Вертикаль северск расписание: Фитнес клуб «Вертикаль» г. Северск :: Расписание old

Содержание

Центр женского здоровья, г. Северск

Поздравляем нашего врача

Брагину Ольгу Дмитриевну
С защитой докторской диссертации и присвоением звания доктора медицинских наук!!!

Коллектив ЦЖЗ

29.06.2021

Акция

Аутоплазменная терапия в гинекологии до 31 декабря со скидкой 30%.
Аутоплазменная терапия (одна пробирка) 3600 2700 р.
Аутоплазменная терапия (две пробирка) 5000 3400 р.
Услуга выполняется после консультации врача гинеколога.
Подробнее об услуге …

21.04.2021

Новый врач

Приступает к работе врач терапевт высшей категории
Ефимова Ольга Александровна

21.04.2021

Новый врач

Начинает вести прием врач акушер-гинеколог первой категории
Попова Наталья Владимировна:

  • Консультативный прием
  • Ведение беременности
  • Кольпоскопия
  • УЗИ органов малого таза

15. 01.2021

Эндокринология

Вновь начинает вести прием врач эндокринолог
Горбач Гэрэлма Геннадьевна:

  • Консультативный прием
  • Пункция щитовидной железы
  • Контроль сахарного диабета
    подробнее…
  • Инсулиновые помпы

18.11.2020

Новая услуга

Перинеометрия с помощью цифрового перинеометра XFT-0010
Подробнее об услуге …

27.10.2020

Работники АО СХК!

Для Вас в 2020 году продолжается программа «Диспансеризация» (гинекология, маммология)
По вопросам получения услуги обращайтесь в страховую компанию «СОГАЗ»

17.01.2020

ОМС

С 2017 года работаем в системе ОМС

Подробнее…

12.04.2017

Работники ООО «Томскнефтехим»!

Приглашаем Вас пройти обследования в нашем центре в рамках договора со страховой компанией «СОГАЗ»

Обязательно наличие гарантийного письма.

21.08.2015

Центр женского здоровья, г. Северск

Гинекологи
Фролова Людмила Анатольевна
акушер-гинеколог-эндокринолог, главный врач Центра
пн, чт — с 14:10 до 18:10
вт, ср, пят — с 9:30 до 13:30
Блажевич Евгения Сергеевна
акушер-гинеколог-эндокринолог
пн, ср, чт, пят — с 14:00 до 19:00
вт, сб — с 9:00 до 14:00
Козлова Оксана Александровна
акушер-гинеколог-эндокринолог
пн, чт, сб — с 9:00 до 14:00
вт, ср, пят — с 14:00 до 19:00
Мазгалина Анастасия Юрьевна
акушер-гинеколог-эндокринолог высшей категории
вт — с 16:00 до 19:00
Маммологи
Брагина Ольга Дмитриевна
онколог-маммолог, к.м.н.
вт — с 15:00 до 19:00
Новикова Сабина Григорьевна
онколог-маммолог
пят — с 15:50 до 18:10
УЗ-диагносты (УЗИ)
Зинченко Светлана Алексеевна
врач УЗ-диагностики
пн — с 9:00 до 12:00
сб — с 9:00 до 13:00
Комарова Людмила Александровна
врач УЗ-диагностики высшей категории
пн, ср, чт, пят — с 16:00 до 19:00
Неплохова Наталья Модестовна
врач УЗ-диагностики
вт, чт — с 9:00 до 12:00
Панасенко Ольга Владимировна
врач УЗ-диагностики высшей категории
вт — с 14:30 до 19:00
Разаренова Татьяна Георгиевна
врач УЗ-диагностики, к.м.н.
пн, ср, пят — с 9:00 до 15:00
вт — с 9:00 до 14:00
чт — с 12:00 до 15:00
Сай Марина Георгиевна
врач УЗ-диагностики высшей категории
ср, пят — с 9:30 до 13:00
Скрипникова Ольга Владимировна
врач УЗ-диагностики (суставы, сосуды)
пн, вт, ср, чт, пят — с 13:00 до 16:00
Сморгон Андрей Владимирович
врач УЗ-диагностики (сердце)
сб — с 9:00 до 12:00
Неврологи
Кудрявцева Светлана Валентиновна
невролог
пн — с 16:10 до 19:00
Сосудитый хирург
Проскоков Игорь Алексеевич
сосудистый хирург высшей категории
пн — с 16:10 до 19:00прием раз в две недели
Эндокринологи
Фаустова Елена Вячеславовна
эндокринолог высшей категории
ср, чт — с 15:00 до 19:00
Горбач Гэрэлма Геннадьевна
эндокринолог первой категории
пн с 15:00 до 19:00
ср, пят, сб — с 9:00 до 13:00
Терапевт
Ефимова Ольга Александровна
терапевт высшей категории
вт — с 9:50 до 12:00
чт — с 16:00 до 19:00
Терапевт/ревматолог
Мозгалина Ольга Викторовна
терапевт/ревматолог
сб — с 9:00 до 11:40

