Фитнес манго: «Манго Фитнес» — Сеть фитнес клубов в Москве (Кожухово, Новогиреево, Ивановское)

Белок 30 г 60%

* Процент дневной нормы основан на диете в 2000 калорий.

Маринованный красный лук

Ингредиенты

• 1/2 среднего красного лука, нарезанный (100 г)
• 1 стакан воды (8 унций)
• 1/2 стакана яблочного уксуса (4 унции)
• 2 столовые ложки сахара (24 грамма)
• 2 чайные ложки соли (10 граммов)

Инструкции

1. Разогрейте воду в микроволновой печи почти до кипения, примерно 1-2 минуты.

2. Добавьте сахар и соль в горячую воду и перемешайте до полного растворения.Добавьте яблочный уксус и перемешайте.

3. Положите ломтики лука в закрывающуюся стеклянную банку и полейте маринованной жидкостью, пока лук не покроется жидкостью.

4. Охладите не менее 3 часов или на ночь перед подачей на стол.

Лосось на гриле с имбирем, рисом, манго и огурцом Эдамаме

Питание: Обед или ужин
Тип питания: Всеядное животное
Время приготовления: 15 минут
Время приготовления: 35 минут
Количество порций: 4

Блюдо
Красивое, легкое и летнее блюдо из морепродуктов, идеально подходящее для солнечного ужина или обеда.Комбинации вкусов поражают все высокие ноты: сладкое тропическое манго, пряный острый имбирь, пикантный соевый соус и терпкий апельсиновый сок.

Маринад и заправка работают в тандеме, ароматизируя салат эдамаме из огурцов, а также лосось перед приготовлением на гриле (если приготовление на гриле не подходит, можете обжарить лосось или обжарить его на сковороде).

Для тех, кто любит готовиться заранее, маринад можно приготовить и хранить в холодильнике до недели. Рис тоже довольно вкусный холодный, как альтернативный вариант обеда.

Состав

Маринад и заправка
1/4 стакана (59 мл) апельсинового сока
2 столовые ложки (30 мл) рисового уксуса
2 столовые ложки (30 мл) меда
2 столовые ложки (30 мл) оливкового масла
1 столовая ложка (15 мл) кунжутного масла
1 столовая ложка (15 мл) соевого соуса тамари или кокосовых аминокислот
2 чайные ложки (6 г) поджаренных семян кунжута

Блюдо
1 фунт.(450г) филе лосося
1/2 стакана коричневого риса с жасмином
1 стакан воды или бульона
1 чашка (100 г) манго, очищенного и нарезанного кубиками
1/2 столовой ложки (7 г) свежего очищенного и измельченного имбиря

Салат
1 чашка (150 г) огурца, нарезанного дольками
1 стакан (160 г) замороженных очищенных от скорлупы эдамаме, размороженных

Препарат

• В большой миске взбейте все ингредиенты маринада (апельсиновый сок, уксус, мед, оливковое масло, кунжутное масло, соевый соус и семена кунжута) до однородной консистенции.Разделите заправку на две миски.
• Положите филе лосося в форму для запекания с плоским дном или пакет на молнии и залейте половиной маринада. Поставьте в холодильник на 30 минут (максимум на 1 час).
• Пока лосось мариновается, разогрейте гриль до средне-сильного разогрева.
• Смешайте рис, бульон, манго и имбирь в небольшой кастрюле и накройте крышкой. Доведите до кипения на среднем или сильном огне; после закипания уменьшите огонь до средне-слабого и варите 15-20 минут или пока рис не станет мягким.Взбить вилкой и держать в тепле до подачи на стол.
• Вынуть лосось из маринада и промокнуть его бумажным полотенцем. Слегка смажьте лосось небольшим количеством оливкового масла, выложите его на решетку и готовьте по 3-4 минуты с каждой стороны или до готовности и готовности.
• Пока лосось готовится, добавьте огурцы и эдамаме в оставшуюся заправку.
• Для подачи разложите рис ложкой по тарелкам и сверху выложите лосось и салат. Сбрызните оставшейся заправкой.

Вегетарианские и веганские модификации: Тофу — отличный заменитель лосося, маринуйте аналогично и готовьте по 2-3 минуты с каждой стороны. И поменяйте мед на агаву, чтобы стать веганом!

Без глютена Модификации: N / A

7NRG CBD Энергетический коктейль с манго и ананасом перед тренировкой

7NRG Энергетический коктейль перед тренировкой с манго и ананасом, 12 мг CBD — 12 шт. В коробке

12MG, 9 жидких унций — Коробка из 12 (всего КБР 144MG)

Все мы обладаем активной эндоканнабиноидной системой по всему нашему телу, которая способствует равновесию и физиологическому здоровью.Однако иногда нашему организму может потребоваться поддержка для достижения гомеостаза. Это можно сделать, введя правильное количество КБР, полученного естественным путем из конопли, чтобы улучшить наше общее состояние здоровья.

7NRG Предтренировочный коктейль CBD с манго и ананасом создан, чтобы помочь вам достичь гомеостаза за счет регулирования эндоканнабиноидной системы вашего тела. Это восстанавливает баланс в вашей центральной нервной системе и иммунной системе. Было показано, что CBD увеличивает бодрствование и драйв при введении в точных дозах. В сочетании с нашими натуральными, энергетически насыщенными ингредиентами он становится идеальным питанием перед тренировкой, которым можно наслаждаться перед каждой тренировкой, чтобы снизить усталость и повысить концентрацию внимания.

