунг TauTinh Nghe AnTinh Thanh HoaTinh Куанг NgaiTinh Gjong NaiTinh Винь LongTinh Бинь ThuanTinh Лао CaiTinh Куанг BinhTinh Бен TreTinh Gjak LakTinh Bac NinhTinh Bac GiangTinh Бинь DuongTinh Tien GiangTinh Ca MauGia LaiTinh Tra VinhTinh Tay NinhTinh Lang SonTinh Phu YenTinh Hung YenTinh Nam GjinhTinh Куанг NinhTinh Ха TinhTinh Лай ChauTinh Сын Лан GiangTinh Киен GiangTinh иен Bailong AnTinh Bac KanSantiago MetropolitanRegion De ValparaisoRegion Del BiobioAntofagastaCoquimbo RegionRegion Of MagallanesTarapacáLos Риос РегионРегион Арика и ПаринакотаРегион МаулеРегион Лос-ЛагосРегион О’ХиггинсРегион де ла АрауканияАтакамаАйсенАнтиокияДепартамент де БоливарДепартамент дель Валле дель КаукаАтлантикоDepartamento De SantanderQ Департамент Уиндио Богота Д. c.Departamento Del MagdalenaDepartamento De CaldasSan Andres Y ProvidenciaDepartamento De BoyacaDepartamento De RisaraldaDepartamento De TolimaCundinamarcaDepartamento De Norte De SantanderDepartamento Del MetaDepartamento Del CaucaDepartamento Del HuilaDepartamento De NarinoDepartamento De CordobaDepartamento Del CesarDepartamento Del CaquetaDepartamento De SucreAmazonasDepartamento De La GuajiraDepartamento De CasanareDepartamento De AraucaDepartamento Del ChocoDubaiAbu DhabiAsh ShariqahRa Аль KhaymahAjmanAl FujayrahUmm Al QaywaynLimaCuscoArequipaLa LibertadLoretoLima RegionCajamarcaMadre De DiosPiuraLambayequeIcaCallaoPunoAncashRegion De San MartinJuninAyacuchoApurimacTacnaUcayaliTumbesDepartamento De MoqueguaAmazonasLagosFctRivers StateOyo StateEnugu StateEdoKano StatePlateau StateCross реки StateAkwa Ibom StateKaduna StateKwara StateImo StateOgun StateOndo StateBorno StateAnambraAbia StateOsun StateAdamawaNiger StateDeltaEkiti StateGombe StateEbonyi StateBayelsa StateKogi Statek atsina StateSindhPunjabIslamabadKhyber PakhtunkhwaBalochistanGilgit-baltistanAzad KashmirTel AvivJerusalemHaifaNorthern DistrictCentral DistrictSouthern DistrictSalinasTaipei CityTaichung CityHsinchuKaohsiungTainanTaoyuanYunlinKeelungChanghuaYilanHsinchu CountyKowloon CityWan ChaiCentral и Западной DistrictEasternTsuen Ван DistrictSha TinYau Тсим MongTuen MunSham Шуй PoSouthernYuen Long DistrictSai Kung DistrictTai Po DistrictKwun TongIslands DistrictNorthNairobi ProvinceMombasa DistrictKisumuNakuru DistrictNyeri DistrictUasin GishuLaikipiaMeruKericho DistrictKisii DistrictKiambu DistrictMachakos DistrictEmbu DistrictCairo GovernorateAlexandriaGizaRed МореЮг SinaiLuxorAswanPort SaidSuezGharbiaIsmailia GovernorateAsyutLimassolNicosiaPafosLarnakaAmmochostosKeryneiaProvincia De Пичинча De El OroProvincia De NapoProvincia De CotopaxiProvincia De GalapagosAlmatyAstana QalasyWest KazakhstanKaragandaAtyrau OblysyPavlodar RegionAktyubinskaya Oblast’ShymkentQyzylorda OblysyAqmola OblysyZhambyl OblysyAlmaty OblysyEast KazakhstanAr RiyāḑMakkah ProvinceEastern ProvinceAr RIY ?? Аль-Мадина Аль MunawwarahAsirDepartamento De MontevideoFloridaMaldonadoCerro LargoColoniaDepartamento De SaltoCanelonesDepartamento De PaysanduArtigasDepartamento De RochaDepartamento De TacuaremboDepartamento De RiveraLavallejaDepartamento De FloresDepartamento De DuraznoProvincia De GuanacasteProvincia De AlajuelaProvincia De San JoseProvincia De PuntarenasProvincia De HerediaProvincia De CartagoProvincia De LimonKingstonSaint JamesWestmorelandParish Of Saint AnnTrelawnyPortlandManchesterSaint CatherineDistrito FederalVargasZuliaCaraboboMéridaLaraAraguaBarinasNueva EspartaAnzoáteguiTáchiraDependencias FederalesMirandaMonagasFalcónSucrePortuguesaBolívarWestern ProvinceCentral ProvinceSouthern ProvinceNor й Центральной ProvinceNorth Западной ProvinceEastern ProvinceProvince Из SabaragamuwaCasablanca-settatMarrakesh-safiRabat-продажи-kenitraSouss-massaFes-meknesTanger-Тетуан-аль HoceimaDraa-tafilaletOrientalBeni Mellal-khenifraOstan-е TehranFarsIsfahanRazavi KhorasanEast AzerbaijanYazdKermanAlborzOstan-е KermanshahMāzandarānOstan-е GilanBushehrMarkaziOstan-е QazvinDhaka DivisionChittagongSylhet DivisionKhulna DivisionRajshahi DivisionBarisal DivisionMymensingh DivisionRangpur DivisionSeoulBusanIncheonDaejeonDaeguGyeonggi-doUlsanGyeongsangnam-doBaladiyat Ad DawhahCentral RegionWestern RegionEastern RegionGreater Аккре RegionAshanti RegionCentral RegionNorthern RegionDar Es Salaam RegionArushaZanzibar Urban / westKilimanjaroMwanzaDodomaMorogoroTangaMbeyaIringaKigomaHavanaProvincia De MatanzasProvincia De Santiago De CubaProvincia De Villa ClaraNacionalPuerto PlataProvincia De La RomanaSamanáProvincia De SantiagoProvincia De La AltagraciaProvincia De Santo DomingoProvincia De San Pedro De MacorisPro vincia De La VegaProvincia De San CristobalCollines DepartmentLittoralOuéméAtlantique DepartmentPhnom PenhPreah SihanoukBattambangKampotCentral RegionEastern RegionNorthern RegionWestern RegionProvincia De PanamaProvincia De ChiriquiProvincia De VeraguasPanama OesteProvincia De Los SantosBeyrouthMohafazat Liban-nordMohafazat Mont-libanNew Провиденс DistrictCity Фрипорт DistrictExuma DistrictCentral Абако DistrictEleutheraDepartamento De La PazDepartamento De CochabambaDepartamento De ChuquisacaDepartamento De TarijaOruroDepartamento De PotosiDepartamento De ManaguaDepartamento De GranadaDepartamento De RivasDepartamento De LeonDepartamento De EsteliDepartamento De MatagalpaDepartamento De MasayaDepartamento De JinotegaDepartamento De ChinandegaMuscatDhofarSoutheastern GovernorateAl Batinah North GovernorateAd DakhiliyahMusandamK’alak’i T’bilisiAjariaShida KartliHarareMatabeleland NorthBulawayoManicalandRangoonMandalay RegionKayah StateShan StateDakarSaint-louisRegion De KaffrineDe partamento De GuatemalaDepartamento De SacatepequezDepartamento De QuetzaltenangoDepartamento Del PetenDepartamento Del QuicheDepartamento De HuehuetenangoDepartamento De EscuintlaDepartamento De Alta VerapazDepartamento De ZacapaDepartamento De ChiquimulaToshkent ShahriSamarqand ViloyatiXorazm ViloyatiBaghdadMuhafazat ArbilNinevehAnbarBasraMuhafazat Karbala’KirkukSalah Ad DinMuhafazat Как SulaymaniyahDepartamento De Francisco MorazanDepartamento De CortesDepartamento De AtlantidaDepartamento De ComayaguaDepartamento De CopanDepartamento De La PazBaku CitySumqayit CityAsuncionDepartamento Del Alto ParanaDepartamento De ItapuaDepartamento CentralDepartamento De San SalvadorDepartamento De Santa AnaDepartamento De San MiguelDepartamento De La LibertadDepartement De L’ouestNordSudGrandansDepartement De L’artiboniteGouvernorat De TunisGouvernorat De NabeulGouvernorat De SousseGouvernorat De MonastirGouvernorat De SfaxLusaka ProvinceSouthern ProvinceCopperbeltPort Louis DistrictBlack River D istrictPamplemousses DistrictPlaines Wilhems DistrictRiviere Du Rempart DistrictMoka DistrictKhomasErongoKarasKigaliYerevanShirakSyunikTavushPenal / debePort Из SpainSan FernandoChaguanasLuang Прабанг ProvinceVientiane PrefectureVientiane ProvinceXiangkhouangChampasakAlgiersMascaraOranConstantineMilaMedeaSétifTlemcenKabulKandaharHeratBelize DistrictCayo DistrictStann Creek DistrictCidade De MaputoSofala ProvinceCabo Delgado ProvinceNampulaTeteLittoralCentreSouth-запад RegionNorth-запад RegionGaboroneNorth-westNgwaketsiChobe DistrictCity Из FrancistownManamaSarCastriesGros-isletSoufriereLuanda ProvinceBenguelaDucosAddis AbabaAmharaAl AsimahHawalliCentralWesternNoordTillaberi RegionNiameyNgouniEstuaireOgooué-maritimeDamascus GovernorateAleppo GovernorateBamako RegionGaoTombouctouCentral RegionSouthern RegionNorthern РегионМаритаймКараНациональная столицаПровинция МоробеПровинция Восточная Новая БританияПровинция Восточное ХайлендсЦентрХаутс-БассиныДешайесГамильтон-СитиНаблусРамаллахБетлехемАтолл КаафуПутешествие oliSha’biyat BanghaziGorod BishkekThimphu DzongkhagParoPunakha DzongkhagWestern AreaAntananarivoSaint MichaelProvidencialesRoad TownKourouSouth ProvinceKhartoumSaint Croix IslandSaint Томас IslandSaint Джон IslandAbidjanMontserrado CountyHagåtñaEnglish RiverDemerara-Mahaica RegionWest BayShefa ProvinceDushanbeViloyati KhatlonSouthern Красное море RegionMaekel RegionAmman GovernorateAshgabatConakry RegionNzerekore RegionDistrikt ParamariboIles Du VentDjiboutiSanaaAdenTa’izzBrunei И Muara DistrictBelait DistrictBanjulBanaadirJubaSaint GeorgeSaint JohnTuamasagaBujumbura Mairie ProvinceThe ValleySermersooqIlulissatManufahiDiliBanguiHaut-mbomouMaseruLe TamponKinshasa CityBas -конгоВерхняя КатангаВосточный округАтолл МаджуроПровинция ГуадалканалПровинция ТемотуСайпанМаригоНуакшотПрайяБоа-ВистаУлан-Батор ХотБиоко НортеПечСабаПриход Святого ГеоргияБисауШтат КорорПилипсбургБраззавильРегионМамуданзоу3000