Расписание Олимпия – ДЮСШ им. Л.Егоровой

Малая чаша плавательного бассейна МСК «Олимпия»
09:30 — 10:15Панова
О.С.
(4-6 лет)
10.30-11.15Ушаков
Д.А.
(5-10 лет)
Панова
О.С.
(4-6 лет)
11.30-12.15Ушаков
Д.А.
(5-10 лет)
Панова
О.С.
(7-12 лет)
12.30-13.15Цыплакова О.В. (4-6 лет)
13.30-13.15Корчагина Г.Н.
«Без границ»
14.30-13.15Корчагина Г.Н.
ВОС
15.30-13.15Гуркова О.С.
СОГ
Глазкина Т.И.
СОГ
16.30-17.15Корчагина Г.Н.
ВОС
Корчагина Г.Н.
«Без границ»
Глазкина Т.И.
СОГ
Корчагина Г.Н.
«Без границ», ВОС
Глазкина Т.И.
СОГ
Глазкина Т.И.
СОГ
17.30-18.15Гуркова О.С. (5-7 лет)Глазкина Т.И.
СОГ
Глазкина Т.И. (3-5 лет)Глазкина Т.И.
СОГ
Глазкина Т.И. (3-5 лет)Глазкина
Т.И.
(3-5 лет)
18.30-19.15Гуркова
О.С.
(7-12 лет)
Ушаков
Д.А.
(5-10 лет)
Панова
О.С.
(7-12 лет)
Ушаков
Д.А.
(5-10 лет)
Панова
О.С.
(4-6 лет)
Глазкина Т.И.
СОГ
19.30-20.15Панова
О.С.
(4-6 лет)
Гуркова О.С. (5-7 лет)Панова
О.С.
(4-6 лет)
Панова
О.С.
(4-6 лет)
Большая чаша плавательного бассейна МСК «Олимпия»
13.00-14.00Ушаков Д.А.
14.00-15.00Панова
О.В.
16.00-17.00Новиченко О.И.Новиченко О.И.Новиченко О.И.
17.00-18.00Ушаков Д.А.Ушаков Д.А.Панова
О.В.
18.00-19.00Гуркова О.С.
20.00-21.00Новиченко Д.О.Новиченко Д.О.Новиченко Д.О.

Расписание — МБУДО «Художественная школа»

Программа,
срок обуч.

«Живопись», 8 лет
предпрофессиональная

«Живопись», 5 лет
предпрофессиональная

КЛАСС VII — А VII — В 4-В 5-В 5-Г 5-Д 5-Е

Классн.
руковод.

Карпова
Алёна
Вячеславовна
Карпова
Алёна
Вячеславовна
Кулагина
Наталья
Викторовна

Кулагина
Наталья
Викторовна

Кулагина
Наталья
Викторовна

Петухова
Алла
Анатольевна

Петухова
Алла
Анатольевна

ПН.

ул.Куйбышева,12
16.10 — 16.50
история иск.
17.00 — 18.20
скульптура
ул.Куйбышева,12
17.50 — 18.30
история иск.
18.40 — 20.00
скульптура
15.10 — 17.30
композиция
каб.2

 

17.40 — 20.00
рисунок
каб.2

15.10 — 17.30
живопись
каб.6

17.40 — 20.00
живопись
каб.6

ВТ.

15.10 — 17.30
рисунок
каб.3
17.40 — 20.00
рисунок
каб.3
16.50 — 20.00
рисунок
каб.2

ул.Куйбышева,12
15.00 — 16.00
история иск.
16.10 — 17.30

компьют.граф.

ул.Куйбышева,12
17.40 — 19.00
компьют.граф.
19.10 — 20.10
история иск.

15.10 — 17.30
рисунок
каб.6

17.40 — 20.00
рисунок
каб.6

СР.

    ул.Куйбышева,12
17.40 — 18.20
история иск.
18.30 — 20.00
скульптура
   

 

 

ЧТ. 15.10 — 17.30
композиция
каб.3
17.40 — 20.00
композиция
каб.3

17.40 — 20.00
живопись
каб.2
Родченкова Н.Г.

15.10 — 17.30
композиция
каб.1
17.40 — 20.00
композиция
каб.1
ул.Куйбышева,12
16.00 — 17.30
компьют.граф.
17.40 — 18.40
история иск.
ул.Куйбышева,12
17.40 — 19.00
компьют.граф.
19.10 — 20.10
история иск.

ПТ.

15.10 — 17.30
живопись
каб.3
17.40 — 20.00
живопись
каб.3
 

15.10 — 17.30
живопись
каб.2

17.40 — 20.00
живопись
каб.2

15.10 — 17.30
композиция
каб.6
17.40 — 20.00
композиция
каб.6

СБ.

ул.Куйбышева,12
10.00 — 13.10
рисунок
каб.7
2-я суббота мес.
ул.Куйбышева,12
13.20 — 16.30
рисунок
каб.7
2-я суббота мес.
  12.30-15.40
рисунок

каб. 2

12.30-15.40
рисунок

каб. 2
4-я суббота мес.

 15.00-18.10
рисунок

каб. 6
2-я суббота мес.

 15.00-18.10
рисунок

каб. 6
3-я суббота мес. 

границ | MKRN3 взаимодействует с несколькими белками, влияющими на время полового созревания, но не влияет на экспрессию GNRh2

Введение

Начало полового созревания зависит от реактивации секреции гипоталамического гонадолиберина, что приводит к повышенной секреции гонадотропинов и половых стероидов, вторичным половым признакам и достижению взрослого роста и фертильности (1, 2). У пациентов с центральным преждевременным половым созреванием (CPP) половое созревание начинается в возрасте до 8 лет у девочек (стадия груди 2 по Таннеру) и до 9 лет у мальчиков (стадия гениталий по Таннеру G2) (1, 3, 4).Преждевременная центральная активация секреции GnRH может быть патологической из-за внутричерепных поражений или идиопатической, когда не может быть идентифицирована основная причина (4). У девочек ежегодная заболеваемость ХПН варьировала от 15 до 29 на 100 000 (5), а общий риск и заболеваемость у девочек выше, чем у мальчиков (2, 3, 6).

Генетическая этиология идиопатического CPP до конца не изучена, но клинически наиболее значимым геном, лежащим в основе CPP, является ген белка 3 безымянного пальца макорина ( MKRN3) (7–11). MKRN3 — это одноэкзонный, материнский импринтированный ген, который экспрессируется только от отцовского аллеля (12). Следовательно, только наследуемые отцовские мутации потери функции в MKRN3 вызывают CPP (7, 11). MKRN3 принадлежит к семейству макоринов убиквитинлигаз вместе с MKRN1 и MKRN2 . MKRN3 является близким родственником MKRN1 , являясь безинтронной ретрокопией последнего (12, 13). Подобно другим членам семейства макоринов, MKRN3 также состоит из трех доменов цинкового пальца (C3H), одного домена цинкового кольца пальца (C3HC4) и одного MKRN3-специфичного домена Cys-His (CH) и повсеместно экспрессируется в тканях плода и взрослого человека ( 13, 14).Основываясь на своей структуре, предполагается, что MKRN3 функционирует как предполагаемая E3-ubiquitin ligase и потенциально влияет на экспрессию генов, целевую деградацию белка и модуляцию функции белка посредством своей активности E3 ligase (12-15). Интересно, что MKRN3 экспрессируется в гипоталамусе мышей и человека (7, 8), но механистические процессы, с помощью которых отцовская унаследованная мутация потери функции MKRN3 вызывает CPP, в настоящее время неясны.

Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSC) обладают неограниченной способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (16).С этой целью мы недавно описали протокол дифференциации нейронов, экспрессирующих GNRh2 , от hPSC (17), который дает возможность исследовать роль генетических факторов в регуляции GNRh2 у людей. Кластерные регулярно расположенные друг от друга палиндромные повторы (CRISPR) и CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR / Cas9) стали преобладающей технологией в области редактирования генов (18). Вкратце, подход CRISPR / Cas9 состоит из короткой направляющей РНК (crRNA), слитой со специфической для бактерий трансактивирующей crRNA, называемой tracrRNA, которая обрабатывает crRNA, слияние crRNA и tracrRNA образует комплекс tracr: cr РНК, который управляет ферментом Cas9. к определенному локусу ДНК, образуя двухцепочечные разрывы (18).Эти двухцепочечные разрывы естественным образом восстанавливаются за счет склонного к ошибкам негомологичного соединения концов в отсутствие донорной матрицы (19). Мы использовали этот метод для создания биаллельных делеций MKRN3 в hPSC и дифференцировали нокаутные (KO) клеточные линии в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , используя наш недавно описанный протокол, включающий двойное ингибирование SMAD, обработку FGF8 и ингибирование Notch ( 17).

Большинство клеточных белков не функционируют изолированно, а выполняют свои биологические функции, взаимодействуя друг с другом (20).Белковые взаимодействия (PPI) образуют сеть, которая действует координированно, вызывая физиологическую активность в живой клетке (21). Масс-спектрометрия (МС) превратилась в эффективный метод анализа и характеристики PPI (20, 22). Для дальнейшего изучения предполагаемых механизмов, с помощью которых MKRN3 может влиять на время полового созревания, мы исследовали партнеров MKRN3 PPI в клетках HEK, используя наш недавно описанный подход на основе MS, который позволяет обнаруживать стабильные и временные партнеры взаимодействия для интересующего белка ( 20).Эта клеточная линия была выбрана в качестве модели, поскольку клетки HEK имеют определенные характеристики нейронов (23), широко доступны исследователям и часто используются в биомедицинских исследованиях.

Материалы и методы

Плюрипотентные стволовые клетки человека

В данном исследовании использовалась линия плюрипотентных стволовых клеток человека H9 [46, XX, (Wicell)] (24). hPSC поддерживали на чашках, покрытых Matrigel ® (BD Biosciences), с использованием среды StemPro (Thermo Fisher Scientific) или Essential 8 (Thermo Fisher Scientific).Во время поддержания клетки разделяли 0,5 мМ EDTA (Thermo Fisher Scientific, MA) и высевали в соотношении 1: 3–1: 8. Среду меняли ежедневно, и перед дифференцировкой клетки высевали на чашки, покрытые Geltrex (Thermo Fisher Scientific), и выращивали до> 90% конфлюэнтности.

Руководство по разработке и производству РНК

Руководства

CRISPR были разработаны с использованием https://benchling.com/ для нацеливания на единственный экзон MKRN3 . На основании их оценок отклонений от цели и специфичности были отобраны две пары лучших из возможных руководств.Матрицы ДНК-направляющих РНК (пРНК) были приготовлены с помощью амплификации ПЦР (гРНК-ПЦР) на основе ранее опубликованного метода (25). Вкратце, матрицы гРНК, имеющие выступы из 19 п.н. на 5′- и 3′-концах, были слиты с последовательностями промотора и терминатора U6 (tracr) с использованием упомянутой выше ПЦР с полимеразой Phusion (Thermo Fisher Scientific). Дополнительная информация о gRNA-PCR приведена в дополнительных материалах. Все олигонуклеотиды и направляющие последовательности, относящиеся к CRISPR, перечислены в дополнительной таблице 1.

Создание CRISPR / Cas9 на основе

MKRN3 KO Cell Lines

Для создания MKRN3 KO в hPSC, две гРНК, нацеленные на разные местоположения MKRN3 и плазмиду, кодирующую дикий тип (WT) Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9, далее Cas9), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и зеленый флуоресцентный белок (GFP) ген устойчивости подвергали электропорации в два миллиона клеток H9 с помощью системы трансфекции Neon в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific).Всего на электропорацию использовали 4 мкг плазмидной ДНК и 250 нг каждой гРНК, и электропорированные клетки высевали на чашки с покрытием Matrigel ® и добавляли 10 мкМ ингибитор ROCK (Y-27632 2HCl, Selleckchem) для увеличения выживаемости. чПСК путем ингибирования апоптоза, вызванного диссоциацией (26). Культуральную среду меняли каждые 24 часа с временным отбором выживших клонов с использованием 0,12 мкг / мл пуромицина (Sigma-Aldrich), начиная с 48 или 72 часов.

Сбор колоний или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)

После 48 часов отбора пуромицина появляющиеся колонии либо собирали вручную, либо отделяли отдельные клетки с использованием проточного сортировщика (Sony Biotechnology Inc.). Сбор колоний вручную осуществляли с помощью пипетки на 10 мкл и светового микроскопа Stereozoom ® S4E (Leica Microsystems). Отдельные колонии идентифицировали под микроскопом и вручную отделяли. Колонии высевали в одну лунку 96-луночного планшета для культуры ткани, покрытого Matrigel ® (Sarstedt), содержащего среду для культивирования клеток E8 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK.

Для сортировки клеток использовали проточный сортировщик Sony SH800 для сортировки GFP-положительных (указывающих на успешное проникновение плазмиды Cas9) отдельных клеток, которые затем высевали на каждую лунку 96-луночных планшетов, содержащих среду для культивирования клеток E8 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK. .Во время ручного отбора и сортировки клеток среду обновляли каждые 48 ч (без ингибитора ROCK и пуромицина), и колонии выращивали до достижения слияния 70–80%.