Наша уникальная формула на 100% органическая и получена из США. Мы используем процесс экстракции CO2 из цельного растения, который позволяет нам извлекать CBD из лучших растений конопли, отфильтровывая неестественные и нежелательные вещества. Это максимизирует качество, чистоту и концентрацию нашего CBD. 7NRG CBD не является психоактивным.

Мы очень серьезно относимся к качеству и прозрачности, поэтому мы тестируем каждый из наших продуктов в сторонней лаборатории, чтобы гарантировать их согласованность и качество. Вы можете получить доступ к этим лабораторным отчетам здесь.

• Вкус манго и ананаса
• Веганский
• Без глютена
• Шейкер внутри
• Бесперебойная доставка
• Быстрое впитывание
• Непсихоактивный (БЕЗ THC)
• Исключительно из США

Дозировка: Мы добавили точное количество CBD, необходимое для наших предтренировочных напитков, чтобы повысить выносливость перед тренировкой.Просто наполните, взболтайте, выпейте и утилизируйте.

Проезд: Просто добавьте воды и встряхните. Используйте за 20 минут до тренировки или тренировки.

Состав добавок: Лимонная кислота, натуральные и искусственные ароматизаторы, диоксид кремния, яблочная кислота, сукралоза, ацесульфам калия.

Обратите внимание: 7NRG Pre Workout CBD Shakes — это продукты спортивного питания и не предназначены для замены какой-либо еды и / или лекарств.В случае сомнений проконсультируйтесь с диетологом и / или врачом. Если вы беременны или кормите грудью, проконсультируйтесь с врачом перед использованием этого продукта.

ХРАНИТЬ В НЕДОСТУПНОМ ДЛЯ ДЕТЕЙ

ХРАНИЛИЩЕ В ПРОХЛАДНОМ СУХОМ МЕСТЕ

Механизмы устойчивости и приспособленность устойчивых к пираклостробину изолятов Lasiodiplodia theobromae из манговых садов

Абстрактные

Фон

Гниль на концах стебля, вызванная Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl — серьезная послеуборочная болезнь манго. В Китае в последнее десятилетие сообщалось о высокой распространенности устойчивости к фунгицидам QoI. Цель исследования — обсудить факторы, определяющие быстрое развитие устойчивости к пираклостробину, и механизмы ее устойчивости.

Методы

Для определения устойчивости устойчивости и соответствия устойчивости к пираклостробину в L . theobromae , три фенотипа устойчивости к пираклостробину были сравнены и проанализированы на предмет значений EC ₅₀ , роста мицелия, вирулентности, температурной чувствительности и чувствительности к осмотическому стрессу.Относительная проводимость и ферментативная активность различных фенотипов сравнивали в условиях фунгицидного стресса, чтобы изучить возможные биохимические механизмы устойчивости к пираклостробину в L . theobromae . Были проанализированы последовательности гена Cytb различных фенотипов.

Результаты

Все изоляты сохранили свои исходные фенотипы устойчивости в течение 10 субкультур на КПК без фунгицидов, коэффициент изменения чувствительности (FSC) был приблизительно равен 1.Пираклостробин устойчивости полевых изолятов должен быть относительно стабильным. Два фенотипа, устойчивых к пираклостробину, обладали схожим мицелиальным ростом, вирулентностью и температурной чувствительностью с фенотипом, чувствительным к пираклостробину. После обработки пираклостробином относительная проводимость чувствительного фенотипа значительно увеличилась. Время достижения максимальной проводимости Pyr-R и Pyr-HR было примерно в 8–10 раз больше, чем у Pyr-S, время появления максимального значения показало значительные различия между чувствительными и устойчивыми фенотипами.Активности глутатион-S-трансферазы (GST), каталазы (CAT) и пероксидазы (POD) Pyr-HR были в 1,78, 5,45 и 1,65 раза соответственно, что значительно выше, чем у Pyr-S после обработки пираклостробином 200 мг / л.

Заключение

Результаты показали, что фенотипы, устойчивые к пираклостробину, демонстрируют высокую приспособленность и высокий риск. Нуклеотидные последовательности были идентичны среди всех изолятов, устойчивых и чувствительных к пираклостробину. Устойчивость к пираклостробину не была связана с изменениями гена Cytb , могут быть некоторые другие механизмы устойчивости.Дифференциальный ответ активности фермента и проницаемости клеточной мембраны наблюдался у резистентных и чувствительных изолятов, что свидетельствует о механизме метаболической резистентности.

Образец цитирования: He R, Yang Y, Hu Z, Xue R, Hu Y (2021) Механизмы устойчивости и приспособленность устойчивых к пираклостробину изолятов Lasiodiplodia theobromae из манговых садов. PLoS ONE 16 (6): e0253659. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253659

Редактор: Абхай К.Pandey, Институт исследования чая Токлай, ИНДИЯ

Поступила: 7 марта 2021 г .; Принята к печати: 9 июня 2021 г .; Опубликован: 23 июня 2021 г.

Авторские права: © 2021 He et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи.

Финансирование: Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (31560521).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов. Рукопись одобрена к публикации всеми авторами.