Технология JqueryJquery MigrateModernizrJquery UiLightboxReactLo-dashRequirejsPrettyphotoUnderscore. jsTweenmaxSlickZeptoFancyboxMoment.jsLazy.jsMootoolsAngularjsBackbone.jsSelect2HandlebarsPrototypeHammer.jsDatatablesScript.aculo.usYuiFlickityMustacheTwitter Typeahead.jsVue.jsSweetalertRxjsBasket.jsDojoSocket.ioElement UiSnap.svgFingerprintjsMoment TimezoneAngularRightjsSlimbox 2Accelerated Мобильный PagesHeadjsSlimboxGatsbyMarionette.jsNuxt.jsWinkXregexpSoundmanagerImmutable.jsExtjsKnockout.jsBootstrap TableXajaxAnt DesignMath.jsHogan.jsList.jsZone.jsReveal.jsMarkedMeteorAlloyuiRiotBemRamdaPolymerDhtmlxAmpAureliaEmber.jsStyled-componentsDeploydPhpJavaPythonLuaRubyNode.jsPerlErlangCfmlGoScalaGoogle шрифт ApiFont AwesomeIoniconsTypekitCufonGlyphiconsSifrGoogle AnalyticsFacebook Пользовательского AudiencesFacebook AnalyticsGoogle Analytics Enhanced Рекомендация EcommerceMatomoPiwikYandex.metrikaStatcounterComscoreQuantcastSitecatalystLiveinternetCrazy EggOptimizelyMixpanelRamblerSegmentHotjarClickyHistatsVisual Сайт OptimizerHubspotNew RelicMouse FlowGemiusInspectletAhoyWoopraAmplitudeHeapBugsnagChartbeatShinystatHubspot AnalyticsRuxitWp-statisticsCross PixelKampyleNaveggSnoobiBaidu AnalyticsFreshmarketerWebtrendsDynamicwebDynatraceW3counterZipkinOpen Web AnalyticsMintAt Интернет AnalyticsGaugesFreespeeKissmetricsGosquaredGrowingioClickheatAt Интернет AnalyzerOracle На DemandParse.lySimple AnalyticsSensors DataCnzzInstabotAt Интернет XitiSite MeterInfonlineAppdynamicsIntercomAdplanApacheNginxIisLitespeedOpengseOpenrestyApache трафика ServerPhusion PassengerAmazon Ec2ExpressApache TomcatNetlifyCowboyAcquia CloudGoogle Web App ServerGoogle EngineKestrelTengineLighttpdMicrosoft HttpapiGunicornNext.jsAkka HttpZopeCaddyHhvmLotus DominoJettyNowZendIbm Http ServerJboss Применение ServerStarletResinFlaskOracle Http ServerJboss WebOracle Применение ServerGlassfishOpenbsd HttpdTornadoserverMysqlMariadbFirebasePerconaPostgresqlMongodbWordpressWixSquarespaceShopifyBloggerGodaddy Сайт BuilderJoomlaDrupalWeeblyDudaTypo3 CmsJimdoMywebsiteDnnBigcommerce1c-bitrixTumblrExpressionengineSitefinityAdobe Опыт ManagerOctober CmsConcrete5Business CatalystKentico CmsContaoStrikinglySitecoreCraft CmsMono. netNationbuilderSilverstripeZendeskShopwareDatalife EngineMicrosoft SharepointLiferaySpipContentfulEz PublishModx3dcartCargoWebsplanetCms Сделано SimpleCs CartTildaGhostPloneUmbracoPimcoreLivejournalMediumBoldgridXpressengineDedecmsOdooTypepadOrchard CmsMura CmsDynamicwebGravMotocmsSdl TridionGoogle SitesMovable TypeContenidoShoptetBoltSquiz MatrixBrightspotHippoBloomreachDatocmsIbm Websphere PortalOpencmsKotisivukoneNeos CmsUmi.cmsOctopressXoopsEpiserverVigboPyrocmsIndexhibitChorusTiki Wiki Cms GroupwarePhp-nukeApostrophecmsPhotoshelterCmsimpleGetsimple CmsLocomotiveJahia DxPelicanKokenFork CmsWebguiDm PolopolyEsyndicatE107SuluArc PublishingApostrophe CmsInstantcmsSerendipityContensContensisWebeditionImperia CmsMamboPliggPosterousPhpwindHubspot CosQuick.cmsEz PlatformLivestreet CmsTextpattern CMSA-блог CmsKooboo CmsPagekitMethodeGovcmsSubrionWordpressBloggerHubspotTumblrGhostLivejournalMediumBoldgridTypepadMura CmsOctopressTiki Wiki Cms GroupwareSerendipityPosterousBootstrapMicrosoft Asp.netAnimate.cssZurb FoundationRuby На RailsCodeigniterUikitLaravelExpressMaterial Дизайн LiteYiiDjangoMaterialize CssCowboyAdobe ColdfusionPure CssCakephpNette FrameworkAdobe GoliveSemantic-uiJava ServletNext.jsJavaserver PagesFlat UiBulmaThinkphpPimcoreAkka HttpKendo UiPlayAngular MaterialNeos FlowSymfonyWoltlab сообщество FrameworkFat свободное FrameworkMonoSails.jsFlaskDancerGoogle Web ToolkitKohanaJavaserver FacesWeb2pyMilligramBonfireFacebookOwl CarouselTwitterGoogle PlusAddthisPinterestAddtoanyFlexsliderLinkedinSharethisSumomeOutbrainAddshoppersHello BarWhooshkaaInstabotFacebookFacebook Пользовательского AudiencesGoogle Динамический RemarketingGoogle DoubleClick For Publishers (DFP) Google DoubleClick Ad Exchange (AdX) Google DoubleClick Campaign Manager (DCM) AdrollCriteoCross PixelGoogle Doubleclick FloodlightGoogle MapsLeafletOpenlayersArcgis Api Для JavascriptCloudflareAmazon CloudfrontGoogle CloudGithub PagesFastlyNetlifyIncapsulaAkamaiSucuriAzure CdnGocacheMaxcdnFirebladeSection. ioArvancloudEdgecastKeycdnCdn77YoutubeMediaelement.jsVimeoVideojsBlip.tvGoogle Tag ManagerAdobe Dynamic Tag ManagementAdobe DtmEnsighten Tag ManagementEnsightenQubit OpentagWindows ServerUbuntuUnixDebianCentosRed HatGentooFreebsdFedoraSuseScientific LinuxRaspbianBabelSwiper SliderRevsliderTwitter Emoji (twemoji) Гравитация FormsGravatarSwfobjectWebpackAmazon S3Clipboard.jsK2Highlight.jsPrismSyntaxhighlighterWeglotLessPrefix-freeGoogle Код PrettifyPygmentsSqreenCodemirrorOracle динамического мониторинга ServiceParcelNextcloudGov.Великобритания FrontendPdf.jsRecaptchaMollomSolve MediaWoocommerceShopifyMagentoOpencartPrestashopBigcommerceEpagesVolusionVolusion (v1) ShopwareNopcommerceOracle CommerceOscommerceZen CartKajabiEz Publish4dcartSalesforce Commerce CloudCs CartSalesforce Commerce Cloud! EcommerceLightspeed EcomIbm Websphere CommerceRiskifiedHybrisX-cartPimcoreOxid EshopJtl ShopOdooGambioLivepersonDynamicwebVirtuemartEcwidDrupal CommerceCubecartVtex Интегрированные StoreNetsuiteShoptetEc-cubeXtcommerceHaravanSharetribeVtexVtex EnterprisePlentymarketsAddshoppersShoplineNetoCraft CommerceIntershopVp-aspMemberstackLoja IntegradaIdeasoftTextalkIprestaWikinggruppenSpreeT-softTrayPowergapUbercartFuture ShopCommerce ServerTicimaxWhmcsEz PlatformFbitsWebsaleModifiedGoogle AdsenseGoogle DoubleClick For Publishers (DFP) DoubleClick For Publishers (DFP) Google DoubleClick Ad Exchange (AdX) служба DoubleClick Ad Exchange (ADX) AppnexusGoogle Doubleclick Campaign Manager (dcm) Doubleclick Campaign Manager (dcm) AdrollViglinkPrebidCriteoTealiumRubicon ProjectЯндекс.directOpenxSizmekAdoceanAdriverGoogle Doubleclick FloodlightDoubleclick FloodlightBuyselladsPubmaticZanoxYieldlabAdverticumAdzerkSmart Ad ServerProject WonderfulAnetworkSolve MediaVarnishW3 Всего CacheWordpress Супер CacheLitespeed CacheWp RocketGoogle PagespeedRackcacheWpcacheOracle Web CacheLodashPolyfillMobxScrollrevealWp-statisticsHubspot TetherApolloDecimal.jsJqueryJquery MigrateHubspot VexJquery UiModernizrWixSquarespaceBloggerWeeblyJimdoJotformFrontpageTumblrFormstackOptimizepressLeadpagesClickfunnelsFormassemblyUnbounceGoogle SitesAdthriveWishpondHubspot CosInstapageOpensslGoogle PagespeedMod_sslMod_davMod_perlMod_jkMod_fastcgiMod_pythonMod_wsgiMod_railsMod_rackMod_auth_pamSitegroundAutomatticWp EngineAmazon Web ServicesFlywheelAzureKinstaPantheonLiquid WebPlatform. shSeravoWordpress VipMailchimpPrivyHubspotKlaviyoSumomeJustunoMarketoSignalInfusionsoftDripGetresponseConvertkitMauticVerticalresponsePardotCustomer.ioRd StationActivecampaignBenchmark EmailConstant ContactOntraportEmmaHubspot Lead FlowsHubspot FormsAct-onFreespeeFeedblitzSendinblueVeroEmailoctopusEloquaMad MimiSendpulseIcontactAweberHubspot вызовов Для ActionsInstabotBounce ExchangeMailchimpGravity FormsPrivyNinja FormsFormidable FormsAdrollMailmunchHubspotKlaviyoWufooSumomeJustunoTypeformLead ForensicsInfusionsoftUnbounceDripGetresponseConvertkitEmailmeformVerticalresponsePardotCustomer.ioActivecampaignBenchmark EmailKampyleConstant ContactEmmaWebtrendsHubspot Lead FlowsHubspot FormsAct-onFreespeeFeedblitzSendinblueVeroEmailoctopusSalesforceMad MimiSendpulseIcontactAweberHello BarHubspot Call To ActionsPleskEasyengineCpanelTencent Водонепроницаемый WallBablicElementorHubspotUnbounceMobirisePardotOptimizepressLeadpagesClickfunnelsWebflowAct-onApexpagesAdthriveWishpondInstapageTrackjsNew RelicSentryBugsnagKampyleTiki Wiki Cms GroupwareAtlassian Jira Issue CollectorUsabillaOsticketUservoiceAtlassian JiraNextgen GalleryCoppermineGalleryCheveretoZenfolioJalbumAddtoanyInstabotTawk.toZendesk ChatLivechatLivepersonZendeskTidioFreshchatIntercomOlarkBold ChatDriftPurechatManychatZohoJivositeWhatshelpMylivechatGosquaredHelpscoutLiveagentFreshdeskInstabotChart.jsParticles.jsSupersizedRaphaelHighchartsThree.jsD3MathjaxKineticjsAmchartsExhibitJquery SparklinesGoogle ChartsJqplotHighstockPaths.jsNvd3Javascript Infovis ToolkitBokehShine.jsJs ChartsPlotlyDreamweaverMicrosoft WordFrontpageWebsite X5IwebUnbounceAdobe GoliveBluefishMicrosoft PublisherWebdevJquery MobileJquery-pjaxWinkMobifyPaypalStripeBraintreeCrazy EggOptimizelyMixpanelHubspotWebtrendsAct-onWebflowPageflyTinymceFroala EditorCkeditorHubspotInfusionsoftActivecampaignOntraportZohoSendinblueGosquaredSalesforceAlgoliaAwesompleteAlgolia Realtime SearchSwiftypeNew RelicEasyengineDynatraceJahia DxAtlassian Jira Issue CollectorMemberstackStyled-componentsDisqusIntensedebateLivefyreQuestion2answerAmazon ElbHugoGatsbyJekyllHexoTeachableGetcourseKajabiMoodleNavianceThinkificTalentlmsLitmosZendeskDockerThree. jsPhpbbVbulletinXenforoDiscuz! XIpbSmfDiscourseTiki Wiki Cms GroupwareBurning BoardVanillaPhpwindMediawikiDokuwikiTiki Wiki Cms GroupwareAtlassian ConfluenceQuickbooksEnvoyОткрытые системы журналовPhoenixSapperBlazorPlazorPowerOutlook Web AppZimbraRound Eclipse

Название работы

СМОТРЕТЬ КОМПАНИИ

У старых мышей накапливается субпопуляция B-клеток, однозначно реагирующая на врожденные стимулы | Кровь

Пожилой возраст сопровождается нарушением иммунных ответов и повышенной склонностью к аутоиммунным заболеваниям.Хотя механизмы, лежащие в основе этих широких функциональных изменений, остаются неясными, они, вероятно, включают связанные с возрастом изменения в компартментах развивающихся и зрелых Т- и В-клеток (обзор Maue et al. 1 и Cancro et al 2 ). В самом деле, хотя количество гемопоэтических стволовых клеток с возрастом сохраняется или увеличивается, количество клеток, входящих в лимфоидные клоны, постоянно снижается, что приводит к существенно более низкой скорости продукции Т- и В-клеток. 3-7 Об этом свидетельствует уменьшение пулов предшественников BM, а также соответствующее уменьшение промежуточных продуктов дифференцировки в тимусе и на периферии.Несмотря на это, количество зрелых периферических Т- и В-клеток относительно стабильно, 8,9 , но обнаруживают изменения в клональном составе и разнообразии, а также в дифференцировочном потенциале. 2,8,10-13 Хотя причинно-следственные связи установить трудно, эти сдвиги в продукции, составе и обмене лимфоцитов сопровождаются изменениями иммунной реакции. Например, хотя у старых животных развиваются зародышевые центры (ГЦ), как первичные, так и гуморальные реакции памяти притупляются, что, возможно, отражает снижение способности к рекомбинации с переключением классов и генерации долгоживущих плазматических клеток и В-клеток памяти. 2,14,15 В целом, эти изменения коррелируют с повышением заболеваемости и смертности 16 , а также с повышенной заболеваемостью некоторыми гуморальными аутоиммунными заболеваниями (обзор Hasler and Zouali 17 ).

Эти наблюдения можно частично объяснить возрастными изменениями в представлении различных функциональных субпопуляций лимфоцитов. В самом деле, сдвиги в пропорциях подмножеств Т-клеток являются постоянным признаком старения, включая увеличение доли регуляторных Т-клеток, снижение выработки функциональной памяти CD4 + Т-клеток 3,19 и избирательное уменьшение количества оборот подобных памяти (CD44 hi ) CD8 + Т-клеток. 5 Однако менее ясно, появляются ли функционально различные субпопуляции B-клеток с возрастом. В то время как количество незрелых периферических B-клеток падает со снижением продукции BM, устойчивые сдвиги в субпопуляциях зрелых периферических B-клеток не были обнаружены с помощью предшествующих стратегий фенотипирования.

Здесь мы описываем новую субпопуляцию зрелых В-клеток, которая накапливается с возрастом. Хотя эти клетки положительны в отношении корецептора CD19 В-клеток, они не экспрессируют ни CD21 / 35, CD23, CD43, ни AA4.1. Эти клетки плохо реагируют на лигирование BCR и CD40, несмотря на то, что имеют поверхностные уровни IgM, сравнимые с фолликулярными (FO) В-клетками. Вместо этого они реагируют на TLR9 и, в меньшей степени, на лигирование TLR7, и наиболее активно пролиферируют на комбинированные стимулы BCR и TLR. В отличие от FO и B-клеток маргинальной зоны (MZ), они не зависят от стимулятора B-лимфоцитов (BLyS) для выживания, но, тем не менее, экспрессируют рецепторы BLyS и секвестрируют BLyS. Кроме того, они не являются продуктом В-лимфопоэза в старом микросреде и не являются самообновляющимися.Вместо этого клетки с этими фенотипическими характеристиками могут быть получены из FO B-клеток после исчерпывающего размножения in vitro и in vivo. Функционально B-клетки в этом новом подмножестве секретируют Ig при стимуляции TLR, но не BCR. Более того, они предпочтительно секретируют IL-4 и IL-10 и, действуя как APC, усиливают продукцию IL-17 активированными Т-клетками. Вместе эти находки показывают сдвиг в функциональных первичных субпопуляциях B-клеток, который, вероятно, вносит вклад в общие характеристики гуморального иммунного старения.

Методы и как они работают

Мы включаем продукты, которые, по нашему мнению, будут полезны нашим читателям. Если вы совершаете покупку по ссылкам на этой странице, мы можем получить небольшую комиссию. Вот наш процесс.

Чрезмерная укладка, воздействие тепла, химической обработки и другие привычки могут лишить волосы влаги и натуральных масел, что может привести к повреждению волос. Однако в некоторых случаях повреждение волос может быть вызвано заболеванием.

В этой статье мы обсудим, как волосы могут быть повреждены, как их лечить и когда обратиться к врачу.

Волосы состоят из двух структур.

Фолликул волосяной луковицы — это живая часть, расположенная под кожей. Кожа головы человека содержит около 100 000 волосяных фолликулов.

Стержень волоса — это неживая часть над поверхностью кожи головы. Стержень состоит из протеина кератина, который делает волосы крепкими и гибкими.

Ствол состоит из трех слоев:

  • Медулла: Это самая внутренняя часть стержня, которая состоит из воздушных пространств и тонкого ядра клеток.
  • Cortex: Он состоит из длинных кератиновых волокон, скрепленных водородными связями, которые придают волосам прочность, гибкость и эластичность. Кора головного мозга содержит меланин, который придает цвет волосам.
  • Кутикула: Кутикула состоит из перекрывающихся мертвых клеток. Защищает хрупкие внутренние слои от повреждений. Здоровая кутикула гладкая и плоская, сохраняя влажность и упругость волос.

Повреждение волос может происходить по-разному.

Волосы пористые, но липидная мембрана предотвращает их переувлажнение. Согласно статье в Международном журнале трихологии, когда человек очищает волосы от натуральных масел и влаги, это также вызывает потерю этого липидного слоя, в результате чего волосы становятся чрезвычайно пористыми.

В статье также говорится, что расчесывание влажных волос может привести к их растяжению. Хотя растяжение волос до 30% от их первоначальной длины не должно вызывать повреждений, растяжение до 70% может вызвать необратимые повреждения, а растяжение более 80% может вызвать трещины в волосах.

Привычки к уходу, химическая обработка и воздействие окружающей среды также могут вызвать выветривание стержня волоса и изменить текстуру волос. Это приводит к поломке.

Когда волосы сильно повреждены, внешняя кутикула приподнимается и изнашивается, а перекрывающиеся клетки больше не лежат ровно.

Это может привести к тому, что стержень волоса станет хрупким и склонным к расщеплению и поломке.

Лучший способ сохранить здоровье волос — это регулярно стричься и не допускать повреждений от жары и других привычек ухода.

После того, как стержень волоса расколется, человеку нужно будет подстричь волосы до точки, в которой стержень волоса станет целым.

Если человек не удалит секущиеся концы, секция продолжится вверх по стержню волоса, что приведет к поломке волос и их дальнейшему повреждению.

Для волос, которые находятся на ранней стадии повреждения, методы обработки волос могут сгладить волосяные фолликулы, что поможет восстановить внешний вид поврежденных волос.

Кондиционер

Кондиционеры для повседневного использования содержат смазочные и антистатические вещества.

Они также смазывают кутикулу волос и помогают волосам не впитывать слишком много воды.

Глубокое кондиционирование

Человек может также использовать несмываемый кондиционер.

Продукты различаются, но в некоторых сообщениях рекомендуется оставить кондиционер глубокого действия на волосах на 20–30 минут.

Глубокое кондиционирование помогает разглаживать и закреплять кутикулу волос, позволяя им поддерживать баланс влажности.

Здесь можно купить кондиционер для волос в Интернете.

Глазурь для волос

Глазурь для волос покрывает и герметизирует каждый стержень волоса, разглаживая кутикулу аналогично кондиционеру.

Теплозащита

Тепло и ультрафиолет могут повредить волосы человека.

Солнце может повредить волосы, уменьшая протеин и силу сцепления волосяного волокна. Это делает волосы слабыми, сухими и ломкими.

Людям, которые проводят время на солнце, следует надевать головной убор или использовать средство для защиты от ультрафиолета.

Купить УФ-защиту для волос можно здесь.

Нанесение масла

Нанесение определенных масел может улучшить состояние волос.

Согласно статье 2015 года, масла могут помочь предотвратить дальнейшее повреждение. Они могут проникать в волосы и уменьшать количество воды, которую они впитывают. Это может уменьшить повторяющиеся отеки и высыхание, вызывающие повреждение волос.

Масла также могут заполнять щели между кутикулами, защищать волосы от агрессивных веществ и обеспечивать смазку стержня.

Кокосовое масло может уменьшить потерю белка для неповрежденных и поврежденных волос.

Кокосовое масло лучше растительных масел из-за его низкой молекулярной массы, что означает, что оно легче проникает в стержень волоса.

Здесь можно купить средства для волос, содержащие кокосовое масло.

