Вертикаль северск расписание: Фитнес клуб «Вертикаль» г. Северск :: Расписание old

30.10.1971 alexxlab 0 Comment

Содержание

Центр женского здоровья, г. Северск

Поздравляем нашего врача

Брагину Ольгу Дмитриевну
С защитой докторской диссертации и присвоением звания доктора медицинских наук!!!

Коллектив ЦЖЗ

29.06.2021

Акция

Аутоплазменная терапия в гинекологии до 31 декабря со скидкой 30%.
Аутоплазменная терапия (одна пробирка) ~~3600~~ 2700 р.
Аутоплазменная терапия (две пробирка) ~~5000~~ 3400 р.
Услуга выполняется после консультации врача гинеколога.
Подробнее об услуге …

21.04.2021

Новый врач

Приступает к работе врач терапевт высшей категории
Ефимова Ольга Александровна

21.04.2021

Новый врач

Начинает вести прием врач акушер-гинеколог первой категории
Попова Наталья Владимировна:

Консультативный прием
Ведение беременности

Кольпоскопия
УЗИ органов малого таза

15. 01.2021

Эндокринология

Вновь начинает вести прием врач эндокринолог
Горбач Гэрэлма Геннадьевна:

Консультативный прием
Пункция щитовидной железы
Контроль сахарного диабета
подробнее…
Инсулиновые помпы

18.11.2020

Новая услуга

Перинеометрия с помощью цифрового перинеометра XFT-0010
Подробнее об услуге …

27.10.2020

Работники АО СХК!

Для Вас в 2020 году продолжается программа «Диспансеризация» (гинекология, маммология)
По вопросам получения услуги обращайтесь в страховую компанию «СОГАЗ»

17.01.2020

ОМС

С 2017 года работаем в системе ОМС
Подробнее…

12.04.2017

Работники ООО «Томскнефтехим»!

Приглашаем Вас пройти обследования в нашем центре в рамках договора со страховой компанией «СОГАЗ»

Обязательно наличие гарантийного письма.

21.08.2015

Центр женского здоровья, г. Северск

Гинекологи
Фролова Людмила Анатольевна акушер-гинеколог-эндокринолог, главный врач Центра	пн, чт — с 14:10 до 18:10 вт, ср, пят — с 9:30 до 13:30
Блажевич Евгения Сергеевна акушер-гинеколог-эндокринолог	пн, ср, чт, пят — с 14:00 до 19:00 вт, сб — с 9:00 до 14:00
Козлова Оксана Александровна акушер-гинеколог-эндокринолог	пн, чт, сб — с 9:00 до 14:00 вт, ср, пят — с 14:00 до 19:00
Мазгалина Анастасия Юрьевна акушер-гинеколог-эндокринолог высшей категории	вт — с 16:00 до 19:00
Маммологи
Брагина Ольга Дмитриевна онколог-маммолог, к.м.н.	вт — с 15:00 до 19:00
Новикова Сабина Григорьевна онколог-маммолог	пят — с 15:50 до 18:10
УЗ-диагносты (УЗИ)
Зинченко Светлана Алексеевна врач УЗ-диагностики	пн — с 9:00 до 12:00 сб — с 9:00 до 13:00
Комарова Людмила Александровна врач УЗ-диагностики высшей категории	пн, ср, чт, пят — с 16:00 до 19:00
Неплохова Наталья Модестовна врач УЗ-диагностики	вт, чт — с 9:00 до 12:00
Панасенко Ольга Владимировна врач УЗ-диагностики высшей категории	вт — с 14:30 до 19:00
Разаренова Татьяна Георгиевна врач УЗ-диагностики, к.м.н.	пн, ср, пят — с 9:00 до 15:00 вт — с 9:00 до 14:00 чт — с 12:00 до 15:00
Сай Марина Георгиевна врач УЗ-диагностики высшей категории	ср, пят — с 9:30 до 13:00
Скрипникова Ольга Владимировна врач УЗ-диагностики (суставы, сосуды)	пн, вт, ср, чт, пят — с 13:00 до 16:00
Сморгон Андрей Владимирович врач УЗ-диагностики (сердце)	сб — с 9:00 до 12:00
Неврологи
Кудрявцева Светлана Валентиновна невролог	пн — с 16:10 до 19:00
Сосудитый хирург
Проскоков Игорь Алексеевич сосудистый хирург высшей категории	пн — с 16:10 до 19:00	прием раз в две недели
Эндокринологи
Фаустова Елена Вячеславовна эндокринолог высшей категории	ср, чт — с 15:00 до 19:00
Горбач Гэрэлма Геннадьевна эндокринолог первой категории	пн с 15:00 до 19:00 ср, пят, сб — с 9:00 до 13:00
Терапевт
Ефимова Ольга Александровна терапевт высшей категории	вт — с 9:50 до 12:00 чт — с 16:00 до 19:00
Терапевт/ревматолог
Мозгалина Ольга Викторовна терапевт/ревматолог	сб — с 9:00 до 11:40