Введение

Манго ( Mangifera indica L.) — одна из важнейших фруктовых культур в тропических и субтропических регионах. Китай — вторая по величине посевная площадь манго в мире.В 2019 году посевные площади манго на Хайнане превысили 56900 гектаров и составили 675805 тонн. Стеблевая гниль (SER) манго — серьезное послеуборочное заболевание манго [1–3]. Заражение плодов начинается в поле в слабых местах вокруг прикрепления плодоножки, где вначале накапливается и сохраняется влага. После сбора урожая SER начинает развиваться по мере созревания плодов и может привести к значительному гниению плодов и потере урожая, частота заболеваний плодов составляет 10-40% [4]. В провинции Хайнань SER в основном вызывается Lasiodiplodia theobromae Pat.(= Botryodiploda theobromae Pat.) [5, 6]. Кроме того, L . theobromae может вызывать более 500 других болезней растений [7]. Однако из-за отсутствия устойчивых сортов химическая борьба является наиболее надежным методом профилактики, доступным фермерам, выращивающим манго в Китае. Применение фунгицидов — это основной метод борьбы с болезнями манго после сбора урожая. Традиционно для борьбы с болезнями (SER, антракноз, мучнистая роса и др.) Часто используются синтетические фунгициды.) в предуборочный и послеуборочный периоды. Полевые изоляты L . theobromae из манго приобрели устойчивость к бензимидазольному фунгициду карбендазиму в результате длительного и широкого применения [8–10]. Изоляты, устойчивые к карбендазиму, получили широкое распространение в провинции Хайнань. В настоящее время фунгициды как внешний ингибитор хинона (QoI), так и ингибитор деметилирования стерола (DMI) используются для борьбы с болезнями манго. Чтобы отсрочить или избежать развития устойчивости к фунгицидам, наиболее широко распространенные стратегии борьбы с устойчивостью используют смеси фунгицидов с различными механизмами действия.Фунгициды QoI (такие как азоксистробин и пираклостробин) являются наиболее важным классом сельскохозяйственных фунгицидов. Пираклостробин — один из новых членов QoI, обладающий чрезвычайно широким спектром активности. Механизм действия заключается в ингибировании транспорта электронов между цитохромом b и цитохромом c1 в дыхательной цепи митохондрий, что приводит к нарушению производства АТФ [11]. Из-за своего единственного механизма действия фунгициды QoI имеют высокий риск селекции устойчивости у фитопатогенных грибов, а полевая устойчивость к фунгицидам QoI зарегистрирована более чем у 30 видов [12, 13].Известна устойчивость к пираклостробину у различных видов грибов, а также перекрестная устойчивость к другим фунгицидам QoI. Комитет действий по устойчивости к фунгицидам (FRAC) определил фунгициды QoI как имеющие высокий риск развития устойчивости [14]. Развитие устойчивости к фунгицидам в основном зависит от полевых мутаций и наследования новых признаков [15, 16]. Многие исследования показали, что молекулярные механизмы устойчивости к фунгициду QoI у различных грибов коррелируют с точечными мутациями гена Cytb [17, 18].Более того, стабильность устойчивости, приспособленность и конкурентоспособность полевых изолятов являются чрезвычайно важными факторами риска развития устойчивости [19, 20]. Многие исследования показали, что некоторые из полевых изолятов, особенно лабораторные мутанты, ассоциированные с устойчивостью к фунгицидам, могут одновременно вызывать затраты на приспособленность. Эти устойчивые изоляты страдали от значительных нарушений пригодности в отношении роста мицелия, прорастания конидий, образования склероций, вирулентности или температурной чувствительности и были менее конкурентоспособными, чем чувствительные изоляты [21, 22].

Наши предыдущие исследования показали, что модель L . theobromae изолята манго в провинции Хайнань, Китай, имели высокий уровень устойчивости к фунгицидам QoI пираклостробину [9]. Тем не менее, сопротивление приспособленности стоит, механизмы сопротивления L . theobromae до QoI остаются неизвестными. Таким образом, целью данного исследования было сравнение характеристик устойчивых к пираклостробину и чувствительных к пираклостробину изолятов L . theobromae для оценки устойчивости к сопротивлению и выявления характеристик и механизмов устойчивости.Исследования заключались в: (i) определении пригодности чувствительного к пираклостробину и устойчивого к пираклостробину L . theobromae изолятов для оценки риска резистентности путем сравнения роста мицелия, вирулентности, температурной и осмотической чувствительности; (ii) определить роль биохимических механизмов устойчивости к пираклостробину путем сравнения проницаемости клеточной мембраны, содержания белка и активности ферментов в изолятах; (iii) анализировать последовательность гена Cytb чувствительного к пираклостробину и устойчивого к пираклостробину L . изолятов theobromae .

Материалы и методы

Изоляты

В нашем более раннем лабораторном исследовании было собрано изолята Lasiodiplodia theobromae во время программы мониторинга для определения чувствительности к фунгицидам QoI. Все изоляты были изолированы из больных плодов манго в провинции Хайнань в Китае в 2014 и 2016 годах, и 59% изолятов имели устойчивость к пираклостробину. Подробности процедуры выделения и определения чувствительности к фунгицидам были описаны ранее [9].Для изучения пригодности и биохимических свойств этих изолятов было отобрано 30 изолятов для тестирования в текущем исследовании, включая 5 чувствительных изолятов (Pyr-S, EC ₅₀ <10 мг / л), 9 резистентных изолятов (Pyr-R, 10 мг / л ≤ EC ₅₀ <100 мг / л) и 16 высокорезистентных изолятов (Pyr-HR, EC ₅₀ ≥ 100 мг / л). Изоляты хранили на скошенном картофельном агаре с декстрозой (PDA) при 4 ° C до использования.