Согласно исследованию 2019 года, оливковое масло первого холодного отжима и кокосовое масло могут защитить волосяные фолликулы от тепла, восстанавливая влажность волос.

Согласно исследованию на мышах, проведенному в 2014 году, масло перечной мяты также может помочь сохранить здоровье волос.

Хорошее питание

Витамины и питательные вещества необходимы для здорового роста и блеска волос.

Согласно статье в Dermatology and Therapy , диета без витаминов, минералов, незаменимых жирных кислот и белков может привести к структурным аномалиям волос и их выпадению.

Люди должны придерживаться сбалансированной диеты, которая содержит множество продуктов, включая белок, фрукты, овощи, зерновые и полезные жиры.

По данным Американской академии дерматологии, эти советы могут помочь человеку сохранить здоровье волос:

  • Вымойте волосы в соответствии с типом волос. : Если у человека жирные волосы, возможно, им придется мыть их ежедневно.Если у человека сухие волосы из-за возраста или химического лечения, им следует мыть их реже.
  • Используйте шампунь правильно: Люди должны наносить шампунь в первую очередь на кожу головы, а не на волосы.
  • Всегда используйте кондиционер: Люди должны наносить кондиционер на кончики волос, избегая попадания на кожу головы.
  • Тщательно выбирайте средства: Человек должен выбирать средства для волос, соответствующие его типу волос.
  • Защищайте волосы от химикатов и агрессивных веществ: Во время плавания человек должен использовать шапочку для плавания, чтобы защитить волосы от химикатов, таких как хлор.

Повреждение и ломкость волос обычно возникают, когда человек подвергает волосы воздействию жестких условий или чрезмерной укладки.

Эти методы включают:

  • использование инструментов для укладки с подогревом, таких как фены, утюги или горячие гребни
  • химическая обработка, включая химическую завивку, окрашивание и отбеливание
  • чрезмерное воздействие солнца и химикатов для бассейнов
  • нечасто стрижка волос
  • отсутствие кондиционирования
  • слишком частая чистка зубов

В некоторых случаях медицинские условия могут повредить волосы:

  • Недоедание: Согласно исследованию 2015 года, состояние здоровья человека зависит от качества его волос.Витамины A и B-12, фолиевая кислота, селен и железо могут влиять на качество волос.
  • Гормоны: Гормональный дисбаланс может стать причиной истончения или ослабления волос. Как синдром поликистозных яичников (СПКЯ), так и менопауза могут стать причиной истончения волос человека.
  • Заболевание щитовидной железы: Гипотиреоз, который возникает, когда щитовидная железа не может вырабатывать достаточное количество гормонов щитовидной железы, может вызвать истончение волос, согласно данным Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек.
  • Аутоиммунные заболевания: Аутоиммунные заболевания соединительной ткани, такие как волчанка и склеродермия, могут привести к тому, что волосы человека станут ломкими и тонкими.

Лица с поврежденными волосами и другими симптомами, такими как усталость, непереносимость жары или холода, потеря веса, чрезмерное выпадение волос или головные боли, должны проконсультироваться с врачом для дальнейшего обследования.

Человек должен также обратиться к врачу, если он испытывает симптомы СПКЯ, включая:

  • нерегулярный менструальный цикл
  • чрезмерный рост волос
  • угри
  • увеличение веса
  • потемнение кожи

чрезмерное воздействие тепла и химическая обработка часто приводит к повреждению волос.

Иногда повреждение волос может быть вызвано серьезными проблемами со здоровьем.

Люди могут попробовать различные методы лечения, чтобы восстановить повреждение и дать здоровым новым волосам снова отрасти.

Массовая цитометрия CyTOF выявляет фенотипически различные популяции нейтрофилов крови человека, дифференциально коррелированные со стадией меланомы.

Введение

Нейтрофилы представляют собой миелоидные клетки костного мозга (BM), которые играют ключевую роль в противораковом иммунитете.1 Нейтрофилы продуцируются со скоростью 10 11 в день2 3 и составляют 50–70% лейкоцитов крови. Из-за этого быстрого обмена в организме нейтрофилы традиционно рассматривались как однородная популяция. Однако недавние исследования показали, что они демонстрируют более длительный жизненный цикл, чем считалось ранее 4, что возрождает интерес к возможности существования различных популяций нейтрофилов.

Вдохновленные такими открытиями, несколько групп с тех пор идентифицировали и охарактеризовали несколько субпопуляций нейтрофилов.Например, использование разделения в градиенте плотности позволило выявить популяции нейтрофилов низкой плотности (LDN) и нейтрофилов высокой плотности (HDN), каждая из которых обладает противоположным действием в иммунной регуляции и прогрессировании рака. 6 Марини и соавторы использовали проточную цитометрию, чтобы показать, что CD10 + и CD10 нейтрофилов представляют собой популяции с противоположными эффектами на пролиферацию Т-клеток.7 Пиллэй и его коллеги идентифицировали три субпопуляции нейтрофилов на основе их дифференциальной экспрессии CD16 и CD62L, каждая из которых демонстрирует определенные состояния созревания и активации.CD45RA, CD63 и CD11b также указывают на статусы активации в определенных субпопуляциях нейтрофилов.9 10 Сингхал с сотрудниками выделили субпопуляцию нейтрофилов CD14 + с противоопухолевыми функциями, включая усиление продукции интерферона-g и гранзима B. 11 Evrard и его коллеги продемонстрировали CD15 + CD49 + CD101 предшественник нейтрофилов (preNeu) .12 Наша группа идентифицировала CD117 + CD66b + CD38 + предшественник нейтрофилов человека (hNeP), который также был обнаружен в крови животных с опухолями.13 Дополнительная работа в этой области резюмирована в двух отличных обзорных статьях. 14 15 Тем не менее, отсутствие широко распространенных маркеров субпопуляции препятствует нашему пониманию гетерогенности нейтрофилов. Действительно, субпопуляции нейтрофилов, описанные до сих пор, вероятно, представляют собой пересекающиеся популяции. Например, анализ проточной цитометрии позволяет предположить, что субпопуляции нейтрофилов CD10 + и CD10 фракционированы как на уровни LDN, так и на уровни HDN.7 Кроме того, экспрессия CD10 + , продемонстрированная Marini et al 7 является общей для субпопуляции CD16 bright , описанной Pillay et al .8 Специфические нейтрофилы CD14 + представляют фенотип CD10 , 11 предполагая, что эта субпопуляция перекрывается с популяцией нейтрофилов CD10 .7 Субпопуляция нейтрофилов CD14 + также имеет фенотип CD49d + , что указывает на перекрытие с CD49d + preNeu, продемонстрированным Evrard et al. , 12, а также с субпопуляцией нейтрофилов CD49d + CD62L lo («пожилые нейтрофилы»), о которой сообщили Casanova-Acebes et al .16 Для определения степени пересечения субпопуляций нейтрофилов, о которых сообщалось ранее, необходим высокоразмерный анализ гетерогенности нейтрофилов на одноклеточной основе.

Мы и другие использовали многомерные подходы, такие как одноклеточная цитометрия методом времени пролета (CyTOF) и секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для устранения гетерогенности нейтрофилов. Эти усилия демонстрируют, что клон нейтрофилов включает гетерогенный пул в BM мыши и человека.12 13 Кроме того, анализы scRNA-seq выявляют шесть кластеров нейтрофилов с различными сигнатурами транскрипции в опухолях легких человека, но поверхностные маркеры, необходимые для классификации этих популяций, не были идентифицированы. .17 Интересно, что работа в этой области также предполагает дифференциальное участие субпопуляций нейтрофилов в раке. 18 19 Таким образом, разработка консенсусных маркеров нейтрофилов необходима для улучшения нашего понимания биологии нейтрофилов и ее взаимосвязи с прогрессированием заболевания.

Здесь мы используем панель CyTOF наиболее часто используемых поверхностных маркеров созревания, активации и функции нейтрофилов для всестороннего исследования гетерогенности нейтрофилов в цельной крови (WB) от пациентов с меланомой, ранее не получавших лечения.Высокомерный анализ этого набора данных выявил семь субпопуляций нейтрофилов, связанных со стадией заболевания и воспроизводимых во время ручного стробирования в проточной цитометрии. Наконец, мы обнаружили, что эти семь субпопуляций нейтрофилов несут отличительные функции, продемонстрированные их разной способностью к фагоцитозу и продукции активных форм кислорода (АФК).

Методы

Забор крови пациента с меланомой

Образцы крови пациентов с меланомой, которые не получали лечения после хирургической резекции, были собраны в пробирки, покрытые ЭДТА, базой репозитория биопрепаратов при Онкологическом центре Канзасского университета и доставлены в Ла-Хойю Институт иммунологии (LJI) ночной доставкой. Одновременно в LJI собирали кровь от здоровых доноров в пробирки, покрытые EDTA. Чтобы обеспечить единообразную обработку контрольных и экспериментальных материалов, все образцы крови здоровых доноров хранили при 4 ° C в течение ночи, а затем обрабатывали на следующее утро.

Суспензию клеток человеческого WB

WB подвергали лизису красных кровяных телец (RBC) (буфер для лизиса RBC, eBiosciences) дважды при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин. Затем клетки промывали окрашивающим буфером (забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко + 1% сыворотки крови человека + 0.1% азид натрия + 2 мМ ЭДТА) и фильтровали через фильтр с размером ячеек 70 мкм. Клетки осаждали центрифугированием, и суспензии получали осторожным пипетированием для достижения конечной концентрации 3 × 10 6 клеток на 100 мкл буфера.

Антитела для масс-цитометрии

Антитела, конъюгированные с металлами, были приобретены непосредственно у Fluidigm для доступных мишеней. Для всех других мишеней очищенные антитела были приобретены, как описано ранее. 20 Конъюгации антител получали с использованием набора для маркировки антител Maxpar (Fluidigm) в соответствии с рекомендациями производителя.После этого антитела, конъюгированные с Maxpar, хранили в стабилизирующем растворе антител на основе физиологического раствора с фосфатным буфером (Candor Biosciences) с добавлением 0,05% азида натрия при 4 ° C. Перед использованием все антитела титровали.

Массовая цитометрия (CyTOF)

CyTOF выполнялась в соответствии с ранее описанными протоколами.20 Для окрашивания жизнеспособности клетки промывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали цисплатином (Fluidigm) до конечной концентрации 5 мкМ. Перед окрашиванием поверхности лизированные эритроцитами клетки WB ресуспендировали в буфере для окрашивания в течение 15 мин при комнатной температуре для блокирования рецепторов Fc.Коктейль поверхностных антител, приведенный в таблице 1, добавляли к клеточным суспензиям на 1 час при 4 ° C. Затем клетки промывали буфером для окрашивания и фиксировали 1,6% параформальдегидом (Thermo Fisher) в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого для каждого образца готовили 1 мл раствора для интеркаляции путем добавления Cell-ID Intercalator-Ir (Fluidigm) в Maxpar Fix и Perm Buffer (Fluidigm) до конечной концентрации 125 нМ (1000-кратное разведение исходного раствора 125 мкМ. ) и встряхните, чтобы перемешать. После фиксации клетки ресуспендировали в растворе для интеркаляции и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.Затем клетки промывали в буфере для окрашивания, а затем с последующими промываниями в растворе для сбора клеток (CAS) (Fluidigm) для удаления буферных солей. Затем клетки ресуспендировали в CAS с разведением 1:10 четырехэлементных калибровочных шариков EQ (Fluidigm) и фильтровали через колпачок с нейлоновой сеткой 35 мкм (Corning, Falcon). Образцы анализировали на масс-цитометре Helios 2 CyTOF (Fluidigm), оборудованном Super Sampler (Victorian Airship & Scientific Apparatus), при частоте событий ≤500 событий / с. Файлы данных массовой цитометрии были нормализованы с помощью программы Normalizer21 на основе гранул и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа Cytobank (https: // www.cytobank.org/). Для анализа данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой (FlowSOM) в Cytobank иерархическая кластеризация использовалась для определения семи метакластеров на основе медианной экспрессии маркера (после преобразования arcsinh с кофактором, равным 5) из визуализации t-распределенного стохастического соседа. встраивание (viSNE) результатов.

Таблица 1

Цитометрия с помощью панели «времяпролетного антитела»

Проточная цитометрия и сортировка клеток

Все окрашивание методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) проводили в окрашивающем буфере при 4 ° C.Клетки фильтровали через стерильные сетчатые фильтры размером 70 мкм для получения суспензий отдельных клеток (30 000 клеток на мкл для анализа проточной цитометрии, 0,5–2 × 10 7 клеток на мл для сортировки). Перед окрашиванием поверхности лизированные эритроцитами клетки WB ресуспендировали в буфере для окрашивания для блокирования рецепторов Fc в течение 15 мин при комнатной температуре. Окрашивание поверхности проводили в течение 30 мин в конечном объеме 500 мкл для сортов FACS и 100 мкл для стандартной проточной цитометрии. Перед сбором клетки дважды промывали не менее 200 мкл буфера FACS.FACS выполняли с помощью Aria II и Aria-Fusion (BD Biosciences) и обычной проточной цитометрии с помощью LSRII и LSR Fortessa (BD Biosciences). Вся проточная цитометрия проводилась на живых клетках. Процентное содержание иммунных клеток CD45 + рассчитывали путем прямого и бокового рассеяния и анализа жизнеспособности живых клеток. Все анализы и сортировки повторяли не менее трех раз, и чистоту каждой отсортированной фракции определяли визуально и с помощью повторного анализа маркеров поверхности с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo V.10.5.

Фагоцитоз

Фагоцитарную способность нейтрофилов оценивали с помощью набора для анализа фагоцитоза (красный зимозан) (Abcam) в соответствии с протоколом производителя. Клетки WB, лизированные эритроцитами, разводили до концентрации 3 × 10 6 клеток в 1 мл буфера и инкубировали с 5 мкл суспензии зимозана на образец при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 2,5 часов. После этого образцы центрифугировали в течение 5 минут при 400 × g и затем окрашивали коктейлем из 100 мкл антител для обнаружения фагоцитоза нейтрофилами красных частиц зимозана на основе проточной цитометрии.

Обнаружение клеточных ROS

Производство ROS нейтрофилами было обнаружено с помощью набора для определения клеточных ROS (Abcam) в соответствии с руководством производителя. Клетки WB, лизированные эритроцитами, разводили до концентрации 3 × 10 5 клеток в 100 мл буфера. Предварительную обработку ингибитором ROS (N-ацетил-L-цистеином) проводили для группы отрицательного контроля при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 30 минут. Затем в коктейль антител добавляли антитело для обнаружения ROS для обнаружения продукции ROS нейтрофилами на основе проточной цитометрии.Индуктор АФК (пиоцианин) добавляли ко всем группам и инкубировали в течение 30 мин до сбора данных на цитометре.

Количественный анализ и статистический анализ

Данные для всех экспериментов анализировали с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad). На рисунке 1 коэффициенты линейной регрессии и корреляции Пирсона использовались для определения корреляции между частотами кластеров нейтрофилов со стадиями меланомы. Различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и множественных сравнительных тестов Тьюки с одной объединенной дисперсией.На рисунке 2 парные t-критерии Стьюдента использовались для сравнения различий между здоровыми пациентами и пациентами с меланомой. Для рисунков 3B и E, F и дополнительных онлайн-рисунков 7A, C – E различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и тестов множественного сравнения Тьюки с одной объединенной дисперсией. Для рисунка 3C и дополнительных онлайн-рисунков 7B и F для сравнения групп + зимозан и -зимозан были выполнены обычные двухфакторные тесты ANOVA и множественные сравнительные тесты Сидака с индивидуальными дисперсиями, рассчитанными для каждого сравнения.Планки погрешностей указывают на среднее ± стандартное отклонение Значения P были рассчитаны путем двустороннего сравнения с 95% доверительными интервалами и показаны в стиле Американской психологической ассоциации (APA).