Расписание Олимпия – ДЮСШ им. Л.Егоровой

Малая чаша плавательного бассейна МСК «Олимпия»
09:30 — 10:15							Панова О.С. (4-6 лет)
10.30-11.15						Ушаков Д.А. (5-10 лет)	Панова О.С. (4-6 лет)
11.30-12.15						Ушаков Д.А. (5-10 лет)	Панова О.С. (7-12 лет)
12.30-13.15						Цыплакова О.В. (4-6 лет)
13.30-13.15						Корчагина Г.Н. «Без границ»
14.30-13.15						Корчагина Г.Н. ВОС
15.30-13.15					Гуркова О.С. СОГ		Глазкина Т.И. СОГ
16.30-17.15	Корчагина Г.Н. ВОС	Корчагина Г.Н. «Без границ»	Глазкина Т.И. СОГ	Корчагина Г.Н. «Без границ», ВОС	Глазкина Т.И. СОГ		Глазкина Т.И. СОГ
17.30-18.15	Гуркова О.С. (5-7 лет)	Глазкина Т.И. СОГ	Глазкина Т.И. (3-5 лет)	Глазкина Т.И. СОГ	Глазкина Т.И. (3-5 лет)		Глазкина Т.И. (3-5 лет)
18.30-19.15	Гуркова О.С. (7-12 лет)	Ушаков Д.А. (5-10 лет)	Панова О.С. (7-12 лет)	Ушаков Д.А. (5-10 лет)	Панова О.С. (4-6 лет)		Глазкина Т.И. СОГ
19.30-20.15		Панова О.С. (4-6 лет)	Гуркова О.С. (5-7 лет)	Панова О.С. (4-6 лет)	Панова О.С. (4-6 лет)
Большая чаша плавательного бассейна МСК «Олимпия»
13.00-14.00						Ушаков Д.А.
14.00-15.00							Панова О.В.
16.00-17.00	Новиченко О.И.		Новиченко О.И.		Новиченко О.И.
17.00-18.00		Ушаков Д.А.		Ушаков Д.А.	Панова О.В.
18.00-19.00			Гуркова О.С.
20.00-21.00	Новиченко Д.О.		Новиченко Д.О.		Новиченко Д.О.

Расписание — МБУДО «Художественная школа»

Программа, срок обуч.	«Живопись», 8 лет предпрофессиональная		«Живопись», 5 лет предпрофессиональная
КЛАСС	VII — А	VII — В	4-В	5-В	5-Г	5-Д	5-Е
Классн. руковод.	Карпова Алёна Вячеславовна	Карпова Алёна Вячеславовна	Кулагина Наталья Викторовна	Кулагина Наталья Викторовна	Кулагина Наталья Викторовна	Петухова Алла Анатольевна	Петухова Алла Анатольевна
ПН.	ул.Куйбышева,12 16.10 — 16.50 история иск. 17.00 — 18.20 скульптура	ул.Куйбышева,12 17.50 — 18.30 история иск. 18.40 — 20.00 скульптура	15.10 — 17.30 композиция каб.2		17.40 — 20.00 рисунок каб.2	15.10 — 17.30 живопись каб.6	17.40 — 20.00 живопись каб.6
ВТ.	15.10 — 17.30 рисунок каб.3	17.40 — 20.00 рисунок каб.3	16.50 — 20.00 рисунок каб.2	ул.Куйбышева,12 15.00 — 16.00 история иск. 16.10 — 17.30 компьют.граф.	ул.Куйбышева,12 17.40 — 19.00 компьют.граф. 19.10 — 20.10 история иск.	15.10 — 17.30 рисунок каб.6	17.40 — 20.00 рисунок каб.6
СР.			ул.Куйбышева,12 17.40 — 18.20 история иск. 18.30 — 20.00 скульптура
ЧТ.	15.10 — 17.30 композиция каб.3	17.40 — 20.00 композиция каб.3	17.40 — 20.00 живопись каб.2 Родченкова Н.Г.	15.10 — 17.30 композиция каб.1	17.40 — 20.00 композиция каб.1	ул.Куйбышева,12 16.00 — 17.30 компьют.граф. 17.40 — 18.40 история иск.	ул.Куйбышева,12 17.40 — 19.00 компьют.граф. 19.10 — 20.10 история иск.
ПТ.	15.10 — 17.30 живопись каб.3	17.40 — 20.00 живопись каб.3		15.10 — 17.30 живопись каб.2	17.40 — 20.00 живопись каб.2	15.10 — 17.30 композиция каб.6	17.40 — 20.00 композиция каб.6
СБ.	ул.Куйбышева,12 10.00 — 13.10 рисунок каб.7 2-я суббота мес.	ул.Куйбышева,12 13.20 — 16.30 рисунок каб.7 2-я суббота мес.		12.30-15.40 рисунок каб. 2	12.30-15.40 рисунок каб. 2 4-я суббота мес.	15.00-18.10 рисунок каб. 6 2-я суббота мес.	15.00-18.10 рисунок каб. 6 3-я суббота мес.

границ | MKRN3 взаимодействует с несколькими белками, влияющими на время полового созревания, но не влияет на экспрессию GNRh2

Введение

Начало полового созревания зависит от реактивации секреции гипоталамического гонадолиберина, что приводит к повышенной секреции гонадотропинов и половых стероидов, вторичным половым признакам и достижению взрослого роста и фертильности (1, 2). У пациентов с центральным преждевременным половым созреванием (CPP) половое созревание начинается в возрасте до 8 лет у девочек (стадия груди 2 по Таннеру) и до 9 лет у мальчиков (стадия гениталий по Таннеру G2) (1, 3, 4).Преждевременная центральная активация секреции GnRH может быть патологической из-за внутричерепных поражений или идиопатической, когда не может быть идентифицирована основная причина (4). У девочек ежегодная заболеваемость ХПН варьировала от 15 до 29 на 100 000 (5), а общий риск и заболеваемость у девочек выше, чем у мальчиков (2, 3, 6).