Определение устойчивости сопротивления

Пираклостробин технический (96% a.i., Hainan Zhengye Zhongnong High Technology Co., Ltd., Хайкоу, Китай) растворяли в ацетоне с получением 2,5 × 10 ⁴ мг / л растворов и хранили при 4 ° C. Салицилгидроксамовую кислоту (SHAM, 99% а.и., Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd., Шанхай, Китай) растворяли в ацетоне с получением 1 × 10 ⁴ мг / л растворов и хранили при 4 ° C.

Диск мицелия диаметром 5 мм вырезали с края трехдневной колонии и помещали на планшет PDA без пираклостробина. После 10-кратного пересева на пираклостробин значения EC ₅₀ 30 изолятов были рассчитаны с помощью пробит-анализа.Конечная концентрация пираклостробинина в PDA была доведена до 0,69, 2,06, 6,17, 18,52, 55,56, 166,67 и 500 мг / л, и SHAM (альтернативный ингибитор оксидазы) был добавлен к PDA в дозе 100 мг / мл, включая контроли без фунгицида. Коэффициенты ингибирования были преобразованы в значения вероятности, а концентрации пираклостробина были преобразованы в логарифмическую форму перед использованием в регрессионной модели. Все изоляты инкубировали при 28 ° C в течение 36 часов. Каждый изолят культивировали на трех повторных планшетах для каждой обработки. Эксперимент проводился независимо трижды.Стабильность сопротивления была представлена ​​значением FSC (коэффициент изменения чувствительности): FSC: значения EC ₅₀ 10-го переноса, деленные на значения EC ₅₀ 1-го переноса [15].

Анализ роста мицелия

Диск мицелия (диаметром 5 мм) брали с края 3-дневной колонии и помещали на чашку PDA с тремя повторностями на изолят. После инкубации в течение 36 ч в темноте при 28 ° C для каждой чашки измеряли радиальный рост мицелиальных колоний.Эксперимент проводился независимо трижды.

Анализ вирулентности

Вирулентность каждого изолята с различными фенотипами устойчивости к пираклостробину оценивалась на плодах манго. Для оценки использовали свежие зеленые незрелые плоды манго аналогичного размера (сорт Guifei). Поверхность плодов дезинфицировали в 1% -ном об. / Об. Растворе гипохлорита натрия (NaOCl) в течение 1 мин, трижды промывали стерильной дистиллированной водой и сушили на воздухе. Затем каждый плод был легко ранен в трех местах стерильной иглой, и диски мицелия (диаметром 5 мм), взятые с 3-дневных пластинок КПК, помещались на участки ран.Все плоды инкубировали при 30 ± 2 ° C и относительной влажности от 70 до 90%. Использовали пять плодов на изолят, инкубировали с тремя дисками мицелия на плод. Диаметр поражения регистрировали каждый день. На основании диаметра поражения после инкубации в течение 5 дней полевые изоляты были впоследствии классифицированы как: высоковирулентные изоляты (поражения ≥ 30 мм), умеренно вирулентные изоляты (15 мм ≤ поражение <30 мм) и слабо вирулентные изоляты (поражения <15 мм). ).

Анализ температурной чувствительности

Для определения температурной чувствительности L . theobromae с различными фенотипами устойчивости к пираклостробину, 5-миллиметровая мицелиальная пробка была взята с края 3-дневной колонии, перенесена на чашки PDA и инкубирована отдельно при 5, 10, 15, 20, 25, 30, 30 мин. 35 или 40 ° C в течение 36 ч в термостатических инкубаторах. Размер колонии измеряли, как описано ранее. Каждый изолят культивировали на трех повторных планшетах для каждой обработки. Эксперимент проводился независимо дважды.

Анализ осмотической чувствительности

Чтобы проверить чувствительность к осмотическому стрессу, мицелиальную пробку (диаметром 5 мм) брали с края 3-дневной колонии и переносили на чашки КПК, содержащие 5, 10, 20, 40, 80, 100 или 150 г / л глюкозы отдельно.Кроме того, концентрация хлорида натрия (NaCl) в КПК составляла 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 или 80 г / л. Три чашки каждой обработки инкубировали при 28 ° C в течение 36 часов, и размер колоний измеряли, как описано ранее. Эксперимент проводился независимо дважды.

Тест на проницаемость клеточной мембраны

Проницаемость клеточных мембран мицелия выражалась относительной проводимостью [23]. Для каждого изолята мицелиальные пробки (диаметром 5 мм) с краев 3-дневных колоний на КПК помещали в колбы на 250 мл (5 пробок на колбу), содержащие 100 мл бульона для PD, и культивировали при 120 об / мин в течение 48 часов.Мицелий каждого изолята собирали на двойной марле и дважды промывали бидистиллированной водой. После фильтрации в вакууме в течение 30 мин 1 г мицелия на образец суспендировали в 20 мл бидистиллированной воды, содержащей пираклостробин в концентрации 100 мг / л. Через 0, 5, 10, 20, 40, 80 или 120 мин при 25 ° C электрическую проводимость измеряли с помощью кондуктометра, чтобы оценить степень вымывания клеточного содержимого через клеточные мембраны. Через 120 минут мицелий кипятили в течение 5 минут и измеряли конечную проводимость.Все тесты имели трехкратную повторность. Относительная проводимость мицелия рассчитывалась как:

Определение содержания белка и активности ферментов

Приготовление тканевого гомогената: диски мицелия (диаметром 5 мм) с краев 3-дневных колоний на КПК помещали на новые чашки КПК, содержащие 2, 20 или 200 мг / л пираклостробина. В контрольную среду не добавляли фунгициды. Мицелий существенно вырос по всей пластине PDA после культивирования при 28 ° C в течение 4 дней. Затем мицелий соскабливали с КПК и гомогенизировали с использованием девяти объемов (1: 9 мас. / Об.) Физиологического раствора.Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 4000 об / мин в течение 10 мин, а супернатант использовали для анализа содержания белка и ферментативной активности.