Рисунок 1

Гетерогенность нейтрофилов у пациентов с меланомой коррелирует со стадией заболевания. (A) Круговые диаграммы показывают средние проценты для каждого кластера FlowSOM (hNeP и Cneut1-6) в общем количестве нейтрофилов крови пациентов, сгруппированных по стадиям меланомы. Для этого анализа использовались только пациенты с диагнозом стадии меланомы, показанной в таблице 2. Количество субъектов на каждой стадии меланомы указано на графике. (B) Линейный регрессионный анализ показан на точечной диаграмме, изображающей корреляции между частотой кластеров нейтрофилов и стадией меланомы. Каждая точка представляет одного пациента. Результаты анализа Пирсона показаны для каждого кластера. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. (C) Гистограмма показывает средний процент каждого кластера в группах пациентов A – D. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2).Количество субъектов в каждой группе указано под каждой колонкой. (D) Графики скрипки показывают частоту кластеров нейтрофилов в пулах пациентов A – D. Квартили и медианные значения для каждой группы пациентов показаны пунктирными линиями. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2). Различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки с одной объединенной дисперсией.Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. (E) Гистограмма показывает процент пациентов на разных стадиях меланомы (таблица 2) в группах пациентов –D. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2). Количество пациентов в каждом пуле указано под каждым столбцом. APA ‘Американская психологическая ассоциация; FlowSOM, анализ данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; N / A, отсутствует информация о диагнозе пациентов.

Рисунок 2

Проточная цитометрия воспроизводит семь субпопуляций нейтрофилов. (A) Нейтрофилы крови CD66b + отбирали вручную и подвергали последовательному стробированию для идентификации субпопуляций нейтрофилов с помощью CyTOF. Шкалы показаны в преобразовании arcsinh с кофактором, равным 5. (B) Стратегия стробирования из (A) была подтверждена проточной цитометрией у не получавших лечения пациентов с меланомой. Шкалы показаны в биэкспоненциальном масштабе. (C) Анализ проточной цитометрии нейтрофилов крови здорового донора со стратегией гейтирования из (A).Шкалы показаны в биэкспоненциальном масштабе. (D) Анализ проточной цитометрии частоты каждой вручную управляемой субпопуляции нейтрофилов в общем количестве нейтрофилов крови. Были проанализированы пять здоровых доноров (возраст 23–46 лет, двое женщин и трое мужчин) и пять не получавших лечения пациентов с меланомой (возраст 59–79 лет, двое женщин и трое мужчин). Каждая точка представляет результат одного пациента. Парные t-критерии использовались для сравнения различий между здоровыми пациентами и пациентами с меланомой. Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение.Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. CyTOF, цитометрия по времени пролета; hNeP, предшественник нейтрофилов человека.

Таблица 2

Демографические данные пациентов и характеристики опухоли

Результаты

CyTOF выявляет семь кластеров нейтрофилов в крови пациентов с меланомой

Для выявления новых популяций нейтрофилов в крови мы использовали массовую цитометрию CyTOF для анализа образцов свежей крови, лизированных эритроцитами. из когорты из 21 пациента с меланомой (таблица 2).На момент сбора образцов у этих пациентов был недавно поставлен диагноз, они не получали никакого лечения от своего состояния (не лечились), и их возраст составлял от 24 до 82 лет, средний возраст составлял 69 лет (таблица 2). После обработки образцы подвергали панели антител CyTOF, которая одновременно измеряла экспрессию 40 поверхностных маркеров нейтрофилов (таблица 1). Маркеры клонов лейкоцитов (таблица 1) были использованы для выполнения автоматизированного анализа viSNE для изучения живых одиночных клеток CD45 + в крови (онлайн-дополнительный рисунок 1A). Нейтрофилы (кластер, обогащенный клетками CD66b + ) были отличимы от всех других лейкоцитов с использованием этой стратегии (онлайн-дополнительная фигура 1B).

Рисунок 3

Семь субпопуляций нейтрофилов обладают различной фагоцитарной способностью и способностью продуцировать АФК. Трое случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет; одна женщина и двое мужчин) были проанализированы с помощью проточной цитометрии. (A – C) Образцы крови, лизированные эритроцитами, инкубировали с предварительно меченными частицами зимозана в течение 2,5 часов. После этого клетки собирали и окрашивали с помощью панелей проточной цитометрии, описанных на фигуре 2 и дополнительной онлайн-фигуре 6C.Каждая субпопуляция нейтрофилов была закрыта для оценки поглощения ею частиц зимозана. (A) Зимозан-положительные клетки показаны красным; Зимозан-отрицательные клетки показаны синим цветом. Группа без зимозана (-зимозан) показана на нижних панелях как контрольная группа. (B) Процент зимозан-положительных клеток (красные точки на A) в каждой контролируемой субпопуляции нейтрофилов. Планки погрешностей указывают среднее значение с SD. (C) gMFI зимозана в каждой субпопуляции закрытых нейтрофилов. Планки погрешностей указывают среднее значение с SD. (D) Способность семи субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК определяется с помощью проточной цитометрии.Образцы крови, лизированные эритроцитами, были разделены на три группы и инкубированы с −sti, + sti или sti + ROSi. После этого каждая субпопуляция нейтрофилов была заблокирована для оценки ROS + клеток. На гистограммах показаны субпопуляции закрытых нейтрофилов в каждой группе: –sti показан черным цветом; + sti отображается красным цветом; + sti + ROSi отображается синим цветом. (E) Процент ROS + клеток в каждой субпопуляции закрытых нейтрофилов из группы + sti. Планки погрешностей указывают среднее значение с SD. (F) ROS gMFI FC каждой закрытой субпопуляции нейтрофилов от группы + sti до группы -sti.Статистика: (B, E, F) различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки с одной объединенной дисперсией. (C) Обычный двухфакторный дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Сидака с индивидуальными дисперсиями, рассчитанными для каждого сравнения, были выполнены для сравнения между группами + зимозан и -зимозан. Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. APA, Американская психологическая ассоциация; ANOVA, дисперсионный анализ; FC, изменение кратности; gMFI — средняя геометрическая интенсивность флуоресценции; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; Эритроциты, эритроциты; АФК, активные формы кислорода; ROSi, ингибитор активных форм кислорода; SSC-A, −sti, без стимуляции; + sti, только индуктор АФК (пиоцианин).

Мы сосредоточились на обогащенном клетками кластере CD66b + для анализа гетерогенности нейтрофилов во всех образцах пациентов. Наши результаты демонстрируют, что эти образцы содержали CD117 + CD66b + , популяцию hNeP (рисунок 4A), которую мы ранее идентифицировали.13 Кроме того, анализ FlowSOM22 выявил еще шесть кластеров нейтрофилов (обозначенных Cneut1 — Cneut6, рисунок 4B). , каждый с отличным профилем маркера поверхности (рис. 4C). Кровь двух случайно выбранных здоровых доноров использовалась в качестве контрольной группы для определения популяции добросовестных нейтрофилов крови (дополнительный рисунок 2A онлайн).По сравнению с нейтрофилами крови здоровых доноров нейтрофилы от пациентов с меланомой показали более высокую гетерогенность, а частота наибольшего кластера нейтрофилов (Cneut2) снизилась с> 95% у здоровых доноров до <90% у пациентов с меланомой (дополнительный рисунок 2B онлайн). Профиль маркеров Cneut2 в здоровой крови существенно не отличался от профиля Cneut2 у пациентов с меланомой (дополнительный рисунок 2C онлайн). Поскольку маркеры зрелости обычно используются для различения субпопуляций циркулирующих нейтрофилов при раке, 12 23 мы затем количественно оценили экспрессию этих маркеров в нейтрофилах, сгруппированных по Cneut1-Cneut6. Мы обнаружили, что кластер Cneut2 экспрессирует высокие уровни CD101, CD10 и CD16 по сравнению с другими кластерами, что указывает на его обогащение терминально дифференцированными зрелыми нейтрофилами (рис. 4C, D) .7 Кроме того, кластеры CD10 lo (Cneut1 и Cneut3- Cneut6) экспрессируют пониженные уровни CD101, подчеркивая их незрелость12 по сравнению с кластером Cneut2 (рисунок 4D). Нейтрофилы, объединенные в кластеры Cneut1, Cneut3 и Cneut6, экспрессируют маркеры предшественников (CD34 и CD117) на более низком уровне, чем hNeP, но на более высоком уровне, чем другие кластеры (рисунок 4D и дополнительный рисунок 3A онлайн).В кластере Cneut5 экспрессия CD34 и CD117 была снижена по сравнению с Cneut1, Cneut3 и Cneut6 (дополнительный рисунок 3A онлайн). Напротив, уровни CD10 и CD16 были выше в кластере Cneut5 по сравнению с Cneut3 и Cneut6, что указывает на то, что этот кластер обозначает незрелые нейтрофилы (рисунок 4D). Более того, Cneut3 и Cneut6 экспрессируют CD101 CD49d + , что позволяет предположить, что эти кластеры принадлежат к популяции preNeu.

Рисунок 4

Анализ крови пациентов с меланомой на основе CyTOF выявил семь автоматизированных кластеров нейтрофилов.Нейтрофилы крови (автоматизированный кластер CD66b + из дополнительного онлайн-рисунка 1В) от не получавших лечения пациентов с меланомой были подвергнуты автоматическому анализу. (A) Средние интенсивности экспрессии CD117 и CD66b показаны на карте viSNE в виде точек, окрашенных в спектр (низкий синий, высокий красный). hNeP был идентифицирован на карте viSNE на основе экспрессии CD117 + CD66b + . (B) Анализ FlowSOM результатов viSNE выявил семь автоматизированных кластеров. (C) Тепловая карта показывает среднюю интенсивность каждого маркера в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах в глобальном масштабе.(D) Точечный график показывает среднюю интенсивность каждого маркера зрелости в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах. Каждая точка представляет результат одного пациента. (E) Точечный график показывает среднюю интенсивность каждого функционального маркера в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах. Каждая точка представляет результат одного пациента. CyTOF, цитометрия по времени пролета; FlowSOM, анализ данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; viSNE, визуализация t-распределенного стохастического вложения соседей.

Мы дополнительно охарактеризовали эти кластеры, сравнивая функциональные маркеры, ранее использовавшиеся для оценки популяций нейтрофилов (рис. 4E). В соответствии с первоначальными данными на рисунке 4C, Cneut2 экспрессировал самые высокие уровни CXCR2, подтверждая его статус созревания. Интересно, что Cneut3 и Cneut6, которые оба идентифицированы как принадлежащие к пулу CD101 CD49d + preNeu, демонстрировали разные уровни CD45RA и CD14. CD45RA экспрессировался только Cneut3, тогда как CD14 экспрессировался исключительно Cneut6.Кроме того, Cneut3 демонстрирует более высокие уровни CXCR4 по сравнению с кластером Cneut6, что позволяет предположить, что Cneut3 представляет собой ранее сообщавшуюся стареющую (CXCR4 + CD49d + CD62L lo ) популяцию нейтрофилов (дополнительный рисунок 3B онлайн). экспрессировал низкие количества CD16 по сравнению с Cneut2 (фигура 4D) и окрашивался положительно на CD62L (фигура 4E), что позволяет предположить, что эти клетки представляют собой клетки CD16 dim CD62L яркие полосы , описанные ранее.8 В целом, наш подход позволил воспроизвести как новые, так и установившиеся популяции нейтрофилов из периферической крови пациентов с меланомой.

Гетерогенность нейтрофилов коррелирует со стадией меланомы

На основании вышеупомянутых результатов мы попытались определить частоту каждого кластера нейтрофилов в образцах наших пациентов. Мы не наблюдали обогащения определенных кластеров нейтрофилов, связанных с демографическими данными пациента, такими как возраст и пол, или характеристиками опухоли, такими как анатомическое расположение или статус изъязвления. Никаких существенных корреляций между изменениями частоты кластеров и демографическими данными пациентов, описанными в таблице 2, не наблюдалось. Однако общая частота предшественников / незрелых нейтрофилов (hNeP, Cneut1 и Cneut3-Cneut5) увеличивалась до четырех раз с прогнозом заболевания (рисунок 1A и онлайн) дополнительная фигура 4A, B), тогда как положительная корреляция наблюдалась между процентом Cneut2 от общего числа нейтрофилов со стадией меланомы (Pearson r = 0,5473, p = 0,023), определенной с помощью регрессионного анализа (рисунок 1B).Таким образом, мы предположили, что различные паттерны гетерогенности нейтрофилов, демонстрируемые частотами кластеров, позволяют прогнозировать стадию заболевания. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разделили пациентов на четыре разные группы (A – D) на основе этих закономерностей, как было проанализировано viSNE (рисунок 1C и дополнительные рисунки 4C, D в Интернете). Из этого анализа мы определили, что пациенты в группе C имеют самые высокие частоты hNeP, Cneut1 и Cneut3. Пациенты, включенные в группу D, имеют самые высокие частоты Cneut4 и Cneut5 (рисунок 1D).Частота Cneut2 постепенно снижается в группах пациентов A – D. Затем мы исследовали стадию меланомы у пациентов в этих четырех группах (рис. 1E). Интересно, что у всех пациентов в группе A была диагностирована ранняя стадия рака, тогда как в группах C и D был самый высокий процент пациентов со стадией III и стадией IV. Эти результаты предполагают, что определенные паттерны гетерогенности нейтрофилов связаны с прогрессированием меланомы и могут помочь в группировке пациентов и диагностике.

Проточная цитометрия повторно захватывает семь субпопуляций нейтрофилов в крови пациентов с меланомой

Затем мы спросили, можно ли использовать маркеры, выделенные в нашем анализе in silico, для разработки стратегии ручного стробирования для репликации семи кластеров нейтрофилов, идентифицированных CyTOF (рисунок 2A и онлайн-дополнительный рисунок 5).Таким образом, мы сначала использовали ручное стробирование, чтобы изолировать общее количество нейтрофилов из данных CyTOF. Эти клетки перекрывались с 90% нашего автоматизированного обогащенного клетками кластера CD66b + за счет ретроспективного анализа (дополнительный рисунок 5 онлайн). После применения ручного гейт для нейтрофилов CD66 + мы суммировали семь субпопуляций, исследуя паттерны экспрессии CD117, CD79b, CD45RA, CD16, CD49d, CD101 и CD10. Чтобы проверить, отражают ли популяции, введенные вручную, автоматизированные кластеры, мы проверили эту стратегию гейтирования путем (1) обратного стробирования контролируемых вручную субпопуляций на автоматизированную карту viSNE и (2) обратного стробирования автоматизированных кластеров на ручные ворота (онлайн-дополнительный рисунок 6AB). .Оба метода подтвердили, что наша стратегия ручного стробирования способна успешно изолировать CyTOF-идентифицированные hNeP и кластеры нейтрофилов Cneut1-Cneut6.

Затем мы дополнительно проверили эту стратегию ручного стробирования (онлайн-дополнительный рисунок 4 и рисунок 2A) с помощью проточной цитометрии (онлайн-дополнительный рисунок 6C и рисунок 2B, C). Чтобы подтвердить применимость этих результатов в отношении рака, мы исследовали гетерогенность нейтрофилов у пяти здоровых доноров (возраст 23–46 лет, две женщины, трое мужчин) и сравнили их с пятью дополнительными не леченными ранее пациентами с меланомой (возраст 59–79 лет). лет, две женщины и трое мужчин).Мы наблюдали, что популяция Cneut2 составляла> 95% от общего количества нейтрофилов у здоровых доноров, тогда как другие популяции (hNeP, Cneut1, Cneut3, Cneut4, Cneut5 и Cneut6) выявлялись редко (рисунок 2C, D). Более того, по сравнению со здоровыми донорами, эти субпопуляции (hNeP, Cneut1, Cneut3, Cneut4, Cneut5 и Cneut6) чаще появлялись у не получавших лечения пациентов с меланомой, которые составляли> 10% общего количества нейтрофилов, по данным проточной цитометрии. Однако частота Cneut2 была снижена до <90% от общего количества нейтрофилов в крови пациентов с меланомой.Этот результат согласуется с результатами CyTOF, которые мы наблюдали на дополнительном рисунке 2 онлайн, и предыдущими результатами, показывающими, что как незрелые нейтрофилы, так и preNeus мобилизуются при раке24 25

Семь субпопуляций нейтрофилов выполняют разнообразные иммунные функции.

После этого мы попытались определить, проявляют ли семь идентифицированных нами субпопуляций нейтрофилов уникальные иммунологические фенотипы. Фагоцитоз и образование АФК — две основные функции нейтрофилов в иммунной системе.26 Таким образом, мы оценили фагоцитарную способность и способность продуцировать АФК семи субпопуляций нейтрофилов.