Генетическая этиология идиопатического CPP до конца не изучена, но клинически наиболее значимым геном, лежащим в основе CPP, является ген белка 3 безымянного пальца макорина ( MKRN3) (7–11). MKRN3 — это одноэкзонный, материнский импринтированный ген, который экспрессируется только от отцовского аллеля (12). Следовательно, только наследуемые отцовские мутации потери функции в MKRN3 вызывают CPP (7, 11). MKRN3 принадлежит к семейству макоринов убиквитинлигаз вместе с MKRN1 и MKRN2 . MKRN3 является близким родственником MKRN1 , являясь безинтронной ретрокопией последнего (12, 13). Подобно другим членам семейства макоринов, MKRN3 также состоит из трех доменов цинкового пальца (C3H), одного домена цинкового кольца пальца (C3HC4) и одного MKRN3-специфичного домена Cys-His (CH) и повсеместно экспрессируется в тканях плода и взрослого человека ( 13, 14).Основываясь на своей структуре, предполагается, что MKRN3 функционирует как предполагаемая E3-ubiquitin ligase и потенциально влияет на экспрессию генов, целевую деградацию белка и модуляцию функции белка посредством своей активности E3 ligase (12-15). Интересно, что MKRN3 экспрессируется в гипоталамусе мышей и человека (7, 8), но механистические процессы, с помощью которых отцовская унаследованная мутация потери функции MKRN3 вызывает CPP, в настоящее время неясны.

Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSC) обладают неограниченной способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (16).С этой целью мы недавно описали протокол дифференциации нейронов, экспрессирующих GNRh2 , от hPSC (17), который дает возможность исследовать роль генетических факторов в регуляции GNRh2 у людей. Кластерные регулярно расположенные друг от друга палиндромные повторы (CRISPR) и CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR / Cas9) стали преобладающей технологией в области редактирования генов (18). Вкратце, подход CRISPR / Cas9 состоит из короткой направляющей РНК (crRNA), слитой со специфической для бактерий трансактивирующей crRNA, называемой tracrRNA, которая обрабатывает crRNA, слияние crRNA и tracrRNA образует комплекс tracr: cr РНК, который управляет ферментом Cas9. к определенному локусу ДНК, образуя двухцепочечные разрывы (18).Эти двухцепочечные разрывы естественным образом восстанавливаются за счет склонного к ошибкам негомологичного соединения концов в отсутствие донорной матрицы (19). Мы использовали этот метод для создания биаллельных делеций MKRN3 в hPSC и дифференцировали нокаутные (KO) клеточные линии в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , используя наш недавно описанный протокол, включающий двойное ингибирование SMAD, обработку FGF8 и ингибирование Notch ( 17).

Большинство клеточных белков не функционируют изолированно, а выполняют свои биологические функции, взаимодействуя друг с другом (20).Белковые взаимодействия (PPI) образуют сеть, которая действует координированно, вызывая физиологическую активность в живой клетке (21). Масс-спектрометрия (МС) превратилась в эффективный метод анализа и характеристики PPI (20, 22). Для дальнейшего изучения предполагаемых механизмов, с помощью которых MKRN3 может влиять на время полового созревания, мы исследовали партнеров MKRN3 PPI в клетках HEK, используя наш недавно описанный подход на основе MS, который позволяет обнаруживать стабильные и временные партнеры взаимодействия для интересующего белка ( 20).Эта клеточная линия была выбрана в качестве модели, поскольку клетки HEK имеют определенные характеристики нейронов (23), широко доступны исследователям и часто используются в биомедицинских исследованиях.

Материалы и методы

Плюрипотентные стволовые клетки человека

В данном исследовании использовалась линия плюрипотентных стволовых клеток человека H9 [46, XX, (Wicell)] (24). hPSC поддерживали на чашках, покрытых Matrigel ^® (BD Biosciences), с использованием среды StemPro (Thermo Fisher Scientific) или Essential 8 (Thermo Fisher Scientific).Во время поддержания клетки разделяли 0,5 мМ EDTA (Thermo Fisher Scientific, MA) и высевали в соотношении 1: 3–1: 8. Среду меняли ежедневно, и перед дифференцировкой клетки высевали на чашки, покрытые Geltrex (Thermo Fisher Scientific), и выращивали до> 90% конфлюэнтности.

Руководство по разработке и производству РНК

Руководства

CRISPR были разработаны с использованием https://benchling.com/ для нацеливания на единственный экзон MKRN3 . На основании их оценок отклонений от цели и специфичности были отобраны две пары лучших из возможных руководств.Матрицы ДНК-направляющих РНК (пРНК) были приготовлены с помощью амплификации ПЦР (гРНК-ПЦР) на основе ранее опубликованного метода (25). Вкратце, матрицы гРНК, имеющие выступы из 19 п.н. на 5′- и 3′-концах, были слиты с последовательностями промотора и терминатора U6 (tracr) с использованием упомянутой выше ПЦР с полимеразой Phusion (Thermo Fisher Scientific). Дополнительная информация о gRNA-PCR приведена в дополнительных материалах. Все олигонуклеотиды и направляющие последовательности, относящиеся к CRISPR, перечислены в дополнительной таблице 1.