Общее содержание белка определяли с использованием набора для анализа белка Брэдфорда (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Цзянсу, Китай). Общий растворимый белок оценивали с помощью анализа связывания красителя и контролировали при 595 нм.

Активность фермента определяли в соответствии с инструкциями к набору (Нанкинский институт биоинженерии).Значения оптической плотности соответствующих пробирок измеряли с помощью спектрофотометра при комнатной температуре, и значения активности соответствующих ферментов рассчитывали в соответствии с формулами. Глутатион S трансфераза (GST) катализирует восстановление глутатиона (GSH) до 1-хлор-2,4-динитробензола. Во время реакции уровень активности GST имеет линейную зависимость от изменения концентрации GSH до и после реакции. Изменение оптической плотности при 420 нм измеряли для определения количества GSH.Активность GST как мера реакции, в которой концентрация GSH снижается на 1 мкМ в минуту при 37 ° C, выражалась в единицах на миллиграмм общего белка.

Реакцию каталазы (CAT) по разложению перекиси водорода можно быстро остановить добавлением молибдата аммония. Оставшаяся перекись водорода реагирует с молибдатом аммония с образованием бледно-желтого комплекса, который измеряется при 405 нм на спектрофотометре. Одна единица CAT определялась как количество фермента, которое выделяло 1 мМ перекиси водорода (H ₂ O ₂ ) в минуту на миллиграмм белка при 37 ° C.

(POD) основан на принципе реакции H ₂ O ₂ , катализируемой POD, и определяется по увеличению поглощения при 420 нм с помощью спектрофотометра. Одна единица POD была определена как количество фермента, который гидролизовал 1 мг субстрата в минуту на миллиграмм белка при 37 ° C.

Фенилаланинаммиаклиаза (PAL) катализирует реакцию дезаминирования фенилаланина, которая высвобождает NH ₃ с образованием транс-коричной кислоты.Изменение оптической плотности при 290 нм, вызванное разной концентрацией транс-коричной кислоты, определяет активность PAL. Активность PAL выражали в единицах на мг растворимого белка.

Анализ нуклеотидной последовательности гена

Различные фенотипы устойчивости к пираклостробину были использованы для анализа гена Cytb . Для извлечения геномной ДНК каждый изолят культивировали на КПК при 28 ° C в течение 3 дней. Мицелии собирали и измельчали ​​в жидком азоте.Геномную ДНК экстрагировали с использованием набора для экстракции геномной ДНК растений MiniBEST (TaKaRa Bio inc., Далянь, Китай). Две пары праймеров F 5′-TTATGGGTCATACAGAGC-3 ‘и R 5′-TACAATAGCAGGCGGAGT-3’ были адаптированы для амплификации фрагмента гена Ctyb , содержащего кодон 129, 137 и 143. Все ПЦР были выполнены в объемах 20 мкл, содержащих 10 мкл 2 × Taq Master Mix, 1 мкл матричной ДНК, 0,5 мкл каждого праймера и 8 мкл ddh3O. Условиями ПЦР были 95 ° C в течение 3 минут, а затем 35 циклов (95 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 40 секунд, 72 ° C в течение 90 секунд), заключительная стадия продления продолжалась 5 минут при 72 ° C.Отдельный ПЦР-фрагмент размером приблизительно 500 п.н. амплифицировали с использованием этой пары праймеров. Продукты ПЦР разделяли в 1,0% агарозных гелях в 1 × TAE и очищали с использованием набора для очистки ДНК (Takara Bio Inc., Далянь, Китай). Все продукты ПЦР были секвенированы компанией Sangon Biotech (Шанхай, Китай) Co., Ltd. Последовательности были подвергнуты обработке с использованием BLAST и сравнены с таковыми в базе данных NCBI / GenBank ^® . Последовательности были аннотированы с помощью программного обеспечения BioEdit (версия 7.0.9) для ручного редактирования и перевода.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью SPSS (SPSS Statistics 24.0, IBM, США). Экспериментальные данные проверяли на однородность дисперсий с помощью критерия Левена, затем рассчитывали средние значения ± стандартное отклонение. Чтобы оценить различия в росте мицелия, относительной проводимости или активности фермента, данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA полностью рандомизированного дизайна (CRD) с последующим тестом Тьюки (P <0,05).

Результаты

Устойчивость к сопротивлению

После 10 последовательных переносов на среду PDA, не содержащую фунгицидов, значения фенотипов Pyr-S, Pyr-R и Pyr-HR по EC ₅₀ варьировались от 2.От 5 до 7,6 мг / л, от 19,2 до 71,1 мг / л и от 123,1 до 1375,2 мг / л соответственно. Тридцать изолятов сохранили свои первоначальные фенотипы устойчивости в течение 10 субкультур на КПК, не содержащем фунгицидов. Изменение ЕС ₅₀ для всех изолятов варьировало от 0,7 до 1,4 раза (FSC ≈ 1, таблица 1), указывая на то, что устойчивость к пираклостробину составляет л . полевых изолятов theobromae были относительно стабильными.