Скрининг всех выживших клонов на основе ПЦР

Геномную ДНК

(гДНК) из всех выживших колоний, происходящих из отдельных колоний или клеток, выделяли с использованием буфера для лизиса прямой клеточной ПЦР (Viagen Biotech) с добавлением 20 мкг / мл протеиназы K (Thermo Fisher Technologies). ГДНК служила матрицей для идентификации клеточных линий с биаллельной или моноаллельной делецией с использованием специфической ПЦР-скрининга на основе пары праймеров с использованием ДНК-полимеразы золота AmpliTaq (Thermo Fisher Scientific).Условия для скрининга ПЦР приведены в дополнительном материале, используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице 2.

Целевое секвенирование

MKRN3 KO клеточных линий

гДНК из клеточных линий WT и MKRN3 KO амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами на 200 п.о. выше и ниже MKRN3 , и продукт очищали с использованием набора для очистки A’SAP PCR clean up kit (Arcticzymes) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные продукты ПЦР подвергали секвенированию следующего поколения с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК Nextera (Illumina Technologies), выполненного в Институте молекулярной медицины Финляндии (FIMM, Хельсинки).Данные целевого секвенирования анализировали с помощью инструмента Integrative Genomics Viewer (IGV) от института Broad (27). Праймеры, использованные для целевого секвенирования MKRN3 , перечислены в дополнительной таблице 2.

Дифференциация hPSC с

GNRh2 -экспрессирующие нейроны

При конфлюэнтности> 90% и WT, и MKRN3 KO hPSC были дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , как описано у Lund et al. (17). Вкратце, клетки обрабатывали 2 мкМ дорсоморфина (Selleckchem) и 10 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich) в течение 10 дней для образования нейроэктодермы, еще 10 дней — 100 нг / мл FGF8 (Peprotech) и дифференцировки в пост- митотические нейроны стимулировали ингибированием Notch с использованием 20 мкМ DAPT (Sigma-Aldrich).Успешная дифференцировка в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , была подтверждена морфологическим анализом, окрашиванием антител для идентификации клеток, экспрессирующих GnRH, и количественной ПЦР.

Выделение РНК и обратная транскрипция

Экстракцию РНК

(Nucleospin RNA, Machery-Nagel) и синтез кДНК обратной транскрипцией (набор iScript ™ cDNA, BIO-RAD) проводили в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что обработка ДНКазой во время экстракции РНК выполнялась отдельно с помощью RQ1 DNase (Promega) , 1 ед / мкг РНК, в присутствии ингибитора РНКазы (Promega).Обратную транскрипцию выполняли в обычном термоциклере с 1 мкг общей РНК с использованием смеси iScript ™, содержащей смесь праймеров олиго (dT) и случайного гексамера. Условия проведения ОТ-ПЦР приведены в дополнительных материалах.

Анализ

GNRh2 Экспрессия

Уровни экспрессии гена GNRh2 измеряли с помощью кПЦР, нормализовали по циклофилину G ( PPIG ) и сравнивали с экспрессией в недифференцированных PSC, как описано ранее (17).Нормальный диапазон экспрессии мРНК GNRh2 в клетках WT был определен на основе девяти экспериментов по дифференцировке ( n = 9). День 25 был использован для характеристики экспрессии GNRh2 в нашем протоколе (17), и тот же день был выбран здесь для сравнения клеточных линий WT ( n = 9) и MKRN3 KO ( n = 6). во всех экспериментах. Условия для количественной ПЦР приведены в дополнительном материале, праймеры, используемые в КПЦР, перечислены в дополнительной таблице 2.

Иммуноцитохимия

Клетки фиксировали с использованием 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) и в течение 7 минут подвергали проницаемости в 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), разведенном в PBS. Неспецифическое связывание блокировали с помощью UltraVision Protein Block (Thermo Fisher Scientific) в течение 10 мин. Инкубацию первичного антитела проводили в течение ночи при 4 ° C, а вторичного антитела — в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела разводили в PBS, содержащем 0,1% Твин 20 (Sigma-Aldrich). Слайды монтировали с использованием монтажной среды VECTASHIELD ® с DAPI (Vector Laboratories) для контрастного окрашивания ядер, а микроскопические изображения получали с помощью ZEISS Axio Imager.Прямой эпифлуоресцентный микроскоп Z2 (Zeiss) с использованием объективов 10x / NA 0,3 и 20x / NA 0,8 EC PL APO CS2 (Biomedicum Imaging Unit) и проанализирован с помощью ImageJ (NIH). Все антитела и разведения перечислены в дополнительной таблице 3.

Создание стабильной экспрессии клеточной линии и клеточной культуры для исследований белок-белкового взаимодействия в HEK

Для создания стабильных и индуцируемых клеточных линий клонирование шлюза (28) было использовано для создания вектора экспрессии MKRN3 . MKRN3 ПЦР-продукт с фланкирующими сайтами связывания (attB) и донорский вектор с сайт-специфическими сайтами связывания (attP) рекомбинировали реакцией ВР для получения входного клона, совместимого со шлюзом. Рекомбинация между сайтами attB и attP приводит к сайтам attL и attR, которые рекомбинируются реакцией LR между входными клонами и вектором назначения MAC-C (20) для создания вектора экспрессии MKRN3, меченного MAC. Клеточные линии Flp-In ™ 293 T-REx (Invitrogen, Life Technologies, R78007) котрансфицировали вектором экспрессии и вектором pOG44 (Invitrogen) с использованием реагента DreamFect ™ (Oz Biosciences).Через два дня после трансфекции культуральную среду меняли на DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% FBS, 50 мг / мл пенициллина, 50 мг / мл стрептомицина (Sigma-Aldrich) и гигромицина B (Thermo Fisher Scientific) (100 мкг / мл). Селекцию гигромицина B на изогенные клоны проводили в течение 2 недель.