Семь субпопуляций нейтрофилов от трех случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет, одна женщина и двое мужчин) были проанализированы на предмет их фагоцитоза предварительно меченных частиц зимозана. Поглощение частиц зимозана субпопуляциями нейтрофилов затем определяли количественно путем стробирования с помощью проточной цитометрии (красный цвет в группе с добавлением зимозана (+ зимозан), верхние панели рис. 3A) и сравнивали с контрольной группой (без добавления зимозана (-зимозан). рисунок 3А нижних панелей).Чтобы определить фагоцитарную способность каждой субпопуляции, мы сравнили зимозан-положительную часть (Zym + Neuts) в каждой субпопуляции нейтрофилов из группы с добавлением зимозана (+ зимозан). Поразительно, что каждая субпопуляция нейтрофилов выполняла фагоцитоз с разной степенью эффективности. Наши результаты показывают, что популяции hNeP и Cneut1 демонстрируют самые высокие фагоцитарные способности (рис. 3B, C). Действительно, фагоцитарные способности hNeP и Cneut1 были сопоставимы или выше, чем у моноцитов, собранных от одних и тех же доноров (онлайн-дополнительные рисунки 7A, B).Более того, фагоцитарные способности других субпопуляций были снижены в 3 раза до> 20 раз (рис. 3B, C). Несмотря на то, что Cneut2 и Cneut5 обладают более низкой фагоцитарной способностью по сравнению с hNeP и Cneut1, они были наиболее распространенными субпопуляциями нейтрофилов в крови пациентов с меланомой (рисунки 1 и 4). Таким образом, абсолютные количества клеток Zym + Cneut2 и Cneut5 по-прежнему составляют наибольшую часть (около 50%) всех фагоцитарных (Zym +) нейтрофилов и около 25% от общего количества фагоцитарных лейкоцитов CD45 + (дополнительные рисунки 7C, D онлайн).

Наконец, мы попытались определить способность субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК. Семь субпопуляций нейтрофилов от трех дополнительных случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет, одна женщина и двое мужчин) были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Способность закрытых нейтрофилов продуцировать ROS оценивалась в трех экспериментальных группах: без стимуляции (-sti), только индуктор ROS (пиоцианин) (+ sti) или индуктор ROS плюс ингибитор ROS (+ sti + ROSi). Мы установили, что все семь субпопуляций нейтрофилов производили АФК при стимуляции пиоцианином и реагировали на ингибитор (рисунок 3D).Однако эти клетки значительно отличаются друг от друга по способности продуцировать АФК. Например, субпопуляции Cneut2 и Cneut5 показали самый высокий процент клеток ROS + в группе только с индуктором (+ sti) (рис. 3E). Между тем, популяции Cneut4 и Cneut6 показали самую низкую способность продуцировать АФК из всех субпопуляций, с уровнями, сопоставимыми с уровнями, производимыми моноцитами (рисунок 3E и дополнительный рисунок 7E онлайн). Чтобы исключить вмешательство из-за неиндуктор-специфической продукции ROS каждой популяцией во время инкубации, мы сравнили кратное изменение (FC) ROS gMFI в группе, получавшей только индуктор (+ sti), с группой без стимуляции (-sti).Результат FC согласуется с нашим наблюдением, что N 2 имеет самую высокую способность производить ROS (рисунок 3F). Кроме того, мы обнаружили, что все субпопуляции ответили на ROSi на разных уровнях. Короче говоря, предварительная обработка ROSi блокировала продукцию ROS в Cneut2 на 85%, тогда как эффективность блокирования достигла только около 25% в Cneut4 (дополнительный рисунок 7F в Интернете). Вместе наши данные показывают, что семь субпопуляций нейтрофилов обладают разными иммунологическими возможностями.

Обсуждение

Гетерогенность нейтрофилов стала активной областью исследований, особенно в отношении прогрессирования рака.18 Нейтрофилы выполняют противоположные функции при раке, либо убивая раковые клетки (противоопухолевые функции), либо способствуя росту опухоли (противоопухолевые функции) . 18 Такие наблюдения уже давно свидетельствуют о существовании различных субпопуляций нейтрофилов. Традиционно подтипы нейтрофилов разделяли с помощью методов градиентного центрифугирования и без использования характеристики поверхностных маркеров, особенно в исследованиях, связанных с раком.1 18 Появление проточной цитометрии показало, что нейтрофилы экспрессируют разнообразный набор профилей поверхностных антигенов.27 Однако из-за ограничений, накладываемых проточной цитометрией, исследователям приходилось произвольно выбирать только несколько поверхностных маркеров для исследования в любой конкретный момент времени. Например, исследования рака легких традиционно используют один набор маркеров для определения представляющих интерес нейтрофилов, тогда как исследования инфекционных заболеваний используют другой набор маркеров; это также относится к работе над ролью нейтрофилов как в гематопоэзе, так и в ангиогенезе.15 19 Следовательно, субпопуляции нейтрофилов, о которых сообщают разные группы, имеют общие индивидуальные особенности, такие как CD66b и / или CD15, но различаются в отношении оценки других поверхностных антигенов.Таким образом, отсутствие консенсусных маркеров нейтрофилов и их функциональных субпопуляций остается проблемой при идентификации субпопуляций, имеющих отношение к заболеванию.

Высокомерный анализ нейтрофилов на уровне отдельных клеток необходим для решения проблем, связанных с идентификацией консенсусных маркеров нейтрофилов. Чтобы удовлетворить этот спрос, мы и другие использовали CyTOF для исследования новых предшественников / предшественников нейтрофилов в BM.12 13 Zilionis и его коллеги сообщили о всестороннем анализе гетерогенности миелоидных клеток с помощью одноклеточной транскриптомики при немелкоклеточном раке легкого.17 Это исследование обнаружило у этих пациентов шесть популяций нейтрофилов крови с уникальными генами; также была обнаружена популяция, подобная миелоидным предшественникам, но она осталась не охарактеризованной. Однако гены, кодирующие поверхностные маркеры, не обсуждались в этом исследовании, что затрудняет сравнение этих нейтрофилов и миелоидных предшественников с установленными субпопуляциями нейтрофилов.

Здесь мы стремились установить парадигму для характеристики гетерогенности нейтрофилов и корреляции конкретных подмножеств нейтрофилов с серьезностью рака.Таким образом, мы разработали панель CyTOF для оценки экспрессии наиболее часто используемых поверхностных антигенов в образцах нейтрофилов от пациентов с меланомой. Мы идентифицировали семь кластеров нейтрофилов в крови пациентов с меланомой, ранее не получавших лечения, с помощью CyTOF и представили доказательства, указывающие на то, что несколько ранее идентифицированных субпопуляций нейтрофилов перекрываются друг с другом6, 12, 16 и / или представляют собой смешанный пул.7 8 Это исследование также предоставило поток стратегия стробирования цитометрии, основанная на нашей работе CyTOF, для повторения этих семи субпопуляций нейтрофилов.Наши результаты показывают, что эти субпопуляции демонстрируют разную способность фагоцитировать дебрис и производить АФК. Интересно, что снижение способности Т-клеток как связывать димеры пептид-MHC, так и отвечать на специфические пептиды индуцируется продуцированием ROS на основе миелоидных клеток.28 И наоборот, было показано, что производство ROS миелоидом необходимо для антиген-специфической отзывчивость как CD4 +, так и CD8 + Т-клеток.29 Эту противоречивую роль АФК в регуляции активности Т-клеток можно частично объяснить двойной ролью АФК; при низких и умеренных концентрациях АФК полезны для выживания клеток, тогда как высокие уровни АФК могут вызывать гибель клеток.30 Таким образом, способность этих семи субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК предполагает, что они могут выполнять различные роли в регуляции ответов Т-клеток при раке. Интересно, что наши результаты показывают заметное сходство между этими субпопуляциями и ранее зарегистрированными подтипами нейтрофилов с незрелыми состояниями развития. Мы предполагаем, что наблюдаемая нами гетерогенность нейтрофилов, полученных от пациентов с раком, может быть связана с привлечением популяций preNeus и незрелых нейтрофилов из BM в кровоток с помощью связанных с раком цитокинов, таких как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.Поскольку панель CyTOF, используемая в этом исследовании, является селективной для нейтрофилов крови человека и маркеров рака, наши результаты не отражают гетерогенность нейтрофилов по видам, органам и / или различным заболеваниям. Более высокие измерения неоднородности внутри наших зарегистрированных субпопуляций в таких биологических условиях должны быть в центре внимания будущей работы. Некоторые редкие субпопуляции нейтрофилов, такие как экспрессирующие Т-клеточные рецепторы (TCR) 31, также могут быть потеряны во время стробирования. Кроме того, мы не можем исключить возможность фенотипического переключения между этими семью субпопуляциями и, таким образом, считаем это понятие интересным направлением для последующего наблюдения.6 32

Таким образом, наш анализ гетерогенности нейтрофилов с помощью CyTOF успешно продемонстрировал заметные паттерны гетерогенности нейтрофилов в каждой выборке пациентов, не получавших лечения, на основе частоты каждого кластера как доли от общего числа нейтрофилов. Мы определили группы пациентов на основе сходства этих паттернов гетерогенности нейтрофилов. Группы пациентов отображали разные категории стадий меланомы, что указывает на связь между гетерогенностью нейтрофилов и заболеванием, но необходима дальнейшая проверка.Мы также показали, что эти автоматизированные кластеры могут быть воспроизведены путем ручного стробирования в традиционной проточной цитометрии. Наконец, мы демонстрируем, что эти субпопуляции нейтрофилов проявляют существенно разные способности к фагоцитозу и продукции АФК. Таким образом, мы предполагаем, что эти субпопуляции играют разные роли в инициации и / или прогрессировании рака.

Ячейки | Бесплатный полнотекстовый | Tsc1 регулирует способность к пролиферации мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга

1.

Введение Мутация зародышевой линии либо TSC1 (кодирующего гамартин), либо TSC2 (кодирующего туберин) вызывает туберозный склероз (TSC), мультисистемное аутосомно-доминантное заболевание, распространенность которого оценивается у 1 из 6000 новорожденных. TSC характеризуется доброкачественными очаговыми пороками развития, называемыми гамартомами, которые включают доброкачественные клетки, демонстрирующие аномальную пролиферацию и дифференцировку клеток [1,2]. TSC часто вызывает инвалидизирующие неврологические расстройства, включая эпилепсию, умственную отсталость и аутизм.Другие основные особенности этого синдрома включают различные проявления мезенхимального происхождения, такие как (1) почечные ангиомиолипомы [3], доброкачественные опухоли, состоящие из аномальных сосудов, незрелых гладкомышечных клеток и жировых клеток; (2) лимфангиолейомиоматоз, широко распространенная легочная пролиферация аномальных гладкомышечных клеток и кистозные изменения в паренхиме легких [4]; (3) сердечные рабдомиомы, внутриполостные или интрамуральные опухоли из поперечно-полосатых клеток, которые присутствуют почти у 50–70% младенцев с TSC [5].Утрата гетерозиготности в локусе TSC1 или TSC2 и гиперфосфорилирование рибосомного белка S6 были задокументированы в каждом из трех клеточных компонентов ангиомиолипом [6], предполагая, что они могут возникать от общего предшественника и что комплекс TSC1 – TSC2 регулирует дифференцировку клеток, происходящих из мезенхимы. TSC1 и TSC2 образуют стабильный комплекс и функционируют как фактор активации ГТФазы малой ГТФазы Rheb. Rheb циклически переключается между GTP-связанной активной формой и GDP-связанной неактивной формой и потенциально может активировать мишень рапамицина 1 (mTORC1) у млекопитающих.Стимуляция гидролиза Rheb GTP комплексом TSC1-TSC2 ингибирует активность mTORC1 и последующее фосфорилирование его мишеней, включая киназу p70 S6 (S6K) и эукариотический фактор инициации трансляции 4E-связывающий белок 1 (4E-BP1), вызывая уменьшение количества клеток. рост и синтез белка [7]. Было показано, что стойкая активация mTORC1 в результате генетической делеции TSC1 [8,9], PTEN [10] или сверхэкспрессии Wnt [11] вызывает фенотип пролиферативных стволовых клеток в эпителиальных и гематопоэтических тканях с последующим истощением стволовых клеток. .Было высказано предположение, что аберрантная активация mTORC1 вызывает истощение стволовых клеток за счет увеличения трансляции нижестоящих мишеней и последующей активации опухолевых супрессивных / отказоустойчивых механизмов, приводящих к клеточному старению или апоптозу [9,12,13,14]. Однако молекулярные механизмы и мишени mTORC1 в этом контексте пока неизвестны. Интересно, что ингибирование mTORC1 также увеличивает продолжительность жизни организма [15,16], что согласуется с представлением о том, что снижение потенциала стволовых клеток лежит в основе старения [17].Учитывая мезенхимальные патологии, характерные для TSC, и предполагаемую роль TSC1 / TSC2 в поддержании стволовых клеток, мы исследовали эффекты инактивации Tsc1 в мезенхимальных стволовых клетках (МСК, также определяемых как мультипотентные мезенхимальные стромальные / клетки-предшественники) и их производных потомках. МСК включают гетерогенную субпопуляцию мультипотентных клеток, присутствующих в стромальной фракции многих тканей взрослого человека [18,19], которые пролиферируют in vitro в виде прикрепленных к пластику фибробластоподобных клеток [20], обладают колониеобразующим потенциалом и могут дифференцироваться в адипоциты, остеоциты. , хондроциты, фибробласты и миоциты [21].Однако, несмотря на их значительный терапевтический потенциал в широком диапазоне клеточных терапий и протоколов тканевой инженерии, клеточные пути, которые регулируют самообновление и поддержание МСК in vivo, остаются плохо определенными. Здесь мы описываем влияние потери Tsc1 на пролиферативный фенотип костного мозга (BM) –MSCs in vitro и in vivo. Инактивация / подавление Tsc1 достигается либо путем нокаута, опосредованного Tagln-Cre, который эффективно воздействует на гладкие мышцы [22] и популяции предшественников костного мозга [23], либо путем нокдауна, опосредованного shRNA. Продолжительность жизни организма, разрастание негематопоэтического BM, колониеобразующий потенциал МСК, старение и дифференцировка клеток оценивали в ответ на потерю Tsc1, а также вклад mTOR в эти эффекты.

2. Материалы и методы

2.1. Создание модели
мыши. Все эксперименты на животных и процедуры выполняли в соответствии с протоколами, утвержденными NYU IACUC (№061108-03 и №100108-01). Мышей со специфической для гладких мышц (Transgelin: Tagln) делецией одного или двух аллелей Tsc1 получали путем скрещивания мышей с условным аллелем Tsc1 L / L (Tsc1tm1Djk / J, # 005680) [24] с аллелем Tagln. экспрессирующие рекомбиназу cre (Tg (Tagln-cre) 1Her / J, [22], полученную от Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мэн, США).Гетерозиготных мышей (Tagln-cre + / Tsc1 Δ / + ) скрещивали с получением гомозиготных Tagln-cre + / Tsc1 Δ / Δ . Когорты Tagln-cre + / Tsc1 + / + , Tagln-cre + / Tsc1 Δ / + и Tagln-cre + / Tsc1 ∆ / ∆. были созданы для анализа костного мозга у молодых (28 дней) и старых (1,5 года) мышей, а также для исследований долгосрочной выживаемости (до 2,3 лет). Для оценки распределения Tagln-опосредованной рекомбинации мышей Tagln-cre скрещивали с репортерными мышами, содержащими условный аллель B6 β-галактозидазы RosaR26.129S4-Gt (Rosa) 26Sortm1Sor / J (Rosa26-LSL-LacZ, 003 474 Jackson Labs) [25]. Потомство Tagln-Cre + / Rosa26-LacZ анализировали на рекомбинацию с использованием окрашивания β-галактозидазой. Генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на условные, нулевые и аллели Tsc1 дикого типа проводили на хвостовой геномной ДНК, как описано ранее [26].
2.2. Выделение и увеличение мезенхимальных стволовых клеток мыши (mMSC)

Костный мозг (BM) собирали промыванием длинных костей большеберцовых и бедренных костей мышей средой для роста MSC с использованием инсулинового шприца. BM собирали от объединенных доноров (n = 3), представляющих каждый генотип, и эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера ACK (аммоний-хлорид-калий). Затем клетки центрифугировали и промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) перед посевом или анализом проточной цитометрией. Для размножения в монослое клетки высевали при низкой плотности (100 клеток / см 2 ) и культивировали в среде для полной изоляции (CIM), состоящей из среды Roswell Park Memorial Institute 1640 (RMPI 1640; Gibco, Карлсбад, Калифорния, США). , 9% фетальная бычья сыворотка (FBS; Cell Gro, Manassas, VA, USA), 9% лошадиная сыворотка (HS; HyClone Thermo, Южный Логан, Юта, США), 100 Ед / мл пенициллин / стрептомицин (Thermo Scientific, Waltham, Массачусетс, США) и 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Через 48 ч прилипшие клетки промывали PBS и каждые 3-4 дня добавляли свежий CIM. После 2 недель культивирования клетки отделяли с 0,25% трипсином (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) и помещали в среду размножения mMSC (CEM), состоящую из модифицированной среды Дульбекко Искова (IMDM; Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) 2. мМ L-глутамин, 10% FBS, 10% HS и 100 Ед / мл пенициллин / стрептомицин (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) для анализов CFU-F, измерения ROS и окрашивания β-gal.