Рост мицелия и вирулентность

Тридцать изолятов различались по росту мицелия и вирулентности по отношению к манго (таблица 1), среди изолятов были значительные различия (F = 7.964, P = 0,000 <0,05). Однако при сравнении групп фенотипов рост мицелия не имел значительных различий в средствах роста мицелия между устойчивыми и чувствительными фенотипами (F = 0,104, P = 0,903), при среднем росте мицелия Pyr-HR, Pyr- R и Pyr-S имеют диаметр 79,8, 80,7 и 79,2 мм соответственно.

При инокулировании L . theobromae , на плодах манго быстро развились поражения от коричневого до черного, вызывающие водянистую гниль, но контрольные плоды остались здоровыми (рис. 1).Частота высоковирулентных, умеренно вирулентных и слабовирулентных изолятов составила 63,3%, 23,3% и 13,3% соответственно. Вирулентность изолятов, устойчивых к пираклостробину (Pyr-HR и Pyr-R), по сравнению с изолятами, чувствительными к пираклостробину (Pyr-S), существенно не снизилась.

Чувствительность к температуре

Все L . Изоляты theobromae росли быстрее после инкубации при температуре от 25 ° C до 35 ° C. Изолят не мог расти на КПК при 5 ° C. При культивировании при 10 ° C только 8 изолятов выросли через 48 часов.Рост мицелия значительно подавлялся при 40 ° C. Наблюдалась значительная разница в росте мицелия между низко- и высокотемпературными группами в пределах групп одного и того же фенотипа (Таблица 2). Когда их сравнивали как группы фенотипов, не было существенной разницы между устойчивыми и чувствительными фенотипами в средних значениях роста мицелия при температуре от 15 до 40 ° C через 36 часов ( P > 0,05).

Чувствительность к осмотическому стрессу

Рост мицелия различных фенотипов, устойчивых к пираклостробину, незначительно увеличивался при увеличении концентрации NaCl от 0 до 2.5 г / л. Однако рост мицелия значительно подавлялся, когда концентрация увеличивалась выше 5 г / л (рис. 2а). Для глюкозы менее 20 г / л рост мицелия всех фенотипов значительно увеличивался с увеличением концентрации глюкозы. Повышение концентрации глюкозы выше 20 г / л оказывало небольшое влияние на рост мицелия (рис. 2b). Не было значительных различий между разными фенотипами при выращивании в КПК с 80 г / л NaCl или 150 г / л глюкозы (F = 0,472, P = 0.645; F = 78,505, P = 1.000). После L . theobromae продуцировал устойчивость к пираклостробину, рост мицелия фенотипов Pyr-HR и Pyr-R существенно не снижался по сравнению с фенотипами Pyr-S при осмотическом стрессе.

Рис. 2. Чувствительность к осмотическому стрессу Lasiodiplodia theobromae к различным фенотипам устойчивости к пираклостробину.

(а) Чувствительность к NaCl. (б) Чувствительность к глюкозе. Полоски обозначают погрешность стенда трех экспериментов.S = чувствительный, R = устойчивый и HR = высокоустойчивый.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253659.g002

Относительная проводимость и проницаемость клеточной мембраны

Результаты показали, что относительная проводимость всех L . theobromae со временем увеличивалось, относительная проводимость трех фенотипов достигла максимума после 80 мин обработки (рис. 3а). При обработке пираклостробином 100 мг / л относительная проводимость чувствительного фенотипа заметно увеличивалась за короткое время (10 мин), но для устойчивых фенотипов требовалось более длительное время (≥ 80 мин) (рис. 3b).Относительная проводимость Pyr-S была значительно выше, чем у Pyr-HR и Pyr-R после обработки в течение 10 минут (F = 50,09, P = 0,000 <0,05). Проницаемость клеточной мембраны измеряли по электропроводности. Это означает, что проницаемость клеточной мембраны Pyr-S была заметно увеличена по сравнению с проницаемостью устойчивых фенотипов после обработки пираклостробином.

Рис. 3. Относительная проводимость Lasiodiplodia theobromae к различным фенотипам устойчивости к пираклостробину.

(a) Без фунгицидной обработки. (b) Обработка пираклостробином 100 мг / л. Полоски обозначают погрешность стенда трех экспериментов. S = чувствительный, R = устойчивый и HR = высокоустойчивый.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253659.g003

Содержание белка и активность ферментов

Содержание белка всех фенотипов мало изменялось с увеличением концентрации пираклостробина. Существенных различий между устойчивым и чувствительным фенотипами не было ( P > 0.05).