Стабильная клеточная линия была увеличена до планшетов 30 × 150 мм. Когда клетки достигли 80% слияния, добавляли 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma-Aldrich) на 24 часа для экспрессии MKRN3, меченного MAC.Для мечения биотинилированием (BioID) дополнительно добавляли 50 мкМ биотина (Thermo Fisher Scientific) одновременно с тетрациклином. Клетки, полученные из полностью конфлюэнтных чашек размером 5 × 150 мм (приблизительно 5 × 10 7 клеток), осаждали в виде одной биологической повторности. Было собрано три биологических повтора для каждого условия и всего шесть биологических повторов для двух различных условий (с биотином и без него). Образцы были мгновенно заморожены при -80 ° C до дальнейшего использования.

Аффинная очистка белковых комплексов и масс-спектрометрия (МС)

Клетки с индукцией только тетрациклином использовали для аффинной очистки (29).Клетки, обработанные тетрациклином и биотином, использовали для очистки BioID, как описано ранее (20). Очищенные белковые комплексы (AP-MS) / белки (BioID) обрабатывали и расщепляли до пептидов для анализа MS. Анализ выполняли на гибридном масс-спектрометре Qrbitrap Elite с использованием Xcalibur версии 2.0.7 SP1 (Thermo Scientific) в сочетании с системой ВЭЖХ с обращенной фазой EASY nLC 1000 через ионизационный распылитель с электрораспылением (Thermo Fisher Scientific). МС выполняли в режиме сбора данных, зависящем от данных, с использованием полного сканирования масс-спектрометрии с преобразованием Фурье (300–1700 m / z) с разрешением 60 000 и сканированием вызванной столкновением диссоциации 20 наиболее распространенных ионов.

Обработка данных

Для идентификации белков файлы Thermo.RAW были проверены по выбранной базе данных UniProtKB / SwissProt человека (http://www.uniprot.org/, версия 2017-02) с помощью поисковой системы SEQUEST. База данных-приманка была противоположной целевой базе данных. Все данные были представлены с доверительной вероятностью 95% для идентификации белка, как определено с вероятностью ложного обнаружения (FDR) ≤5%. Хранилище загрязняющих веществ для аффинной очистки (CRAPome, http: //www.crapome.org /) (30) база данных и собственная база данных образцов GFP использовались в качестве контролей с частотой отсечения 20% (411 запусков из базы данных CRAPome и 100 запусков собственных контрольных образцов GFP) для идентификации взаимодействий с высокой степенью достоверности. (HCI). Данные HCI были импортированы в Cytoscape 3.4.0 для построения сети взаимодействия белков. Известные данные о взаимодействии жертвы с жертвой были получены из базы данных IMEx (http://www.imexconsortium.org/) (31). Анализ классификации онтологии генов был основан на биоинформатическом ресурсе DAVID (https: // david.ncifcrf.gov/) (32). Мы также сравнили HCI-партнеров MKRN3 с белками, кодируемыми 371 геном, которые связаны со сроками полового созревания в соответствии с крупными популяционными исследованиями (33, 34). Кроме того, мы исследовали HCIs к белкам, кодируемым 37 генами, участвующими в врожденном гипогонадотропном гипогонадизме (CHH) (35-40).

Статистика

Относительную экспрессию GNRh2 в клеточных линиях WT H9 и MKRN3 KO Del 1 и Del 2 тестировали с помощью неспаренного t -теста после логарифмического преобразования для нормализации распределений. P Значение <0,05 было принято для обозначения статистической значимости.

Результаты

Генерация на основе CRISPR / Cas9

MKRN3 KO клеточных линий в hPSC

Чтобы исследовать влияние дефицита MKRN3 на дифференцировку нейронов, экспрессирующих GNRh2 , мы сгенерировали две линии hPSC с биаллельными делециями MKRN3 с использованием CRISPR / Cas9. Были созданы биаллельные линии клеток KO, поскольку гетерозиготные мутации MKRN3 вызывают СРР только при наследовании от отца, и мы не могли избирательно нацелить желаемую делецию на отцовский аллель.На схеме показаны направляющие нацеленные области и делеции в этих клеточных линиях (рис. 1А). Вкратце, две пары направляющих РНК, охватывающих разную длину на единственном экзоне MKRN3 вместе с Cas9, приводили к делециям -174 или -901 п.н. Для дальнейших исследований мы выбрали две явно гомозиготные линии KO Del 1 (небольшая делеция, -174 п.н.) и Del 2 (большая делеция, -901 п.н.), которые были проверены на наличие желаемых делеций с помощью ПЦР (рис. 1B) и целевого секвенирования. Дополнительные рисунки 1, 2).Отсутствие функциональной экспрессии MKRN3 было дополнительно подтверждено путем проведения ПЦР с кДНК из линий клеток WT и MKRN3 KO в качестве матрицы и с праймерами, фланкирующими делеционные области (рис. 2А). Длина транскриптов, полученных из клонов KO, соответствовала размеру делеций, наблюдаемых на уровне ДНК (фиг. 2B), что соответствует биаллельной делеции в кодирующей области MKRN3 .

Рисунок 1 . Генерация на основе CRISPR / Cas9 двух биаллельных линий клеток KO MKRN3 (Del 1 и Del 2) в линии плюрипотентных стволовых клеток человека H9 и проверка делеций, индуцированных CRISPR / Cas9 на уровне геномной ДНК. (A) Левая панель, Del 1 имеет делецию 174 п.н., что переводится в делецию 51 аминокислоты (11% белка), включая сайт начала трансляции. Правая панель, Del 2 имеет делецию 901 п.н., что соответствует делеции 300 аминокислот (60% белка). (B) Наличие или отсутствие CRISPR / Cas9-индуцированных делеций в MKRN3 было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации интересующей области из геномной ДНК плюрипотентных клеток H9 человека дикого типа и в клетках, отредактированных CRISPR / Cas9.Показаны четыре примера отредактированных клеточных линий (Del 1 – Del 4). Та же самая пара направляющих РНК, предназначенная для удаления ~ 900 п.н., была использована для редактирования клеточных линий Del 2 и Del 3, тогда как две разные пары гРНК были использованы для редактирования клеточных линий Del 1 и Del 4. Продукты ПЦР визуализировали на 1,5% агарозном геле.