Создание CRISPR / Cas9 на основе

MKRN3 KO Cell Lines

Для создания MKRN3 KO в hPSC, две гРНК, нацеленные на разные местоположения MKRN3 и плазмиду, кодирующую дикий тип (WT) Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9, далее Cas9), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и зеленый флуоресцентный белок (GFP) ген устойчивости подвергали электропорации в два миллиона клеток H9 с помощью системы трансфекции Neon в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific).Всего на электропорацию использовали 4 мкг плазмидной ДНК и 250 нг каждой гРНК, и электропорированные клетки высевали на чашки с покрытием Matrigel ^® и добавляли 10 мкМ ингибитор ROCK (Y-27632 2HCl, Selleckchem) для увеличения выживаемости. чПСК путем ингибирования апоптоза, вызванного диссоциацией (26). Культуральную среду меняли каждые 24 часа с временным отбором выживших клонов с использованием 0,12 мкг / мл пуромицина (Sigma-Aldrich), начиная с 48 или 72 часов.

Сбор колоний или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)

После 48 часов отбора пуромицина появляющиеся колонии либо собирали вручную, либо отделяли отдельные клетки с использованием проточного сортировщика (Sony Biotechnology Inc.). Сбор колоний вручную осуществляли с помощью пипетки на 10 мкл и светового микроскопа Stereozoom ^® S4E (Leica Microsystems). Отдельные колонии идентифицировали под микроскопом и вручную отделяли. Колонии высевали в одну лунку 96-луночного планшета для культуры ткани, покрытого Matrigel ^® (Sarstedt), содержащего среду для культивирования клеток E8 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK.

Для сортировки клеток использовали проточный сортировщик Sony SH800 для сортировки GFP-положительных (указывающих на успешное проникновение плазмиды Cas9) отдельных клеток, которые затем высевали на каждую лунку 96-луночных планшетов, содержащих среду для культивирования клеток E8 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK. .Во время ручного отбора и сортировки клеток среду обновляли каждые 48 ч (без ингибитора ROCK и пуромицина), и колонии выращивали до достижения слияния 70–80%.

Скрининг всех выживших клонов на основе ПЦР

Геномную ДНК

(гДНК) из всех выживших колоний, происходящих из отдельных колоний или клеток, выделяли с использованием буфера для лизиса прямой клеточной ПЦР (Viagen Biotech) с добавлением 20 мкг / мл протеиназы K (Thermo Fisher Technologies). ГДНК служила матрицей для идентификации клеточных линий с биаллельной или моноаллельной делецией с использованием специфической ПЦР-скрининга на основе пары праймеров с использованием ДНК-полимеразы золота AmpliTaq (Thermo Fisher Scientific).Условия для скрининга ПЦР приведены в дополнительном материале, используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице 2.

Целевое секвенирование

MKRN3 KO клеточных линий

гДНК из клеточных линий WT и MKRN3 KO амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами на 200 п.о. выше и ниже MKRN3 , и продукт очищали с использованием набора для очистки A’SAP PCR clean up kit (Arcticzymes) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные продукты ПЦР подвергали секвенированию следующего поколения с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК Nextera (Illumina Technologies), выполненного в Институте молекулярной медицины Финляндии (FIMM, Хельсинки).Данные целевого секвенирования анализировали с помощью инструмента Integrative Genomics Viewer (IGV) от института Broad (27). Праймеры, использованные для целевого секвенирования MKRN3 , перечислены в дополнительной таблице 2.

Дифференциация hPSC с

GNRh2 -экспрессирующие нейроны

При конфлюэнтности> 90% и WT, и MKRN3 KO hPSC были дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , как описано у Lund et al. (17). Вкратце, клетки обрабатывали 2 мкМ дорсоморфина (Selleckchem) и 10 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich) в течение 10 дней для образования нейроэктодермы, еще 10 дней — 100 нг / мл FGF8 (Peprotech) и дифференцировки в пост- митотические нейроны стимулировали ингибированием Notch с использованием 20 мкМ DAPT (Sigma-Aldrich).Успешная дифференцировка в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , была подтверждена морфологическим анализом, окрашиванием антител для идентификации клеток, экспрессирующих GnRH, и количественной ПЦР.

Выделение РНК и обратная транскрипция

Экстракцию РНК

(Nucleospin RNA, Machery-Nagel) и синтез кДНК обратной транскрипцией (набор iScript ™ cDNA, BIO-RAD) проводили в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что обработка ДНКазой во время экстракции РНК выполнялась отдельно с помощью RQ1 DNase (Promega) , 1 ед / мкг РНК, в присутствии ингибитора РНКазы (Promega).Обратную транскрипцию выполняли в обычном термоциклере с 1 мкг общей РНК с использованием смеси iScript ™, содержащей смесь праймеров олиго (dT) и случайного гексамера. Условия проведения ОТ-ПЦР приведены в дополнительных материалах.

Анализ

GNRh2 Экспрессия

Уровни экспрессии гена GNRh2 измеряли с помощью кПЦР, нормализовали по циклофилину G ( PPIG ) и сравнивали с экспрессией в недифференцированных PSC, как описано ранее (17).Нормальный диапазон экспрессии мРНК GNRh2 в клетках WT был определен на основе девяти экспериментов по дифференцировке ( n = 9). День 25 был использован для характеристики экспрессии GNRh2 в нашем протоколе (17), и тот же день был выбран здесь для сравнения клеточных линий WT ( n = 9) и MKRN3 KO ( n = 6). во всех экспериментах. Условия для количественной ПЦР приведены в дополнительном материале, праймеры, используемые в КПЦР, перечислены в дополнительной таблице 2.