Активность ферментов L . theobromae изолятов измеряли после инкубации с различными концентрациями пираклостробина. Активность GST всех фенотипов заметно снижалась с увеличением концентрации обработки фунгицидом. Активность GST устойчивых фенотипов (Pyr-HR и Pyr-R) была значительно выше, чем у фенотипа Pyr-S после обработки пираклостробином (рис. 4а). По сравнению с контрольной группой скорость снижения активности GST фенотипов Pyr-HR, Pyr-R и Pyr-S составляла, соответственно, 79.92%, 75,69% и 84,17% после лечения пираклостробином 200 мг / л. Активность GST фенотипов Pyr-HR и Pyr-R была значительно выше по сравнению с фенотипом Pyr-S после обработки пираклостробином 200 мг / л (F = 9,265, P = 0,015). Но для активности CAT фенотип Pyr-HR значительно увеличивался с увеличением концентрации обработки фунгицидом, а фенотип Pyr-S показал результат, противоположный Pyr-HR. (Рис. 4b). CAT-активность фенотипа Pyr-HR была значительно выше по сравнению с фенотипами Pyr-S и Pyr-R после обработки пираклостробином 200 мг / л (F = 18.623, P = 0,003). Точно так же активность POD фенотипа Pyr-HR значительно увеличивалась с увеличением обрабатываемой фунгицидом концентрации (рис. 4c). Активность POD фенотипа Pyr-HR была значительно выше по сравнению с фенотипами Pyr-S и Pyr-R после обработки пираклостробином (F = 7,975, P = 0,02). Что касается активности PAL, только фенотип Pyr-HR также уменьшался с увеличением концентрации обработки фунгицидом (рис. 4d). Активность PAL фенотипа Pyr-S была значительно выше по сравнению с фенотипами Pyr-R и Pyr-HR после обработки пираклостробином 200 мг / л (F = 22.69, p = 0,002).

Рис. 4. Активность ферментов в мицелиях фенотипов Lasiodiplodia theobromae при фунгицидном стрессе.

(a-d) Действия GST, CAT, POD и PAL соответственно. Полоски обозначают погрешность стенда трех экспериментов. S = чувствительный, R = устойчивый и HR = высокоустойчивый.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253659.g004

Таким образом, активность GST, CAT и POD фенотипа Pyr-HR L . theobromae были значительно выше по сравнению с фенотипом Pyr-S в высокой концентрации пираклостробина, что противоречит активности PAL. Активности GST, CAT и POD Pyr-HR были в 1,78, 5,45 и 1,65 раза выше, чем у Pyr-S, соответственно.

Неполные фрагменты были получены из гена Cytb из L . theobromae изолятов длиной 490 п.н. (рис. 5). BLAST-поиск нуклеотидной последовательности в GenBank показал 100% идентичность с геном Cytb в L . theobromae MCC2345 (GenBank: MH880818.1). Ортологичные положения белка были аминокислотными с 62 по 224. Секвенированный фрагмент гена Cytb из L . theobromae включает положения мутаций, которые, как известно, влияют на устойчивость патогенов к фунгицидам QoIs. В изолятах, устойчивых к пираклостробину, мутации не наблюдалось. Результаты показали, что все L . Изоляты theobromae имели идентичные частичные последовательности, устойчивость к пираклостробину не была связана с изменениями гена Cytb .

Рис. 5. Выравнивание последовательностей гена Cytb по сравнению с аналогичным геном из других грибов.

MCC2345: Изолят Lasiodiplodia theobromae из папайи (GenBank: MH880818.1). YZHJ
: изолят L. theobromae из манго, устойчивый к пираклостробину.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253659.g005

Обсуждение

Сообщалось о широком распространении устойчивых к карбендазиму и пиразоксистробину изолятов L . theobromae в районе выращивания манго Хайнань [4, 8, 9]. Устойчивость к сайт-специфическим фунгицидам стала ограничением для постоянного контроля гнили на концах стебля, вызываемой L . theobromae . Знание устойчивости к фунгицидам важно для обеспечения устойчивого управления болезнями в сельскохозяйственных системах.

Согласно нашему предыдущему исследованию, устойчивость к фунгицидам QoI может быстро развиваться в L . theobromae популяций. В этом исследовании были проанализированы стабильность и пригодность изолятов, устойчивых к пиразоксистробину, для оценки риска устойчивости к фунгицидам.Результаты продемонстрировали, что устойчивые к пираклостробину изоляты сохраняли те же уровни пираклостробина EC ₅₀ , что и их исходные поколения после последовательного субкультивирования на КПК. Он показал, что устойчивость к пираклостробину L . theobromae был стабилен в отсутствие фунгицида. Однако может быть разница между полевыми изолятами и лабораторными УФ-индуцированными мутантами, лабораторно индуцированными мутантами B . cinerea практически полностью утратил устойчивость к пираклостробину после 7 переносов на КПК без фунгицидов [21].Предыдущие отчеты показали, что некоторые устойчивые к фунгицидам патогены обладают достаточной приспособленностью, чтобы конкурировать с чувствительными патогенами в полевых условиях [19, 20]. Напротив, некоторые устойчивые к фунгицидам изоляты могут вызывать затраты на приспособляемость, например, устойчивые к карбендазиму изоляты были чувствительны в условиях низких или высоких температур [22], устойчивые к флудиоксонилу мутанты были чувствительны к осмотическому стрессу [24], устойчивые к пираклостробину мутанты были менее вирулентны, чем их чувствительные дикие родители [25]. В нашем исследовании очевидная разница в приспособленности наблюдалась среди изолятов в пределах одних и тех же фенотипических групп, но не было значительных различий в средних значениях между разными фенотипическими группами.Два фенотипа, устойчивых к пираклостробину, обладали схожим мицелиальным ростом, вирулентностью и температурной чувствительностью с фенотипом, чувствительным к пираклостробину. И не было значительных различий между разными фенотипами при выращивании в присутствии высокой концентрации NaCl и глюкозы. Эти результаты показали, что L . theobromae Полевые изоляты не имеют очевидных затрат на пригодность, связанных с устойчивостью к пираклостробину. Существует довольно высокий и потенциальный риск сопротивления L . theobromae на пираклостробин. Аналогичная картина результатов была получена для устойчивых к карбендазиму изолятов L . theobromae [10]. Далее доказано, что L . theobromae — разновидность грибка с «высоким риском» развития устойчивости к фунгицидам. Сниженная чувствительность сайтов-мишеней фунгицидов и усиленная метаболическая детоксикация являются двумя основными механизмами развития устойчивости, такими как точечные мутации целевого гена [15-18], сверхэкспрессия переносчиков АТФ-связывающих кассет (ABC) [26] или изменения активность метаболических ферментов [27].Недавние исследования показали, что фунгициды могут приводить к повреждению клеточной мембраны и увеличению утечки электролитов из мицелия у Sclerotinia sclerotiorum [28] и устойчивых к фунгицидам изолятов S . sclerotiorum имел значительное увеличение относительной проводимости [23, 29]. Согласно нашему исследованию, время, которое соответствует максимальной относительной проводимости, значительно различается между тремя фенотипическими группами после лечения пираклостробином; Время достижения Pyr-R и Pyr-HR наибольшей проводимости было примерно в 8–10 раз, чем Pyr-S.При лечении в течение 10 минут наблюдалась значительная разница между чувствительным и резистентным фенотипами. Таким образом, относительная электрическая проводимость сильно коррелировала с проницаемостью клеточной мембраны, поэтому пираклостробин мог приводить к увеличению утечки из мицелия чувствительных изолятов за короткое время, но для устойчивых изолятов требовалось больше времени. Поэтому предполагается, что измененная проницаемость клеточной мембраны устойчивых изолятов может быть связана с устойчивостью к фунгицидам.