Рисунок 2. (A) Схема кДНК MKRN3 и двух пар праймеров (зеленые и синие стрелки), используемых для обнаружения WT, Del 1 (левая панель) и Del 2 (правая панель).Сотовые линии. В клетках WT ожидаемые размеры продукта составляют 305 и 1235 п.н., в ячейках Del 1 131 п.о. и в ячейках Del 2 334 п.н. (B) амплификация MKRN3 из кДНК двух биаллельных линий клеток с делецией MKRN3 Del 1 (левая панель) и Del 2 (правая панель). Белая стрелка указывает ожидаемые размеры продуктов дикого типа (WT) (305 и 1235 п.н. соответственно), а красные стрелки указывают ожидаемые размеры (131 и 334 п.о. соответственно) для продуктов ПЦР из клеточных линий Del 1 и Del 2.Используемая кДНК относится к 25-му дню протокола, генерирующего GNRh2 -экспрессирующих нейронов. Продукты ПЦР визуализировали на 1,5% агарозном геле.

Дифференциация

MKRN3 KO и WT hPSC с GNRh2 — Экспрессирующие нейроны

Затем мы дифференцировали MKRN3 KO клеточных линий Del 1 и Del 2 в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , в соответствии с нашим недавно описанным протоколом (рис. 3A) (17). Обе клеточные линии могут быть дифференцированы в нейрональные предшественники и далее в нейроны, экспрессирующие GNRh2 (рис. 3В).На 25 день дифференцировки относительная экспрессия мРНК GNRh2 между клеточными линиями MKRN3 KO и клетками WT H9 (рис. 3C) не различалась ( P = NS). Уровни экспрессии мРНК OTX2 , регулятора транскрипции GNRh2 (41), вместе с OTX1 , оба из которых обогащены GnRH-нейронами мышей (42), существенно не различались между WT и Del 2 ( n = 3) клеток на 25 день протокола дифференцировки (дополнительный рисунок 3).

Рисунок 3. (A) Схема генерации GNRh2 -экспрессирующих нейронов из hPSC (17). Вкратце, двойное ингибирование SMAD с помощью дорсоморфина и SB431542 применялось в течение первых 10 дней, затем следовали 10 дней лечения FGF8 и заключительная стадия созревания нейронов в течение 5-7 дней путем комбинирования FGF8 с ингибированием Notch с помощью DAPT. Эта методология дифференциации была адаптирована из ранее опубликованного протокола, а рисунок был изменен по сравнению с исходной публикацией Lund et al.(17). (B) Иммуноцитохимия в WT и Del 2, полученных на 25-й день GnRH-положительных нейронов (зеленый), ядерное окрашивание DAPI (синий), масштабные полосы представляют 100 мкМ. (C) Относительная экспрессия GNRh2 в клетках WT H9 ( n = 9) и в двух биаллельных линиях клеток MKRN3 KO (Del 1 и Del 2) после трех независимых повторов ( n = 6) дифференцировки в нейроны, экспрессирующие GNRh2 (17). Уровни экспрессии относятся к hPSC 0 дня.

MKRN3 и его партнеры по взаимодействию с белками

Используя анализ MS, мы идентифицировали 104 HCI, включая как временные, так и стабильные взаимодействия для MKRN3 (дополнительная таблица 4). Эти 104 HCI всего для 81 уникального HCI (рис. 4) были классифицированы на функциональные группы в соответствии с их категориями аннотации, участвующими в различных путях, регулирующих клеточные процессы, в основном регуляции секреции инсулина, межклеточной адгезии, регулируемого TP53 клеточного метаболизма, транскрипции. репрессия и взаимодействующие факторы, связанные с активностью РНК (32).Важно отметить, что наши данные MS показали, что MKRN3 физически взаимодействует с 19 белками (включая LIN28B), кодируемыми генами, которые ранее были связаны с возрастом наступления менархе (33, 34). Кроме того, данные MS идентифицировали OTUD4, белок, участвующий в CHH (43), в качестве партнера HCI для MKRN3.

Рисунок 4 . Карта белок-белкового взаимодействия MKRN3. Сеть представляет собой PPI MKRN3, обнаруженные различными методами очистки. Синие края представляют экспериментально подтвержденное взаимодействие AP-MS; Красные линии представляют взаимодействия, обнаруженные с помощью очистки BioID; Перекрытие двух методов очистки показано серым цветом, а пунктирная линия описывает взаимодействия жертва-жертва.Цветные узлы представляют различные кластеры белков-жертв.

Обсуждение

У мышей экспрессия Mkrn3 снижается во время постнатального развития, а у людей уровни циркулирующего MKRN3 снижаются к началу полового созревания у обоих полов (44, 45). Однако исследование периферических уровней MKRN3 не позволяет механистически объяснить роль MKRN3 в регуляции полового созревания у людей. Поэтому мы использовали наш недавно описанный протокол дифференцировки, генерирующий GNRh2- экспрессирующих нейронов (17) и генно-инженерные hPSC, чтобы исследовать, требуется ли MKRN3 для дифференцировки нейронов GnRH в этой модели.Кроме того, мы исследовали PPI-партнеров MKRN3 в клетках HEK и уделили особое внимание возможным интеракторам, кодируемым генами, связанными с половым созреванием.