Для экспериментов по нокдауну, опосредованному shRNA, MSC, полученные из BM, были приобретены в Программе распределения MSC Института регенеративной медицины Техасского университета (http: // Medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html). Клетки были названы BM-MSC wt, чтобы отличить от MSC, полученных от контрольных мышей (Tagln-cre + / Tsc1 + / + ), используемых в исследованиях трансгенного нокаута.
2.3. Проточный цитометрический анализ маркеров поверхности клеток, ассоциированных с Mmsc

Первичные изоляты BM были истощены по клеткам Lin путем отрицательной иммуномагнитной селекции с использованием набора для отбора биотина EasySep (Stem Cell Technologies, Кембридж, Массачусетс, США # 18556) в соответствии с инструкциями производителя. инструкции.Антитела к биотину, использованные для Lin-положительной селекции, были включены в панель происхождения биотин-конъюгированных мышей (# 559971 BD Pharmingen). Выделенные клетки суспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 2% FBS, и инкубировали с конъюгированными первичными антителами к маркерам клеточной поверхности, ассоциированным с МСК, в течение 30 минут при комнатной температуре. Несвязанные антитела удаляли промыванием. Клетки детектировали с помощью проточного цитометра LSRII FACSdiva (BD Biosciences). Используемые антитела: CD54 (FITC-конъюгированный крысиный IgG2b), CD105 (PE-конъюгированный крысиный IgG2a, k), CD73 (PE-конъюгированный крысиный IgG1) (все от eBioscience, Thermofisher, Уолтем, Массачусетс, США) и CD106 (Alexa 488-конъюгированный крысиный IgG2a, k) (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США).

2.4. Маркировка бромдезоксиуридином (BrdU)

Для анализа пролиферации клеток в компартменте BM in vivo 1 мг BrdU (BD Biosciences) вводили в объеме 100 мкл (10 мг / мл) контрольным мышам и мышам с мутантным Tsc1 посредством внутрибрюшинной инъекции 24 ч до умерщвления и извлечения BM. Окрашивание BrdU выполняли в соответствии с инструкциями производителя (FITC BrdU Flow Kit, BD Pharmingen # 557891). Вкратце, 10 6 выделенных МСК Lin фиксировали и повышали проницаемость в буфере BD Cytofix / Cytoperm в течение 30 мин на льду.После отмывки клетки ресуспендировали в буфере BD Cytoperm и инкубировали 10 мин на льду. После дополнительной промывки клетки повторно фиксировали в буфере BD и, наконец, обрабатывали ДНКазой для экспонирования включенного BrdU в течение 1 ч при 37 ° C. Затем клетки окрашивали антителом против BrdU в буфере BD Perm / Wash в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки, положительные по BrdU, выявляли с помощью проточного цитометра LSRII FACSdiva (BD Biosciences).

2.5. Анализ образования колоний (КОЕ-F)

Для анализов КОЕ-F, 0. 5 × 10 6 первичных изолятов клеток ВМ каждого генотипа высевали в 12-луночные планшеты в среде размножения mMSC на 9 дней со сменой среды каждые 3 дня. Для оценки колониеобразующего потенциала после размножения МСК повторно высевали при 10 и 50 клеток / см 2 . В конце клетки фиксировали 1% глутаровым альдегидом (Thermo Scientific) и окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым (Sigma). Количество колоний на лунку подсчитывали под фазово-контрастным микроскопом. Для каждого генотипа / группы лечения были выполнены измерения в трех повторностях.Чтобы оценить эффекты антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC) на образование колоний, первичные изоляты клеток BM культивировали, как указано выше, с добавлением 10 мМ NAC (Sigma-Aldrich) к среде размножения mMSC.

2.6. Анализ проточной цитометрии активных форм кислорода (ROS)

Для измерения накопления ROS в контрольных и мутантных МСК по Tsc1 клетки в монослойной культуре инкубировали с проницаемым для клеток 2 ‘, 7’-дихлордигидрофлуоресцеина диацетатом (DCF-DA, 10 мкМ). ) (Invitrogen) в течение 15 минут при 37 ° C после окрашивания антителом на маркеры MSC-ассоциированной клеточной поверхности (Lin , CD105 + ).Клетки трипсинизировали, промывали и анализировали проточной цитометрией. МСК с накоплением АФК идентифицировали с помощью стробирования зеленого (DCF-DA) и красного (CD105) каналов.

2.7. Гистопатология и иммуногистохимия мышей

Мышей умерщвляли через 28 дней или 1,5 года для сбора BM или обработки ткани. Образцы тканей фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером, обрабатывали градуированными спиртами и заливали парафином в соответствии со стандартными протоколами. Срезы (5 мкм) готовили для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) или обнаружения антител.Иммуногистохимия была проведена в соответствии со стандартной процедурой окрашивания авидин-биотиновой иммунопероксидазой. Срезы блокировали соответствующей сывороткой в ​​зависимости от первичного антитела (козий для кроличьего IgG и лошадь для мышиного IgG) и инкубировали с первичными антителами для p53 (CM5; Novocastra), pS6 (Cell Signaling Danvers, MA, США, # 9858). p16 (M-156; sc-1207) и p21 (C-19; sc-397G) (Санта-Крус). Диаминобензидин (DAB) использовали в качестве хромогена, а гематоксилин использовали для контрастирования ядер.

2,8. Окрашивание ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA β-G)
2.8.1. Окрашивание всего органа in situ
Окрашивание

SAβG выполняли на целых почках, выделенных от контрольных мышей и мышей с мутантным Tsc1, после умерщвления через 28 дней с использованием набора для окрашивания Senescence β-галактозидазой (Cell Signaling). Вкратце, целые почки фиксировали при комнатной температуре в течение 2 ч раствором, содержащим 2% формальдегида и 0,2% глутаральдегида в PBS, трижды промывали PBS и инкубировали в течение ночи при 37 ° C с окрашивающим раствором, содержащим X-gal. в NN-диметилформамиде (pH 6.0). Затем почки были обезвожены в два последовательных этапа в 50% и 70% этаноле и залиты парафином для серийного разделения. Срезы контрастировали эозином.

2.8.2. Культура клеток in vitro

BM-MSC, полученных из мутантных Tsc1 и контрольных мышей, высевали в 24-луночные планшеты (0,03 × 10 6 клеток / лунку) и культивировали в среде для роста MSC. После 36 дней культивирования клетки промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом в PBS в течение 15 минут и окрашивали окрашивающим раствором β-галактозидазы при pH 6.0, как описано выше. После инкубации в течение ночи при 37 ° C клетки анализировали на окрашивание в синий цвет под фазово-контрастным микроскопом.

2.9. Создание и трансдукция лентивирусного вектора shRNA

Конструкции, экспрессирующие лентивирусную shRNA, были созданы для стабильного нокдауна Tsc1 в BM-MSC дикого типа. Плазмиды экспрессии лентивируса с короткой шпилькой GIPZ (Dharmacon, Lafayette CO), кодирующие shTsc1 и не подавляющие сайленсирующий скремблированный (Scr) shRNA контроль, котрансфицировали в клетки 293T с упаковывающими плазмидами второго поколения pSPAX-2 (Addgene ID # 12260) и pMD2. .G (Addgene ID # 12259). Вирусные супернатанты собирали через 48 часов после трансфекции и использовали непосредственно для трансдукции МСК. Монослой МСК трансдуцировали 3 × вирусным супернатантом в последовательные дни в присутствии полибрена (8 мкг / мл) перед селекцией 1 мкг / мл пуромицина в течение 2 недель для удаления нетрансдуцированных клеток.

2.10. Вестерн-блот-анализ

Экстракты клеток из культур MSC, трансдуцированных Scr и shTsc1, лизировали с использованием буфера RIPA (Santa Cruz) с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз (Roche, Базель, Швейцария).Количественное определение белка проводили с использованием анализа Брэдфорда (Biorad), и 20 мкг образца лизата растворяли в 10% гелях Novex Tris-Glycine SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью iBlot (Invitrogen), блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в трис-буферном солевом растворе-Tween20 (0,1%) в течение 1 ч и инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичным антителом pS6 (Ser235 / 236) (Cell Signaling, # 4858) или GAPDH (Millipore, # ABS16). Мембраны промывали и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 30–60 минут перед проявлением с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico Plus (Thermo Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя.Мембраны сканировали с помощью Amersham Imager 680 в течение разного времени для оптимального анализа изображения.

2.11. Анализы дифференцировки МСК
2.11.1. Adipogenesis
ShRNA-трансдуцированные BM-MSC дикого типа высевали при 70% конфлюэнтности после отбора пуромицина и инкубировали в среде для индукции адипоцитов [27], состоящей из DMEM с добавлением 10% FBS, 0,25 мкМ дексаметазона, 10 мкг / мл инсулина и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) в течение 3 дней. Затем среду переводили на поддерживающую среду, DMEM с 10% FBS и 10 мкг / мл инсулина, на дополнительные 3 дня. Адипогенез оценивали с помощью количественной оценки маркеров адипоцитов на основе RT-qPCR и появления липидных капель, определяемых окрашиванием Oil Red O через 6 дней.
2.11.2. Миогенез гладких мышц (SM)
ShRNA-трансдуцированные МСК подвергали SM-дифференцировке путем инкубации с DMEM, содержащей 5% лошадиной сыворотки (HS) и 5 ​​нг / мл рекомбинантного человеческого TGF-β1 (R&D Systems), в течение 6 дней, как ранее сообщал Uezumi. и другие. [27]. Дифференцировку оценивали по положительной регуляции маркеров гладкой мускулатуры, количественно определяемой с помощью RT-qPCR, и по образованию удлиненных веретенообразных клеток, визуализированных с помощью фазово-контрастной микроскопии через 6 дней.
2.12. Экстракция РНК и ОТ-ПЦР
. Общую РНК экстрагировали из МСК, культивированных в течение 6 дней в среде для дифференцировки адипоцитов или SM с использованием Qiazol (Qiagen, Валенсия, Калифорния), а затем RNeasy Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США). кДНК синтезировали из 0,5 мкг общей РНК с использованием набора Taqman Assay (Applied Biosystems, Остин, Техас, США) и амплифицировали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием ген-специфических праймеров, созданных из последовательностей генов мыши (таблица 1) на BioRad iCycler ( BioRad, Геркулес, Калифорния, США) с использованием FastStart SYBR Green MasterMix (Roche).
2,13. Лечение эверолимусом

Эверолимус (RAD001; LC Labs) вводили внутрибрюшинно беременным самкам генотипов Tsc1 + / + , Tsc1 ∆ / + и Tsc1 ∆ / ∆ в течение последних 12 дней беременности ( 0,2 мкг / г / сутки). Лечение новорожденных продолжали ежедневно (2 мкг / г / день) до 28 дней до умерщвления. Для исследований МСК in vitro эверолимус добавляли в среду для роста МСК (20 нМ, конечная концентрация), меняя среду каждые 3 дня.

2.14. Статистический анализ

Статистическую значимость определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Общая выживаемость была проанализирована с помощью кривых Каплана-Мейера, а для определения различий в выживаемости использовался лог-ранговый тест (Мантел-Кокса). Статистическая значимость была определена как p <0,05. Односторонняя Anova использовалась для сравнения более чем 2 групп; Для сравнения временных точек использовались двусторонние t-критерии Стьюдента.

4. Обсуждение

Tsc1 является важным и специфическим негативным регулятором передачи сигналов mTOR, который контролирует клеточный рост, дифференцировку и энергетический ответ [39].Наши исследования показывают, посредством исследований делеции генов и нокдауна shRNA, что Tsc1 контролирует пролиферацию, самообновление и способность к дифференцировке пула MSC в BM. Для инактивации генов мы использовали Tagln-опосредованную рекомбинацию, которая, как было обнаружено, нацелена как на органы, содержащие гладкие мышцы, так и на негематопоэтический костный мозг, что подтверждает наши предыдущие наблюдения [31]. Полученный фенотип проявлял многие клинические проявления TSC, включая цистаденоматозные опухоли почек и гипертрофию сердца.Эти находки также воспроизводят патологии, ранее описанные для Tagln-обеспечиваемой инактивации Tsc1 [30], а также других генетических моделей, использующих подходы глобального или условного нокаута [24,40]. Гомозиготная инактивация Tsc1 также вызвала резкое увеличение смертности, что свидетельствует о возможной острой органной недостаточности. В то время как ожидаемая продолжительность жизни для клинических TSC неизвестна, почечные заболевания и опухоли головного мозга были определены как основные причины смертности в исследованиях пациентов [41,42]. У Tsc1-дефицитных мышей преждевременная смерть была связана с сердечной дисфункцией, однако окончательно это не определено [30].Мы также обнаружили, что системное введение эверолимуса, селективного ингибитора комплекса mTORC1, обращает вспять пролиферативный фенотип BM и повышенную клоногенность МСК, опосредованную потерей Tsc1, подтверждая ключевую роль конститутивной активации mTOR в поддержании пролиферации стволовых клеток in vivo. впервые демонстрируют фенотип BM-MSC после опосредованной Tagln инактивации Tsc1. Было обнаружено, что отсутствие Tsc1 индуцирует пролиферативную экспансию негематопоэтических клеток костного мозга (Lin , CD105 + CD106 + и CD73 + популяции клеток) и увеличивает колониеобразующий потенциал прикрепленной кости. клетки костного мозга, предполагающие повышенную способность МСК к самообновлению.Хотя ни один специфический маркер клеточной поверхности или комбинации не могут отличить мультипотентные МСК in vitro или in vivo, отсутствие гемопоэтических маркеров (Lin ) и экспрессия CD105 (эндоглина) и CD73 (экто-5-нуклеотидаза) являются частью минимальные критерии, рекомендованные Международным обществом клеточной терапии для определения МСК человека [37]. У мышей C57BL / 6J было обнаружено, что усиленная пролиферация и мультипотентность BM-MSC связана с субпопуляцией CD105 + [43] и экспрессией CD73 [44].Кроме того, CD106 (молекула адгезии сосудистых клеток-1) был идентифицирован как поверхностный маркер BM-MSC у людей [45] и мышей, хотя экспрессия варьирует среди инбредных штаммов [34]. С другой стороны, классические анализы образования колоний (КОЕ-F), первоначально описанные Friedenstein et al. [46,47] остаются широко используемым индикатором количества предшественников МСК, а частота КОЕ-F тесно связана со способностью к дифференцировке МСК [48]. Мы также показываем, что гиперпролиферативный фенотип МСК с дефицитом Tsc1 может воспроизводиться в клетках дикого типа с помощью shRNA-опосредованный нокдаун Tsc1.Однако, несмотря на их повышенную колониеобразующую способность, shTsc1-BM-MSCs демонстрируют сниженный адипогенез и миогенез гладких мышц in vitro, что указывает на нарушение клеточной дифференцировки. Эти наблюдения согласуются с инактивацией Tsc1 / Tsc2 в эмбриональных фибробластах мыши (MEFs), вызывающей гиперактивацию mTOR и ингибирование миогенной и адипогенной дифференцировки посредством передачи сигналов STAT3 / p63 / Notch [49]. Напротив, ингибирование mTOR с использованием рапамицина, как было показано, усиливает дифференцировку гладкомышечных клеток и ингибирует пролиферацию МСК посредством дифференциальной регуляции эффекторов PI3K, Akt2 и S6K [50,51].Недавние исследования целевой делеции Tsc1 также выявили нарушение дифференцировки остео- и хондро-клонов в результате гиперактивации mTOR. Удаление Tsc1 в мезенхимальных предшественниках с помощью Prx1-Cre выявило повышенную пролиферацию МСК и нарушение дифференцировки остеобластов, что привело к снижению минерализации и качества кости [52]. Сходным образом в развивающихся пластинах роста Col2-опосредованная абляция Tsc1 нарушает рост эндохондральной кости за счет увеличения пролиферации хондроцитов и нарушения гипертрофии и терминального созревания [53].Эти доклады, в сочетании с нашими собственными выводами, позволяют предположить, что MTOR гиперактивации, в результате потери TSC1, разобщает нормальные программы пролиферации и дифференцировки в мезенхимальных клеток-предшественников, что приводит к нарушению созревания терминала и неполноценного развития опорно-двигательного аппарата и гладкой мышечной tissues.Analysis из TSC1 ∆ / + у старых мышей выявила потерю гиперпролиферативного фенотипа в компартменте BM Lin и нарушение способности CFU-F по сравнению с контролем, что свидетельствует об истощении стволовых клеток после длительного подавления Tsc1.Сообщалось о параллельных наблюдениях в HSCs после соматической делеции Tsc1, где было обнаружено, что дефицит Tsc1 способствует кратковременному увеличению (1-3 дня) с последующим долгосрочным истощением (> 10 дней) пула BM-HSC и потерей репопуляционного потенциала [9]. В МСК о прямом влиянии Tsc1 на старение не сообщалось; однако глобальное профилирование транскрипции клеток Lin / CD34 / CD31 ВМ, выделенных от молодых и пожилых женщин, выявило значительную регуляцию пути mTOR [54].Аналогичным образом было показано, что старение МСК in vitro ослабляется за счет ингибирования передачи сигналов PI3K / Akt / mTOR, что приводит к поддержанию клоногенной способности и высокой скорости пролиферации после длительного культивирования [55]. Инактивация Tsc1 в культивируемых МСК также приводит к к накоплению АФК и усиленному старению, что согласуется с преждевременным старением клеток [56]. В HSCs потеря функции после инактивации Tsc1 объясняется накоплением ROS и началом старения и может быть отменена обработкой рапамицином или антагонизмом ROS [8,57].Мы предполагаем, что длительная гиперактивация mTOR аналогичным образом вызывает преждевременное старение МСК после опосредованной Tagln инактивации Tsc1. В соответствии с этой гипотезой иммуноокрашивание кист почек, которые, как было установлено, демонстрируют пролиферацию канальцев после потери Tsc1, выявило повышенные уровни маркеров, связанных с клеточным старением (p16, p53 и p21), что указывает на сопутствующее усиление антипролиферативных механизмов. Интересно, что в то время как потеря 1 или обоих аллелей Tsc1 увеличивала уровни SA β-gal, значительное окрашивание p16 наблюдалось только у гетерозиготных мышей, предполагая, что повышенная регуляция этого опухолевого супрессора ингибировалась в ответ на гомозиготную делецию Tsc1.Интересно, что делеции Tsc1 было недостаточно, чтобы вызвать трансформацию, поскольку ни у Tsc1 ∆ / ∆ (в возрасте 28 дней), ни у Tsc1 ∆ / + (1,5 года) во время умерщвления не развивались злокачественные опухоли, что соответствует преимущественно доброкачественный неопластический рост, характерный для TSC человека. Это может быть связано с активацией p53 после гетерозиготной или гомозиготной делеции Tsc1, которая может повышать чувствительность клеток к клеточному стрессу в ответ на активацию mTOR [58].