Иммуноцитохимия

Клетки фиксировали с использованием 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) и в течение 7 минут подвергали проницаемости в 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), разведенном в PBS. Неспецифическое связывание блокировали с помощью UltraVision Protein Block (Thermo Fisher Scientific) в течение 10 мин. Инкубацию первичного антитела проводили в течение ночи при 4 ° C, а вторичного антитела — в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела разводили в PBS, содержащем 0,1% Твин 20 (Sigma-Aldrich). Слайды монтировали с использованием монтажной среды VECTASHIELD ^® с DAPI (Vector Laboratories) для контрастного окрашивания ядер, а микроскопические изображения получали с помощью ZEISS Axio Imager.Прямой эпифлуоресцентный микроскоп Z2 (Zeiss) с использованием объективов 10x / NA 0,3 и 20x / NA 0,8 EC PL APO CS2 (Biomedicum Imaging Unit) и проанализирован с помощью ImageJ (NIH). Все антитела и разведения перечислены в дополнительной таблице 3.

Создание стабильной экспрессии клеточной линии и клеточной культуры для исследований белок-белкового взаимодействия в HEK

Для создания стабильных и индуцируемых клеточных линий клонирование шлюза (28) было использовано для создания вектора экспрессии MKRN3 . MKRN3 ПЦР-продукт с фланкирующими сайтами связывания (attB) и донорский вектор с сайт-специфическими сайтами связывания (attP) рекомбинировали реакцией ВР для получения входного клона, совместимого со шлюзом. Рекомбинация между сайтами attB и attP приводит к сайтам attL и attR, которые рекомбинируются реакцией LR между входными клонами и вектором назначения MAC-C (20) для создания вектора экспрессии MKRN3, меченного MAC. Клеточные линии Flp-In ™ 293 T-REx (Invitrogen, Life Technologies, R78007) котрансфицировали вектором экспрессии и вектором pOG44 (Invitrogen) с использованием реагента DreamFect ™ (Oz Biosciences).Через два дня после трансфекции культуральную среду меняли на DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% FBS, 50 мг / мл пенициллина, 50 мг / мл стрептомицина (Sigma-Aldrich) и гигромицина B (Thermo Fisher Scientific) (100 мкг / мл). Селекцию гигромицина B на изогенные клоны проводили в течение 2 недель.

Стабильная клеточная линия была увеличена до планшетов 30 × 150 мм. Когда клетки достигли 80% слияния, добавляли 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma-Aldrich) на 24 часа для экспрессии MKRN3, меченного MAC.Для мечения биотинилированием (BioID) дополнительно добавляли 50 мкМ биотина (Thermo Fisher Scientific) одновременно с тетрациклином. Клетки, полученные из полностью конфлюэнтных чашек размером 5 × 150 мм (приблизительно 5 × 10 ⁷ клеток), осаждали в виде одной биологической повторности. Было собрано три биологических повтора для каждого условия и всего шесть биологических повторов для двух различных условий (с биотином и без него). Образцы были мгновенно заморожены при -80 ° C до дальнейшего использования.

Аффинная очистка белковых комплексов и масс-спектрометрия (МС)

Клетки с индукцией только тетрациклином использовали для аффинной очистки (29).Клетки, обработанные тетрациклином и биотином, использовали для очистки BioID, как описано ранее (20). Очищенные белковые комплексы (AP-MS) / белки (BioID) обрабатывали и расщепляли до пептидов для анализа MS. Анализ выполняли на гибридном масс-спектрометре Qrbitrap Elite с использованием Xcalibur версии 2.0.7 SP1 (Thermo Scientific) в сочетании с системой ВЭЖХ с обращенной фазой EASY nLC 1000 через ионизационный распылитель с электрораспылением (Thermo Fisher Scientific). МС выполняли в режиме сбора данных, зависящем от данных, с использованием полного сканирования масс-спектрометрии с преобразованием Фурье (300–1700 m / z) с разрешением 60 000 и сканированием вызванной столкновением диссоциации 20 наиболее распространенных ионов.

Обработка данных

Для идентификации белков файлы Thermo.RAW были проверены по выбранной базе данных UniProtKB / SwissProt человека (http://www.uniprot.org/, версия 2017-02) с помощью поисковой системы SEQUEST. База данных-приманка была противоположной целевой базе данных. Все данные были представлены с доверительной вероятностью 95% для идентификации белка, как определено с вероятностью ложного обнаружения (FDR) ≤5%. Хранилище загрязняющих веществ для аффинной очистки (CRAPome, http: //www.crapome.org /) (30) база данных и собственная база данных образцов GFP использовались в качестве контролей с частотой отсечения 20% (411 запусков из базы данных CRAPome и 100 запусков собственных контрольных образцов GFP) для идентификации взаимодействий с высокой степенью достоверности. (HCI). Данные HCI были импортированы в Cytoscape 3.4.0 для построения сети взаимодействия белков. Известные данные о взаимодействии жертвы с жертвой были получены из базы данных IMEx (http://www.imexconsortium.org/) (31). Анализ классификации онтологии генов был основан на биоинформатическом ресурсе DAVID (https: // david.ncifcrf.gov/) (32). Мы также сравнили HCI-партнеров MKRN3 с белками, кодируемыми 371 геном, которые связаны со сроками полового созревания в соответствии с крупными популяционными исследованиями (33, 34). Кроме того, мы исследовали HCIs к белкам, кодируемым 37 генами, участвующими в врожденном гипогонадотропном гипогонадизме (CHH) (35-40).

Статистика

Относительную экспрессию GNRh2 в клеточных линиях WT H9 и MKRN3 KO Del 1 и Del 2 тестировали с помощью неспаренного t -теста после логарифмического преобразования для нормализации распределений. P Значение <0,05 было принято для обозначения статистической значимости.