Хотя в нескольких исследованиях сообщалось, что наследуемые отцовские мутации в MKRN3 вызывают CPP (46), лежащие в основе механизмы еще предстоит объяснить (1, 2). В нашем исследовании мы сначала изучили роль MKRN3 в экспрессии GNRh2 с использованием двух биаллельных клональных клеточных линий MKRN3 KO (Del 1 и Del 2), созданных с помощью технологии CRISPR / Cas9.Эти клеточные линии впоследствии были дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , с помощью нашего недавно описанного протокола дифференцировки, который основан на двойном ингибировании SMAD, лечении FGF8 и ингибировании Notch (17). Наши результаты показывают, что обе клеточные линии Del 1 и Del 2 могут быть успешно дифференцированы в нейроны, экспрессирующие GNRh2 , что позволяет предположить, что MKRN3 является незаменимым для дифференцировки. Интересно, что экспрессия GNRh2 клеточных линий Del 1 и Del 2 не отличалась от контрольных, что предполагает, что MKRN3 не изменяет напрямую экспрессию GNRh2 .Однако постнатально существует множество экологических и метаболических сигналов, которые могут регулировать дальнейшее созревание и функцию нейронов ГнРГ (47, 48). Хотя MKRN3 не влияет на дифференцировку нейронов GnRH или их способность экспрессировать GNRh2 в нашей модели, существуют и другие потенциальные механизмы, с помощью которых MKRN3 может регулировать функцию нейронов GnRH. Например, основная регуляция активности нейронов GnRH осуществляется нейронами Kisspeptin и KNDy в гипоталамусе, и предполагаемая роль MKRN3 в этих нейронах неизвестна.Возможность других MKRN компенсировать потерю MKRN3 в клеточных линиях Del 1 и Del 2 не может быть исключена. С другой стороны, моделирование заболеваний на основе hPSC является наиболее близким доступным подходом к моделированию нейрональных расстройств человека (49), а что касается MKRN3, модели на мышах еще не описаны. Однако до сих пор известно, что MKRN3 существенно не обогащается или истощается в нейронах GnRH мыши (42).

Учитывая, что мы не смогли найти механистический признак роли MKRN3 в экспрессии GNRh2 в нашей модели стволовых клеток, мы рассмотрели альтернативные подходы, чтобы понять, как эта предполагаемая E3-лигаза может влиять на время полового созревания.Вкратце, метод исследования PPI использует систему MAC-тегов, которая содержит аффинные теги для аффинной очистки-масс-спектрометрии (AP-MS), а также биотинлигазу BirA * для BioID. Следовательно, одной конструкции достаточно для идентификации как стабильных, так и временных взаимодействий (20). Мы не проводили исследования PPI в нашей модели стволовых клеток, поскольку эффективное клонирование всех различных меченых конструкций MKRN3 в hPSCs выходило за рамки данной работы. Хотя это потенциальное предостережение, важно отметить, что клетки HEK, одна из наиболее широко используемых линий клеток человека в биомедицинских исследованиях (50), не являются непригодными для наших целей, поскольку они проявляют некоторые нейронные свойства (23).Кроме того, наша лаборатория обладает огромным опытом в использовании платформы на основе линии клеток HEK, которая позволяет быстро и эффективно создавать конструкции экспрессии и последующий анализ данных. Основываясь на списке белков HCI для MKRN3, мы обнаружили, что MKRN3 может участвовать в межклеточной адгезии, метаболизме РНК и секреции инсулина. Было высказано предположение, что инсулин изменяет функцию нейронов ГнРГ у людей, и считается, что чувствительность к инсулину является важным фактором в инициации полового созревания (1, 51, 52).MKRN3 взаимодействует с группой белков, кодируемых метаболическими генами, которые, в свою очередь, регулируются TP53, геном-супрессором опухоли, участвующим в нескольких формах рака и участвующим в половом созревании (53). Другие PPI-партнеры MKRN3 участвуют в транспорте и метаболизме РНК, что остается менее изученной областью с точки зрения полового созревания.

Кроме того, мы обнаружили, что MKRN3 взаимодействует с 20 белками, кодируемыми генами, связанными с периодом полового созревания, из которых LIN28B является одним из наиболее установленных генов, связанных с половым созреванием в генетических исследованиях (54, 55), а OTUD4 представляет собой единственный ген заболевания, родственного ему (43).Хотя LIN28B был связан с возрастом начала менархе, ростом взрослого и детским ростом (56–60) и, как известно, является негативным регулятором микроРНК класса let-7 (61), механизм, с помощью которого он регулирует половое созревание. сроки неизвестны (1, 62, 63). У крыс и нечеловеческих приматов экспрессия Lin28b снижается в гипоталамусе в период полового созревания (64), а у мышей экспрессия как Lin28b , так и Mkrn3 снижается до наступления половой зрелости (7, 65). Наши результаты свидетельствуют о физическом взаимодействии между человеческими LIN28B и MKRN3, и есть соблазн предположить, что они могут действовать согласованно, чтобы регулировать время полового созревания.Мы также исследовали взаимодействия MKRN3 среди 37 генов, участвующих в CHH (35-40), и обнаружили, что MKRN3 взаимодействует с OTUD4. OTUD4 представляет собой ген, кодирующий деубиквитиназу (43), и интересно предположить, что он может регулировать время полового созревания, противодействуя эффектам MKRN3. Для подтверждения этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования. Наконец, MKRN3 взаимодействует с другими генами цинковых пальцев (ZNF), которые являются репрессорами транскрипции и играют важную роль в период полового созревания (66), однако мы не смогли наблюдать взаимодействие MKRN3 с ZNF, критическими для наступления полового созревания, такими как ZNF573 и GATAD1 (66). .Даже в этом случае наблюдаемые взаимодействия предполагают возможность того, что MKRN3 является эпигенетическим репрессором транскрипции, участвующим в определении времени полового созревания.

В заключение, наши результаты предполагают, что MKRN3 является незаменимым для процесса дифференцировки нейронов GnRH и экспрессии GNRh2 во время дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека. Хотя механизм, с помощью которого MKRN3 регулирует половое созревание человека, остается неясным, наши результаты предполагают, что MKRN3 может действовать согласованно с ранее идентифицированными белками, связанными с половым созреванием, и заманчиво предположить, что это взаимодействие транслируется в функциональное сотрудничество с точки зрения полового созревания. сроки.Необходимы дальнейшие исследования, прежде чем мы поймем, как и почему ось HPG активируется преждевременно у детей с унаследованными от отца мутациями потери функции в MKRN3 .