B&M продает детские бассейны

Если вы хотите, чтобы дети развлекались в саду, B&M продает ряд детских бассейнов по цене от 8 фунтов стерлингов.

Самый дешевый, который мы нашли, начинался с 7,99 фунтов стерлингов за затененный детский бассейн и до 30 фунтов стерлингов за двухметровый вариант.

6

Наш лучший выбор из ассортимента детских бассейнов B&M

К сожалению, вы не можете сделать заказ на веб-сайте B&M, поэтому вам нужно посетить ближайший магазин, чтобы его забрать.

У B&M 600 магазинов в Великобритании — воспользуйтесь функцией поиска интернет-магазинов, чтобы найти ближайший к вам.

Стоит отметить, что действующие правительственные правила гласят, что вам следует посещать ближайший магазин только за предметами первой необходимости.

Это означает, что вам следует выбирать бассейн только как часть вашего основного магазина.

Как всегда, не забывайте делать покупки поблизости, чтобы убедиться, что вы получаете лучшее соотношение цены и качества.

Вот наши лучшие выборы из коллекции B&M.

Детский затененный детский бассейн

6

B&M утверждает, что этот бассейн идеально подходит для охлаждения вашего ребенка в жаркую погоду.

Этот детский бассейн имеет мягкое основание, на котором ваш ребенок может сидеть, и регулируемый солнцезащитный козырек для защиты от солнца.

Он бывает двух цветов, синего и розового, а его размеры в надутом состоянии составляют 135 см на 114 см на 76 см.

Когда мы проверили онлайн, самый дешевый детский бассейн с навесом, который мы смогли найти, стоил 7,98 фунтов стерлингов плюс доставка 3,49 фунтов стерлингов — всего 11,47 фунтов стерлингов — от Ebuyer.

Детский бассейн космического корабля

6

В этом бассейне можно комфортно разместить двух или трех детей.

Его называют бассейном космического корабля, потому что его форма и серебристый цвет почти делают его похожим на НЛО.

Размеры этого бассейна в надутом состоянии 157 см на 157 см на 40 см.

Мы нашли тот же самый пул за 11,99 фунтов стерлингов на Charlies, но вам нужно будет заплатить за доставку 4,50 фунтов стерлингов сверху, в результате чего общая стоимость составит 16,49 фунтов стерлингов.

Тропический детский бассейн

6

Этот бассейн украшен красочными изображениями фруктов.

Этот бассейн идеально подходит для летних погодных условий. Этот бассейн имеет симпатичный фруктовый дизайн с изображениями ананасов и апельсинов по бокам.

Его размеры в надутом состоянии 149 на 53 см.

Тот же пул на eBay стоит 18 фунтов плюс доставка 4 фунта, итого 22 фунта стерлингов.

Детский бассейн с аквариумом

6

Один из самых дорогих вариантов, но в нем есть классная горка для игры на

. Этот супер-крутой бассейн в тематике аквариума оснащен горкой, на которой можно играть, и надувной пальмой, которая брызгает водой.

К сожалению, на сайте B&M нет данных о размерах.

Мы запросили у продавца дополнительную информацию, в том числе, есть ли в бассейне все надувные животные, показанные на картинке выше.

В другом месте детский бассейн с горкой обойдется вам в 29 фунтов стерлингов — например, этот от Just Athlete, который также стоит 6 фунтов стерлингов.81 для доставки, в результате чего общая сумма составляет 35,81 фунта стерлингов.

Надувной садовый бассейн Bestway

6

Один из самых больших детских бассейнов в линейке B&M.

В этом бассейне Bestway есть удобные сиденья внутри, чтобы вы и ваши дети могли расслабиться, сохраняя прохладу.

Его размеры 213 см на 206 см на 69 см, поэтому он один из самых больших в этой коллекции.

Тот же самый пул Bestway стоит 31,87 фунтов стерлингов плюс 16,66 фунтов стерлингов за доставку — общая цена 48,53 фунтов стерлингов — от Brycus.

ALE RIGHT! Обнародовано время работы паба

на 12 апреля, включая Wetherspoons и Greene King.

НАЛИЧИЕ

Беспошлинный уход за детьми: как войти в учетную запись и кто может подать заявку?

ВЕРНУТЬСЯ В БИЗНЕС

Когда B&Q работает сегодня? Часы работы и нажмите и получите совет

КРЕДИТ ЭТО

Универсальный кредитный логин: Как войти в мою учетную запись и каковы преимущества

Мор того же

Когда Моррисон открыт сегодня? Варианты доставки и нажмите и получите совет

КАЖДЫЙ LIDL ПОМОГАЕТ

Во сколько сегодня открывается Lidl? Часы работы и совет по доставке по Великобритании

Если вы ищете джакузи, у B&M они есть в магазинах по цене от 250 фунтов стерлингов.

B&M также продает лежаки для собак с навесом.

B&M объявила в прошлом месяце, что временно закрывает 49 магазинов, несмотря на то, что им разрешили оставаться открытыми во время кризиса с коронавирусом.

ФОРМЫ

: заявки, регистрация, отчетность и т. Д.

Бюро качества воздуха

Пожалуйста, посетите страницу разрешающих контактов.

Разрешение на воздух — Заявка на строительство

Для получения дополнительной информации о разрешениях на строительство, пожалуйста, посетите страницу разрешений на строительство с качеством воздуха.

Air Permitting — Заявления на получение разрешения на регистрацию

Для получения более подробной информации о разрешениях на регистрацию посетите веб-сайты, посвященные общему контролю качества воздуха и разрешениям на регистрацию.

Air Permitting — Общие заявки на разрешение для асфальтовых и бетонных заводов

Для получения более подробной информации об общих разрешениях посетите веб-сайты, посвященные общему контролю качества воздуха и разрешениям на регистрацию.

Разрешение на воздух — Уведомление (для использования всеми разрешенными источниками)

За более подробной информацией об этих формах обращайтесь к Филлис Коупленд по телефону (803) 898-0415 или к Джеку Портеру по телефону (803) 898-3829.

Air Permitting — Заявки на разрешение на эксплуатацию

Название формы Форма DHEC №
Запрос разрешения на эксплуатацию — Используется для запроса разрешения на эксплуатацию, для изменения существующего разрешения на эксплуатацию, для уведомления BAQ о первоначальном запуске оборудования и для подтверждения того, что строительство было выполнено в соответствии с выданным разрешением на строительство. Эту форму можно использовать на предприятии по Разделу V для запроса разрешения на работу в соответствии с Регламентом 61-62 SC. 1 до выдачи разрешения по Разделу V. Д-2574
Заявление на продление государственного или условного основного разрешения на эксплуатацию — для использования предприятиями, запрашивающими продление своего государственного или условного основного разрешения на работу. Д-2955

Заявление о Разделе V (новое и продленное)

Название формы Форма DHEC №
Информация об объекте — Общая информация, необходимая для идентификации заявителя. Д-2937
Блок выбросов, оборудование и процессы — Используется для связывания всего оборудования на предприятии с соответствующими блоками выбросов, контрольным оборудованием и информацией о процессе. Д-2940
Сырье и продукция для всего предприятия — для использования при перечислении всей информации о сырье, продуктах и ​​производстве на предприятии. Д-2942
Выбросы в масштабах всего предприятия — Для использования при перечислении всей информации о выбросах в масштабах всего предприятия. Д-2943
Оборудование для незначительной деятельности — Для использования при перечислении всей информации об оборудовании для незначительной деятельности на объекте. Список незначительных мероприятий, утвержденный Южной Каролиной, можно найти здесь или связавшись с BAQ. Д-2944
Нормативная информация — Для использования при выявлении и перечислении всех ограничений и требований федеральных и государственных нормативных актов и разрешений на строительство, связанных с каждым блоком выбросов. Д-2946
Permit Shield — Для использования при запросе разрешительного экрана в соответствии с Положением 61-62.70 S.C. Д-2948
2013 г. Изменения к формам заявок по Разделу V: вопросы и ответы (pdf) — Этот документ был разработан, чтобы ответить на вопросы, поднятые техническим персоналом по выдаче разрешений, представителями отрасли и консультантами относительно форм заявки по Разделу V. ——

Название V Модификация

Название формы Форма DHEC №
Minor Permit Modification — Для использования при изменении Разрешения на эксплуатацию Раздела V посредством Незначительной модификации. Д-2949
502 (b) (10) Permit Change — для использования при запросе изменения 502 (b) (10) в соответствии с федеральными и государственными постановлениями. Д-2950
Назначенное ответственное должностное лицо (RO) — Для использования источниками Раздела V для добавления дополнительных назначенных RO, для удаления RO или для изменения любых текущих RO. Д-2951
Поправка к административному разрешению — для использования при изменении Разрешения на эксплуатацию Раздела V посредством административной поправки.(например, исправление типографских ошибок, более частый мониторинг, ведение документации или требований к отчетности, а также изменения, содержащие только требования или стандарты). Д-2938
Значительные изменения ——

Для получения дополнительной информации о разрешениях на эксплуатацию посетите веб-сайт разрешений на качество воздуха.

Раздел V Ежегодная сертификация соответствия (TVACC)

Для получения дополнительной информации или вопросов о наших формах посетите веб-сайт Compliance Reporting или свяжитесь с Dawn Jordan по телефону (803) 898-4075.

Асбест — бланки заявок на снос и ремонт

Для получения более подробной информации о формах асбеста посетите страницу ресурсов по асбесту или свяжитесь с Дженнифер Борик по телефону (803) 898-2634.

Асбест — Формы разрешений на удаление

Для получения более подробной информации о формах асбеста посетите страницу ресурсов по асбесту или свяжитесь с Дженнифер Борик по телефону (803) 898-2634.

Асбест — бланки лицензии на борьбу с выбросами

Для получения более подробной информации о формах асбеста посетите страницу ресурсов по асбесту или свяжитесь с Дженнифер Борик по телефону (803) 898-2634.

Асбест — Обучение

Инвентаризация выбросов

Название формы Форма DHEC №
Отчет об источниках данных по точкам инвентаризации выбросов — DHEC разработал и теперь требует, чтобы кадастры выбросов были выполнены и представлены с использованием SLEIS. Использование этой формы для отчета об инвентаризации выбросов разрешено только по запросу или с письменного разрешения Секции инвентаризации выбросов Бюро качества воздуха DHEC. Д-1904
Соглашение об электронной подписи — Эта форма должна быть отправлена, чтобы разрешить доступ для ввода данных в систему электронной инвентаризации DHEC, SLEIS. Все лица, которые должны вводить данные в систему, должны быть указаны в форме. Он должен быть подписан ответственным должностным лицом на предприятии и отправлен по почте руководителю Секции инвентаризации выбросов. D-1040

Для получения более подробной информации о выполнении инвентаризации выбросов или сводке выбросов HAP посетите веб-сайт инвентаризации выбросов или свяжитесь с Чадом Уилбанксом по телефону (803) 898-4106.

Зоны, недоступные для приземного озона: требования к отчетности

Для получения более подробной информации о форме отчета о выбросах посетите веб-сайт «Требования к отчетности для приземных зон недостижения озона» или свяжитесь с Чадом Уилбанксом по телефону (803) 898-4106.

Максимально достижимая технология управления (MACT)

Название формы Форма DHEC №
Текущий отчет о соответствии, Подчасть N — 40 CFR Часть 63, Подчасть N: Национальные стандарты выбросов хрома из емкостей для твердого и декоративного хромового гальванического покрытия и анодирования хрома Д-2909

Мониторинг и отчетность

Следующие формы были созданы, чтобы помочь предприятиям с отчетностью, требуемой разрешениями на строительство или эксплуатацию. Использование этих форм не является обязательным. Эти формы предназначены только для ознакомления и могут быть применимы не ко всем объектам. Некоторые формы требуют манипуляций, чтобы электронные таблицы представляли материалы, используемые на вашем предприятии.

Для получения дополнительной информации или вопросов о наших формах посетите веб-сайт отчетности о соответствии или свяжитесь с Dawn Jordan по телефону (803) 898-4075.

Оценка источника / тестирование стека

Название формы Форма DHEC №
План испытаний для конкретного места / Контрольный список для окончательного отчета — Перед проведением испытания источника в соответствии с Правилами 61-62.1 Раздел IV, владелец или оператор должны предоставить план тестирования для конкретного объекта, в котором подробно описаны все методы тестирования источника, которые будут использоваться на разрешенном объекте. ——

Для получения дополнительной информации об оценке источника обращайтесь к Майклу Верзвивельту по телефону (803) 898-1789.

Бюро служб гигиены окружающей среды

Безопасность пищевых продуктов

Бюро служб гигиены окружающей среды, Отдел защиты пищевых продуктов — Телефон: (803) 896-0640 Факс: (803) 896-0645.