Результаты

Генерация на основе CRISPR / Cas9

MKRN3 KO клеточных линий в hPSC

Чтобы исследовать влияние дефицита MKRN3 на дифференцировку нейронов, экспрессирующих GNRh2 , мы сгенерировали две линии hPSC с биаллельными делециями MKRN3 с использованием CRISPR / Cas9. Были созданы биаллельные линии клеток KO, поскольку гетерозиготные мутации MKRN3 вызывают СРР только при наследовании от отца, и мы не могли избирательно нацелить желаемую делецию на отцовский аллель.На схеме показаны направляющие нацеленные области и делеции в этих клеточных линиях (рис. 1А). Вкратце, две пары направляющих РНК, охватывающих разную длину на единственном экзоне MKRN3 вместе с Cas9, приводили к делециям -174 или -901 п.н. Для дальнейших исследований мы выбрали две явно гомозиготные линии KO Del 1 (небольшая делеция, -174 п.н.) и Del 2 (большая делеция, -901 п.н.), которые были проверены на наличие желаемых делеций с помощью ПЦР (рис. 1B) и целевого секвенирования. Дополнительные рисунки 1, 2).Отсутствие функциональной экспрессии MKRN3 было дополнительно подтверждено путем проведения ПЦР с кДНК из линий клеток WT и MKRN3 KO в качестве матрицы и с праймерами, фланкирующими делеционные области (рис. 2А). Длина транскриптов, полученных из клонов KO, соответствовала размеру делеций, наблюдаемых на уровне ДНК (фиг. 2B), что соответствует биаллельной делеции в кодирующей области MKRN3 .

Рисунок 1 . Генерация на основе CRISPR / Cas9 двух биаллельных линий клеток KO MKRN3 (Del 1 и Del 2) в линии плюрипотентных стволовых клеток человека H9 и проверка делеций, индуцированных CRISPR / Cas9 на уровне геномной ДНК. (A) Левая панель, Del 1 имеет делецию 174 п.н., что переводится в делецию 51 аминокислоты (11% белка), включая сайт начала трансляции. Правая панель, Del 2 имеет делецию 901 п.н., что соответствует делеции 300 аминокислот (60% белка). (B) Наличие или отсутствие CRISPR / Cas9-индуцированных делеций в MKRN3 было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации интересующей области из геномной ДНК плюрипотентных клеток H9 человека дикого типа и в клетках, отредактированных CRISPR / Cas9.Показаны четыре примера отредактированных клеточных линий (Del 1 – Del 4). Та же самая пара направляющих РНК, предназначенная для удаления ~ 900 п.н., была использована для редактирования клеточных линий Del 2 и Del 3, тогда как две разные пары гРНК были использованы для редактирования клеточных линий Del 1 и Del 4. Продукты ПЦР визуализировали на 1,5% агарозном геле.

Рисунок 2. (A) Схема кДНК MKRN3 и двух пар праймеров (зеленые и синие стрелки), используемых для обнаружения WT, Del 1 (левая панель) и Del 2 (правая панель).Сотовые линии. В клетках WT ожидаемые размеры продукта составляют 305 и 1235 п.н., в ячейках Del 1 131 п.о. и в ячейках Del 2 334 п.н. (B) амплификация MKRN3 из кДНК двух биаллельных линий клеток с делецией MKRN3 Del 1 (левая панель) и Del 2 (правая панель). Белая стрелка указывает ожидаемые размеры продуктов дикого типа (WT) (305 и 1235 п.н. соответственно), а красные стрелки указывают ожидаемые размеры (131 и 334 п.о. соответственно) для продуктов ПЦР из клеточных линий Del 1 и Del 2.Используемая кДНК относится к 25-му дню протокола, генерирующего GNRh2 -экспрессирующих нейронов. Продукты ПЦР визуализировали на 1,5% агарозном геле.

Дифференциация

MKRN3 KO и WT hPSC с GNRh2 — Экспрессирующие нейроны

Затем мы дифференцировали MKRN3 KO клеточных линий Del 1 и Del 2 в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , в соответствии с нашим недавно описанным протоколом (рис. 3A) (17). Обе клеточные линии могут быть дифференцированы в нейрональные предшественники и далее в нейроны, экспрессирующие GNRh2 (рис. 3В).На 25 день дифференцировки относительная экспрессия мРНК GNRh2 между клеточными линиями MKRN3 KO и клетками WT H9 (рис. 3C) не различалась ( P = NS). Уровни экспрессии мРНК OTX2 , регулятора транскрипции GNRh2 (41), вместе с OTX1 , оба из которых обогащены GnRH-нейронами мышей (42), существенно не различались между WT и Del 2 ( n = 3) клеток на 25 день протокола дифференцировки (дополнительный рисунок 3).

Рисунок 3. (A) Схема генерации GNRh2 -экспрессирующих нейронов из hPSC (17). Вкратце, двойное ингибирование SMAD с помощью дорсоморфина и SB431542 применялось в течение первых 10 дней, затем следовали 10 дней лечения FGF8 и заключительная стадия созревания нейронов в течение 5-7 дней путем комбинирования FGF8 с ингибированием Notch с помощью DAPT. Эта методология дифференциации была адаптирована из ранее опубликованного протокола, а рисунок был изменен по сравнению с исходной публикацией Lund et al.(17). (B) Иммуноцитохимия в WT и Del 2, полученных на 25-й день GnRH-положительных нейронов (зеленый), ядерное окрашивание DAPI (синий), масштабные полосы представляют 100 мкМ. (C) Относительная экспрессия GNRh2 в клетках WT H9 ( n = 9) и в двух биаллельных линиях клеток MKRN3 KO (Del 1 и Del 2) после трех независимых повторов ( n = 6) дифференцировки в нейроны, экспрессирующие GNRh2 (17). Уровни экспрессии относятся к hPSC 0 дня.