Многочисленные исследования показали, что активность ферментов может играть роль в устойчивости пестицидов [30].У устойчивых к фунгицидам изолятов наблюдалось повышение активности ферментов, что усиливало метаболическую детоксикацию [31, 32]. Недавние исследования показали, что GST является основным классом ферментов, участвующих в процессах детоксикации клеток, он может быть ответственным за устойчивость Fusarium graminearum к карбендазиму [27]. Более того, активность POD была значительно выше у резистентных к диметахлону по сравнению с чувствительными изолятами S . sclerotiorum [29].В нашем исследовании активность GST устойчивых фенотипов в необработанной контрольной группе существенно не отличалась от активности чувствительных изолятов. Активность GST в трех фенотипах, по-видимому, снижалась с увеличением концентрации пираклостробина, но такое снижение активности GST, очевидно, было меньше у резистентных фенотипов, чем у чувствительных. Однако активность КАТ устойчивых изолятов возрастала с увеличением обрабатываемой фунгицидом концентрации. Результаты показали, что меняются правила для активности нескольких ферментов резистентного L . theobromae были разными после лечения пираклостробином. Важно отметить, что независимо от того, увеличивается или уменьшается активность ферментов с увеличением концентрации пираклостробина, конечным результатом является то, что активности GST, CAT и POD групп устойчивого фенотипа (особенно Pyr-HR) были значительно выше, чем у Pyr. -S. Таким образом, можно обоснованно предположить, что активность ферментов могла быть связана с механизмом устойчивости к фунгицидам QoI в L . theobromae .

Основным механизмом устойчивости к фунгицидам фитопатогенных грибов являются мутации генов-мишеней. Устойчивость к фунгицидам QoI обычно связана с точечными мутациями в гене Cytb по кодонам 129, 137 и 143 у многих фитопатогенов [12, 13, 33]. Другие показали, что мутация гена Cytb также не была обнаружена у некоторых патогенов, например, пониженная чувствительность к азоксистробину L . изолятов theobromae [34], изолятов с низкой и средней устойчивостью Colletotrichum gloeosporioides [35], изолятов с умеренной и высокой устойчивостью Microdochium majus [36].Хотя L . theobromae из манго имеет высокий уровень устойчивости к пираклостробину, но в этом исследовании точечных мутаций не было обнаружено в изолятах, устойчивых к пираклостробину. Наши результаты показали, что механизм устойчивости к пираклостробину не основан на модификациях гена Cytb , могут быть некоторые другие механизмы устойчивости в L . theobromae .

Настоящее исследование предоставило важные справочные данные для оценки риска резистентности и механизмов резистентности L . theobromae . Высокая пригодность пираклостробин-устойчивого L . theobromae популяции представляют собой серьезные препятствия для управления устойчивостью к фунгицидам QoI. Полевая устойчивость к бензимидазолу и фунгицидам QoI широко распространена в регионах выращивания манго в провинции Хайнань. Настоящие результаты подчеркивают необходимость в стратегиях снижения риска. Кроме того, необходимо усилить исследования механизмов сопротивления. Результаты показали, что устойчивость к пираклостробину L . theobromae не было связано с изменениями гена Cytb . Это исследование также предоставляет некоторые доказательства того, что L . theobromae может избежать ингибирования фунгицидами не только за счет детоксикации, но и за счет других механизмов устойчивости. В заключение можно сказать, что метаболическая устойчивость может играть ключевую роль в устойчивости к фунгицидам. Однако метаболическая устойчивость плохо изучена в области фунгицидов. Следовательно, больше исследований метаболической резистентности (например,г. ключевые метаболические ферменты и родственные гены, гены-переносчики ABC) будут проведены для подтверждения механизма устойчивости к фунгицидам QoI в L . theobromae полевых изоляторов в будущем.

Благодарности

Мы благодарны профессору Мэн Вану из Института защиты растений Хайнаньского университета Китая за предоставление необходимых помещений и поддержку.

Ссылки