Септики

Бюро служб гигиены окружающей среды, Отдел управления сточными водами на территории — Телефон: (803) 896-0640 Факс: (803) 896-0645.

Лаборатория

Бюро служб гигиены окружающей среды, Управление лабораторной сертификации — телефон: (803) 896-0970 Факс: (803) 896-0850.

Лицензирование медицинских учреждений

Лицензирование медицинских учреждений

За дополнительной информацией обращайтесь: Директор отдела Гвендолин Томпсон — (803) 545-4370

Бюро по управлению земельными ресурсами и отходами

Скважины для мониторинга подземных вод

Для получения дополнительной информации или вопросов о скважинах для мониторинга подземных вод, пожалуйста, свяжитесь с Робертом Коулом по телефону (803) -898-0802

Химчистка

Для получения дополнительной информации или вопросов о наших формах для химической чистки, пожалуйста, свяжитесь с Робертом Ходжесом по телефону (803) -898-0919.

Производители электроники

Название формы Форма DHEC №
Регистрация производителя закрытых электронных устройств (D-2425) D-2425

Опасные отходы

Название формы Форма DHEC №
Заявление на разрешение на перевозку опасных отходов — Заявление на разрешение на перевозку опасных отходов ——
Форма уведомления о регулируемой деятельности с отходами — Форма уведомления и отчетности используется компаниями, которые требуются в соответствии с Положениями об обращении с опасными отходами Южной Каролины, 6I-79.262.13, 263.13, 264.5 и 265.5, чтобы уведомить Департамент здравоохранения и контроля окружающей среды Южной Каролины (SCDHEC) о том, что они участвуют в деятельности по обращению с опасными отходами. SCDHEC отвечает за присвоение идентификационного номера Агентства по охране окружающей среды (EPA ID #). ——
Квартальные отчетные коды по опасным отходам — ​​коды форм, коды методов управления, исходные коды и коды минимизации отходов ——
Квартальный отчет об опасных отходах — образование и обработка, хранение, утилизация и восстановление на месте (инструкции) — «Создание и на месте T, S, D, R» — Эта форма используется для отчета о количестве IN ФУНТЫ опасных отходов, образовавшихся за квартал.Любые отходы, образовавшиеся на месте, а затем обработанные, хранящиеся (накапливаемые), утилизированные (на месте) или восстановленные, должны быть указаны в этой форме. Для упомянутых здесь действий по обработке, удалению и рекуперации может потребоваться либо наличие в настоящее время промежуточного статуса, либо получение разрешения на размещение опасных отходов от S.C. DHEC. Производителям больших объемов разрешается без разрешения хранить (накапливать) опасные отходы менее 90 дней. Идентификационный номер EPA и имена всех первоначальных перевозчиков, которые перевозили для вас опасные отходы в течение этого квартала. D-1962
Квартальный отчет об опасных отходах — Отходы, отправленные за пределы площадки для обработки, хранения, утилизации и восстановления (инструкции) — «Отходы, отправленные за пределы площадки для T, S, D, R» — Эта форма представляет собой журнал проявленных перевозки опасных отходов за квартал. D-1963
Квартальный отчет об опасных отходах — Отчет о внешнем объекте (инструкции) — «Отчет о внешнем предприятии» — Эта форма должна заполняться только теми компаниями, которые принимают опасные отходы, которые были произведены другими компаниями для этой цели обработки, хранения, утилизации и / или восстановления. Для упомянутых здесь операций по обработке, хранению, удалению и рекуперации необходимо либо иметь в настоящее время Промежуточный статус, либо получить Разрешение на размещение опасных отходов от S.C. D-1964
Индекс опасных отходов (инструкции) — «Индекс опасных отходов» — эта форма используется для создания индекса всех потоков опасных отходов, создаваемых компанией. Когда образуется новый поток отходов, эта форма должна быть заполнена и отправлена ​​вместе с остальными формами квартального отчета.Пожалуйста, не повторяйте старую информацию о потоках отходов. Эту форму никогда не обязаны заполнять те компании, которые подают Годовую декларацию. D-1965

Для получения дополнительной информации или вопросов о регулируемой деятельности с отходами, перевозчиках опасных отходов и формах отчетности об опасных отходах, пожалуйста, свяжитесь с Кайрой Грэм по телефону (803) 898-1315.

Инфекционные отходы

Для получения дополнительной информации или вопросов о формах отчетности об инфекционных отходах, пожалуйста, свяжитесь с Ким Клиберн по телефону (803) 898-0239.

Горное дело

Название формы Форма DHEC №
MR-200: Заявка на получение сертификата разведки (сбор в размере 300 долларов США) — Заявление на получение сертификата разведки (плата за разведку 300 долларов США) Д-3100
MR-300: План рекультивации для разведки — План рекультивации для разведки Д-3101
MR-400GP1: Уведомление о намерении получить покрытие в рамках общего разрешения на эксплуатацию рудника (с инструкциями) (плата в размере 600 долларов США) — щелкните здесь, если объект находится в Бофорте, Беркли, Чарльстоне, Коллтоне, Дорчестере, Джорджтауне, Хорри или Джаспере графства.
Щелкните здесь для получения разрешения / плана рекультивации GP1.
Для всех рудников требуется разрешение NPDES .
Д-3114
MR-400: Заявление на получение разрешения на эксплуатацию рудника (плата в размере 600 долларов США) — щелкните здесь, если объект расположен в округах Бофорт, Беркли, Чарлстон, Коллетон, Дорчестер, Джорджтаун, Хорри или Джаспер.
Щелкните здесь, чтобы получить информацию о добыче полезных ископаемых в водоемах
Д-3102
MR-500: План рекультивации для отдельного разрешения на эксплуатацию шахты — План рекультивации для разрешения на эксплуатацию отдельной шахты Д-3103
MR-600: Соглашение о вступлении в землю для земель, принадлежащих оператору шахты — Соглашение о входе на землю для земель, принадлежащих оператору шахты Д-3104
MR-700: Договор ввода земли для земли, арендуемой оператором шахты — Договор ввода земли для земли, арендуемой оператором шахты Д-3105
MR-800: Форма возвратного залога для внесения залога — Форма возвратного залога для размещения залога Д-3106
MR-900: Форма возвратного залога для размещения залога, отличного от поручительства — Форма возвратного залога для размещения залога, отличного от залога Д-3107
MR-1000: Присвоение — Присвоение привязки к восстановлению Д-3108
MR-1050: Безотзывный аккредитив — Безотзывный аккредитив Д-3109
MR-1100: Ежегодный отчет о рекультивации должен быть предоставлен вместе с 375 долларами. 00 годовой сбор — Ежегодный операционный сбор за добычу за рудник Д-3110
MR-1300: Заявление на изменение разрешения на эксплуатацию шахты и / или плана рекультивации — Заявление на изменение разрешения на эксплуатацию шахты и / или плана рекультивации Д-3111
MR-1400: Соглашение о передаче разрешения на эксплуатацию рудника (плата в размере 600 долларов США) — Соглашение о передаче разрешения на эксплуатацию рудника Д-3112

Для получения дополнительной информации или вопросов о Mining Forms, пожалуйста, свяжитесь с Венди Гамильтон по телефону (803) 898-1368.

Радиоактивные отходы

Для получения дополнительной информации или вопросов о формах радиоактивных отходов обращайтесь к Ким Клайберн по телефону (803) 898-0239.

Соответствие твердых отходов

Для получения дополнительной информации или вопросов об отработанных шинах, свинцово-кислотных аккумуляторах или формах отработанного масла, пожалуйста, свяжитесь с Джессикой Прайс по телефону (803) 898-0461

Разрешение на твердые отходы

Для получения дополнительной информации или вопросов о разрешении на удаление твердых отходов обращайтесь к Джастину Куну по телефону (803) 898-1339

Подземные резервуары для хранения — Раздел

оценки и корректирующих действий

Для получения дополнительной информации или вопросов о наших формах оценки и корректирующих действий UST звоните по телефону (803) 898-2544

Подземные резервуары для хранения

— Раздел

о соответствии нормативным требованиям

Чтобы получить дополнительную информацию или задать вопросы о наших формах соответствия нормативным требованиям UST, позвоните по телефону (803) 898-0589.

Оценка отходов

Для получения дополнительной информации или вопросов о формах оценки отходов обращайтесь к Джеффу Шрагу по телефону (803) 898-898-4326.

Управление ресурсами океана и прибрежных районов

Разрешение на критические зоны — формы

Согласованность прибрежной зоны для федеральных разрешений и разрешений штата — формы

Название формы Форма DHEC №
Форма запроса согласованности прибрежной зоны штата — для запроса проверки соответствия прибрежной зоны заявлений на получение разрешения штата для проектов или мероприятий в прибрежной зоне Южного Кавказа (Джаспер, Бофорт, Коллетон, Чарльстон, Дорчестер, Беркли, Джорджтаун, Хорри ). D-0478

Контрольные списки групп политик для согласованности прибрежной зоны
Следующие контрольные списки политик были созданы для помощи в определении политик управления прибрежными районами, которые применимы к предлагаемым проектам или деятельности в прибрежной зоне SC. Может применяться более одного контрольного списка политик. Все применимые контрольные списки политики должны быть отправлены вместе с формой запроса согласованности прибрежной зоны штата

.
D-0479
Д-0480
  • Coastal Industries — для сельского хозяйства, лесного хозяйства, добычи полезных ископаемых (горнодобывающая промышленность), производства, переработки рыбы и морепродуктов и аквакультуры
D-0481
D-0482
D-0484
D-0485
D-0486
  • Дноуглубительные работы — для проектов дноуглубительных работ, удаления грунтовых материалов и подводной утилизации
D-0487
  • Коммунальные услуги и сооружения — для очистных сооружений, проектов по удалению твердых отходов, общественных / квазигосударственных зданий, плотин и резервуаров, а также проектов водоснабжения
D-0483
  • Борьба с эрозией — для морских дамб, переборок, ограждений, расходования государственных средств на борьбу с эрозией и управление песчаными дюнами за пределами критических зон
D-0488
D-0489
Д-0490
  • Управление ливневыми водами — для проектов, нарушающих почву, и стока с полей для гольфа, шахт и свалок.
D-0491
D-0492

Форма сертификата соответствия общей прибрежной зоны (GCZC) — для запроса сертификата соответствия прибрежной зоны для конкретных видов деятельности, которые предполагают минимальное воздействие.

Для получения полной информации см. Список отдельных GCZC.

D-0352

Водное бюро

Сельскохозяйственные объекты

Чак ​​Уильямс, руководитель отдела — (803) 898-3112

Плотины

Джон Маккейн — (803) 898-8178

Питьевая вода

Бриджит Кларк — (803) 898-4239 (линии)
Бренда Грин — (803) 898-4228 (Бытовые / муниципальные / предварительная обработка)
Crystal Rippy — (803) 898-3964 (Промышленные устройства прямой разрядки)

Мониторинг подземных вод

Название формы Форма DHEC №
Приложение для мониторинга скважин — Используйте для запроса разрешения от DHEC на установку скважин для мониторинга подземных вод на участке, имеющем отношение к разрешениям на сточные воды или сельское хозяйство Д-3736
Отчет о мониторинге подземных вод — используется для передачи данных мониторинга подземных вод в DHEC, если такие данные требуются в соответствии с разрешением на сточные воды или сельское хозяйство. Д-2110

Дасти Лейпольдт — (803) 898-4312

(Подземные воды) Контроль подземного нагнетания

Брюс Кроуфорд — (803) 898-4177

Использование подземных вод и потенциал использования

Алекс Батлер — (803) 898-3575
Джош Зодареки — (803) 898-3559

Судоходные воды

Чак ​​Хайтауэр — (803) 898-0369
Хизер Престон — (803) 898-3105

Пестициды — NPDES

Шон Кларк — (803) 898-3544

Частный колодец

Грег Витикомб — (803) 898-3232

Рекреационные воды

Люк Абель — (803) 898-4255

Государственный оборотный фонд

Линн И. Ласаль — (803) 898-4395
Чарльз Горман — (803) 898-3993

Ливневые воды — NPDES

Исайя Гловер — (803) 898-4005

Сточные воды — соответствие

Дейл Стаудемайр — (803) 898-4209

Сточные воды — Строительство

Бриджит Кларк — (803) 898-4239 (линии)
Бренда Грин — (803) 898-4228 (Услуги)

Сточные воды — Разрешения ND

Бренда Грин — (803) 898-4228 (внутренний)
Кристал Риппи — (803) 898-3964 (промышленный)
Управление водных ресурсов — Телефон: (803) 898-4300 Факс: (803) 898-3795.

Сточные воды — NPDES

Название формы Форма DHEC №
Уведомление о намерениях (NOI) — Сбросы, связанные с гидроэлектростанциями — Общее разрешение NPDES № SCG360000 Д-2239
Уведомление о намерениях (NOI) — Станции очистки питьевой воды (SCG646000) — Общие разрешения на сбросы из систем очистки воды Д-1813
Уведомление о намерениях (NOI) — Общее разрешение NPDES на сбросы с объектов наливной нефти SCG340000 — Общие разрешения на сбросы, связанные с объектами наливной нефти Д-2624
Уведомление о намерениях (NOI) — Сбросы, связанные с предприятиями по добыче неметаллических полезных ископаемых — Общее разрешение NPDES № SCG730000 — Общее разрешение на добычу полезных ископаемых, не связанных с металлами (e.г., песчано-гравийная добыча) Д-3559
Уведомление о намерениях (NOI) — Вода для гидростатических испытаний: сбросы из новых и бывших в употреблении нефтегазовых трубопроводов и резервуаров — Общее разрешение NPDES № SCG670000 — Общие разрешения на проведение испытаний для этих трубопроводов и резервуаров D-3729
Уведомление о намерениях (NOI) — Сбросы в хозяйственные воды — Общее разрешение NPDES № SCG250000 — Общие разрешения на различные сбросы в хозяйственные воды в пределах определенного порогового значения Д-3632
Уведомление о намерениях (NOI) — Вода для мойки транспортных средств: сбросы из сливных вод для мойки транспортных средств — Общее разрешение NPDES № SCG750000 D-3756

Форма заявки 1 NPDES — Общая информация — Это Форма заявки EPA 1. Он содержит общую информацию о заявителе и учреждении. Эта форма должна сопровождать заявку на разрешение NPDES

.
EPA 3510

Форма заявки NPDES 2C — Информация о сбросе сточных вод — Форма 2C EPA используется существующими промышленными предприятиями при повторной подаче заявки на разрешение NPDES. Инструкции включены. Эта форма должна сопровождаться Формой 1 EPA, Приложением к местоположению и Приложением к осадку.
Дополнение к локациям для разрешений NPDES и ND
Дополнение к удалению осадка для NPDES и ND разрешений
Дополнение к зонам смешивания

EPA 3510-2C

Форма заявки NPDES 2D — Новые сбросы и новые источники: Заявка на сброс технологических сточных вод — Форма 2D EPA используется промышленными предприятиями при подаче заявки на новые сбросы или новые источники.Инструкции включены. К этой форме должны быть приложены Форма 1 EPA, Приложение Antidegradation, Приложение Location и Приложение Sludge.
Дополнение к локациям для разрешений NPDES и ND
Дополнение к удалению осадка для NPDES и ND разрешений
Дополнение к зонам смешивания

EPA 3510-2D

Форма заявки NPDES 2E — Сооружения, которые не сбрасывают технологические сточные воды — Форма 2E EPA используется предприятиями, которые не сбрасывают технологические сточные воды.Инструкции включены. Эта форма должна сопровождаться Формой 1 EPA, Приложением по местоположению и Приложением по осадку.
Дополнение к локациям для разрешений NPDES и ND
Дополнение к удалению осадка для NPDES и ND разрешений
Дополнение к зонам смешивания

EPA 3510-2E
Приложение для защиты от деградации для заявок на разрешение NPDES — Дополнение для защиты от деградации необходимо подавать, когда заявка NPDES предназначена для новой или расширяющейся разрядки (включая новые / увеличенные нагрузки). Д-3590

Форма заявки NPDES 2A — Новые и существующие государственные очистные сооружения — Форма 2A EPA используется муниципальными учреждениями при подаче заявки на новые сбросы или новые источники.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.