MKRN3 и его партнеры по взаимодействию с белками

Используя анализ MS, мы идентифицировали 104 HCI, включая как временные, так и стабильные взаимодействия для MKRN3 (дополнительная таблица 4). Эти 104 HCI всего для 81 уникального HCI (рис. 4) были классифицированы на функциональные группы в соответствии с их категориями аннотации, участвующими в различных путях, регулирующих клеточные процессы, в основном регуляции секреции инсулина, межклеточной адгезии, регулируемого TP53 клеточного метаболизма, транскрипции. репрессия и взаимодействующие факторы, связанные с активностью РНК (32).Важно отметить, что наши данные MS показали, что MKRN3 физически взаимодействует с 19 белками (включая LIN28B), кодируемыми генами, которые ранее были связаны с возрастом наступления менархе (33, 34). Кроме того, данные MS идентифицировали OTUD4, белок, участвующий в CHH (43), в качестве партнера HCI для MKRN3.

Рисунок 4 . Карта белок-белкового взаимодействия MKRN3. Сеть представляет собой PPI MKRN3, обнаруженные различными методами очистки. Синие края представляют экспериментально подтвержденное взаимодействие AP-MS; Красные линии представляют взаимодействия, обнаруженные с помощью очистки BioID; Перекрытие двух методов очистки показано серым цветом, а пунктирная линия описывает взаимодействия жертва-жертва.Цветные узлы представляют различные кластеры белков-жертв.

Обсуждение

У мышей экспрессия Mkrn3 снижается во время постнатального развития, а у людей уровни циркулирующего MKRN3 снижаются к началу полового созревания у обоих полов (44, 45). Однако исследование периферических уровней MKRN3 не позволяет механистически объяснить роль MKRN3 в регуляции полового созревания у людей. Поэтому мы использовали наш недавно описанный протокол дифференцировки, генерирующий GNRh2- экспрессирующих нейронов (17) и генно-инженерные hPSC, чтобы исследовать, требуется ли MKRN3 для дифференцировки нейронов GnRH в этой модели.Кроме того, мы исследовали PPI-партнеров MKRN3 в клетках HEK и уделили особое внимание возможным интеракторам, кодируемым генами, связанными с половым созреванием.

Хотя в нескольких исследованиях сообщалось, что наследуемые отцовские мутации в MKRN3 вызывают CPP (46), лежащие в основе механизмы еще предстоит объяснить (1, 2). В нашем исследовании мы сначала изучили роль MKRN3 в экспрессии GNRh2 с использованием двух биаллельных клональных клеточных линий MKRN3 KO (Del 1 и Del 2), созданных с помощью технологии CRISPR / Cas9.Эти клеточные линии впоследствии были дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , с помощью нашего недавно описанного протокола дифференцировки, который основан на двойном ингибировании SMAD, лечении FGF8 и ингибировании Notch (17). Наши результаты показывают, что обе клеточные линии Del 1 и Del 2 могут быть успешно дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , что позволяет предположить, что MKRN3 является незаменимым для дифференцировки. Интересно, что экспрессия GNRh2 клеточных линий Del 1 и Del 2 не отличалась от контрольных, что предполагает, что MKRN3 не изменяет напрямую экспрессию GNRh2 .Однако постнатально существует множество экологических и метаболических сигналов, которые могут регулировать дальнейшее созревание и функцию нейронов ГнРГ (47, 48). Хотя MKRN3 не влияет на дифференцировку нейронов GnRH или их способность экспрессировать GNRh2 в нашей модели, существуют и другие потенциальные механизмы, с помощью которых MKRN3 может регулировать функцию нейронов GnRH. Например, основная регуляция активности нейронов GnRH осуществляется нейронами Kisspeptin и KNDy в гипоталамусе, и предполагаемая роль MKRN3 в этих нейронах неизвестна.Возможность других MKRN компенсировать потерю MKRN3 в клеточных линиях Del 1 и Del 2 не может быть исключена. С другой стороны, моделирование заболеваний на основе hPSC является наиболее близким доступным подходом к моделированию нейрональных расстройств человека (49), а что касается MKRN3, модели на мышах еще не описаны. Однако до сих пор известно, что MKRN3 существенно не обогащается или истощается в нейронах GnRH мыши (42).

Учитывая, что мы не смогли найти механистический признак роли MKRN3 в экспрессии GNRh2 в нашей модели стволовых клеток, мы рассмотрели альтернативные подходы, чтобы понять, как эта предполагаемая E3-лигаза может влиять на время полового созревания.Вкратце, метод исследования PPI использует систему MAC-тегов, которая содержит аффинные теги для аффинной очистки-масс-спектрометрии (AP-MS), а также биотинлигазу BirA * для BioID. Следовательно, одной конструкции достаточно для идентификации как стабильных, так и временных взаимодействий (20). Мы не проводили исследования PPI в нашей модели стволовых клеток, поскольку эффективное клонирование всех различных меченых конструкций MKRN3 в hPSCs выходило за рамки данной работы. Хотя это потенциальное предостережение, важно отметить, что клетки HEK, одна из наиболее широко используемых линий клеток человека в биомедицинских исследованиях (50), не являются непригодными для наших целей, поскольку они проявляют некоторые нейронные свойства (23).Кроме того, наша лаборатория обладает огромным опытом в использовании платформы на основе линии клеток HEK, которая позволяет быстро и эффективно создавать конструкции экспрессии и последующий анализ данных. Основываясь на списке белков HCI для MKRN3, мы обнаружили, что MKRN3 может участвовать в межклеточной адгезии, метаболизме РНК и секреции инсулина. Было высказано предположение, что инсулин изменяет функцию нейронов ГнРГ у людей, и считается, что чувствительность к инсулину является важным фактором в инициации полового созревания (1, 51, 52).MKRN3 взаимодействует с группой белков, кодируемых метаболическими генами, которые, в свою очередь, регулируются TP53, геном-супрессором опухоли, участвующим в нескольких формах рака и участвующим в половом созревании (53). Другие PPI-партнеры MKRN3 участвуют в транспорте и метаболизме РНК, что остается менее изученной областью с точки зрения полового созревания.

Кроме того, мы обнаружили, что MKRN3 взаимодействует с 20 белками, кодируемыми генами, связанными с периодом полового созревания, из которых LIN28B является одним из наиболее установленных генов, связанных с половым созреванием в генетических исследованиях (54, 55), а OTUD4 представляет собой единственный ген заболевания, родственного ему (43).Хотя LIN28B был связан с возрастом начала менархе, ростом взрослого и детским ростом (56–60) и, как известно, является негативным регулятором микроРНК класса let-7 (61), механизм, с помощью которого он регулирует половое созревание. сроки неизвестны (1, 62, 63). У крыс и нечеловеческих приматов экспрессия Lin28b снижается в гипоталамусе в период полового созревания (64), а у мышей экспрессия как Lin28b , так и Mkrn3 снижается до наступления половой зрелости (7, 65). Наши результаты свидетельствуют о физическом взаимодействии между человеческими LIN28B и MKRN3, и есть соблазн предположить, что они могут действовать согласованно, чтобы регулировать время полового созревания.Мы также исследовали взаимодействия MKRN3 среди 37 генов, участвующих в CHH (35-40), и обнаружили, что MKRN3 взаимодействует с OTUD4. OTUD4 представляет собой ген, кодирующий деубиквитиназу (43), и интересно предположить, что он может регулировать время полового созревания, противодействуя эффектам MKRN3. Для подтверждения этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования. Наконец, MKRN3 взаимодействует с другими генами цинковых пальцев (ZNF), которые являются репрессорами транскрипции и играют важную роль в период полового созревания (66), однако мы не смогли наблюдать взаимодействие MKRN3 с ZNF, критическими для наступления полового созревания, такими как ZNF573 и GATAD1 (66). .Даже в этом случае наблюдаемые взаимодействия предполагают возможность того, что MKRN3 является эпигенетическим репрессором транскрипции, участвующим в определении времени полового созревания.

В заключение, наши результаты предполагают, что MKRN3 является незаменимым для процесса дифференцировки нейронов GnRH и экспрессии GNRh2 во время дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека. Хотя механизм, с помощью которого MKRN3 регулирует половое созревание человека, остается неясным, наши результаты предполагают, что MKRN3 может действовать согласованно с ранее идентифицированными белками, связанными с половым созреванием, и заманчиво предположить, что это взаимодействие транслируется в функциональное сотрудничество с точки зрения полового созревания. сроки.Необходимы дальнейшие исследования, прежде чем мы поймем, как и почему ось HPG активируется преждевременно у детей с унаследованными от отца мутациями потери функции в MKRN3 .

Авторские взносы

VY, SV, TT и TR планировали проект. TT, MV и TR руководили проектом. VY, CL, KP и KL выполняли работу со стволовыми клетками. XL и MV разработали исследование взаимодействия белков. XL и JK проводили работу по взаимодействию с белками. В.Ю. написал рукопись, а Т.Р. отредактировал рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана Академией Финляндии, Фондом педиатрических исследований, Фондом Сигрид-Юселиуса, Фондом Ново Нордиск, Ялмари Я Рауха Ахоккаан Сяэтио, Хельсинкским университетом и Центральной больницей Хельсинкского университета.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джера Велтнера, Диего Бальбоа и Центр стволовых клеток Biomedicum за их поддержку. Мы благодарим Biomedicum Imaging Unit за предоставленную возможность для микроскопии. Благодарим Аннику Таркканен за вычитку рукописи.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2019.00048/full#supplementary-material

Сокращения

CPP, центральное преждевременное половое созревание; MKRN3, белок 3 макорин безымянного пальца; hPSCs, плюрипотентные стволовые клетки человека; WT, дикий тип; КО, нокаут; CRISPR, сгруппированные регулярно чередующиеся палиндромные повторы; Cas9, белок, связанный с CRISPR 9; п.н., пары оснований; гРНК, матрица ДНК-направляющей РНК; GFP, зеленый флуоресцентный белок; ИПП, белок-белковое взаимодействие; HCI, уверенные взаимодействия; CHH, врожденный гипогонадотропный гипогонадизм.

Список литературы

2. Latronico AC, Brito VN, Carel JC. Причины, диагностика и лечение центрального преждевременного полового созревания. Ланцет Диабет Эндокринол. (2016) 4: 265–74. DOI: 10.1016 / S2213-8587 (15) 00380-0