Авторские взносы

VY, SV, TT и TR планировали проект. TT, MV и TR руководили проектом. VY, CL, KP и KL выполняли работу со стволовыми клетками. XL и MV разработали исследование взаимодействия белков. XL и JK проводили работу по взаимодействию с белками. В.Ю. написал рукопись, а Т.Р. отредактировал рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана Академией Финляндии, Фондом педиатрических исследований, Фондом Сигрид-Юселиуса, Фондом Ново Нордиск, Ялмари Я Рауха Ахоккаан Сяэтио, Хельсинкским университетом и Центральной больницей Хельсинкского университета.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джера Велтнера, Диего Бальбоа и Центр стволовых клеток Biomedicum за их поддержку. Мы благодарим Biomedicum Imaging Unit за предоставленную возможность для микроскопии. Благодарим Аннику Таркканен за вычитку рукописи.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2019.00048/full#supplementary-material

Сокращения

CPP, центральное преждевременное половое созревание; MKRN3, белок 3 макорин безымянного пальца; hPSCs, плюрипотентные стволовые клетки человека; WT, дикий тип; КО, нокаут; CRISPR, сгруппированные регулярно чередующиеся палиндромные повторы; Cas9, белок, связанный с CRISPR 9; п.н., пары оснований; гРНК, матрица ДНК-направляющей РНК; GFP, зеленый флуоресцентный белок; ИПП, белок-белковое взаимодействие; HCI, уверенные взаимодействия; CHH, врожденный гипогонадотропный гипогонадизм.

Список литературы

2. Latronico AC, Brito VN, Carel JC. Причины, диагностика и лечение центрального преждевременного полового созревания. Ланцет Диабет Эндокринол. (2016) 4: 265–74. DOI: 10.1016 / S2213-8587 (15) 00380-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Сориано-Гильен Л., Коррипио Р., Лабарта Д. И., Каньете Р., Кастро-Фейхо Л., Эспино Р. и др. Центральное преждевременное половое созревание у детей, живущих в Испании: частота, распространенность и влияние усыновления и иммиграции. J Clin Endocrinol Metabol. (2010) 95: 4305–13. DOI: 10.1210 / jc.2010-1025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Абреу А.П., Даубер А., Маседо Д.Б., Ноэль С.Д., Брито В.Н., Гилл Дж.С. и др. Центральное преждевременное половое созревание, вызванное мутациями в импринтированном гене MKRN3. N Engl J Med . (2013) 368: 2467–75. DOI: 10.1056 / NEJMoa1302160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Кянсакоски Дж., Райвио Т., Юул А., Томмиска Дж.Миссенс-мутация в MKRN3 у датской девочки с центральным преждевременным половым созреванием и ее брата с ранним половым созреванием. Pediatric Res. (2015) 78: 709–11. DOI: 10.1038 / pr.2015.159

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Саймон Д., Ба И., Мехайл Н., Экосс Э., Паулсен А., Зенати Д. и др. Мутации в материнском импринтированном гене MKRN3 часто встречаются в семейном центральном преждевременном половом созревании. Eur J Endocrinol. (2016) 174: 1–8. DOI: 10.1530 / EJE-15-0488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10.Бесса Д.С., Маседо Д.Б., Брито В.Н., Франса М.М., Черногория Л.Р., Кунья-Силва М. и др. Высокая частота мутаций MKRN3 в центральном преждевременном половом созревании мужчин, ранее классифицированных как идиопатические. Нейроэндокринология (2017) 105: 17–25. DOI: 10.1159 / 000446963

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Маседо Д. Б., Абреу А. П., Рейс А. С., Черногория Л. Р., Даубер А., Бенедуцци Д. и др. Центральное преждевременное половое созревание, которое, по-видимому, является спорадическим, вызванным отцовскими унаследованными мутациями в импринтированном гене makorin безымянного пальца 3. J Clin Endocrinol Metabol. (2014) 99: E1097–103. DOI: 10.1210 / jc.2013-3126

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Абреу А.П., Маседо Д.Б., Брито В.Н., Кайзер У.Б., Латронико А.С. Новый путь контроля начала полового созревания: ген MKRN3. J Mol Endocrinol. (2015) 54: R131–9. DOI: 10.1530 / JME-14-0315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Бёне А., Даррас А., Д’Котта Х., Баройллер Дж. Ф., Галиана-Арну Д., Вольф Дж. Н..Семейство генов макорин-убиквитинлигазы позвоночных было сформировано крупномасштабной дупликацией и ретропозицией гена материнского эффекта, специфичного для гонад предков. BMC Genomics (2010) 11: 721. DOI: 10.1186 / 1471-2164-11-721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Jong MT, Gray TA, Ji Y, Glenn CC, Saitoh S, Driscoll DJ, et al. Новый импринтированный ген, кодирующий белок цинкового пальца RING и перекрывающий антисмысловой транскрипт в критической области синдрома Прадера-Вилли. Hum Mol Genet. (1999) 8: 783–93. DOI: 10.1093 / hmg / 8.5.783

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Лунд К., Пулли К., Йеллапрагада В., Джакобини П., Лундин К., Вуористо С. и др. Развитие нейронов, секретирующих гонадотропин-рилизинг-гормон, из плюрипотентных стволовых клеток человека. Stem Cell Rep. (2016) 7: 149–57. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2016.06.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Либер MR. Механизм репарации двухцепочечных разрывов ДНК по пути негомологичного соединения концов ДНК. Ann Rev Biochem. (2010) 79: 181–211. DOI: 10.1146 / annurev.biochem.052308.093131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Лю X, Салокас К., Тамене Ф., Джиу Й., Велдацадик Р.Г., Охман Т. и др. MAC-теги, совместимые с AP-MS и BioID, позволяют комплексно картировать белковые взаимодействия и субклеточные локализации. Nat Commun. (2018) 9: 1188.DOI: 10.1038 / s41467-018-03523-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Herce HD, Deng W, Helma J, Leonhardt H, Cardoso MC. Визуализация и целенаправленное нарушение белковых взаимодействий в живых клетках. Nat Commun. (2013) 4: 2660. DOI: 10.1038 / ncomms3660

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Dunham WH, Mullin M, Gingras AC. Аффинная очистка в сочетании с масс-спектрометрией: основные принципы и стратегии. Протеомика (2012) 12: 1576–90. DOI: 10.1002 / pmic.201100523

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Шоу Г., Морс С., Арарат М., Грэм Флорида. Предпочтительная трансформация человеческих нейрональных клеток аденовирусами человека и происхождение клеток HEK 293. FASEB J. (2002) 16: 869–71. DOI: 10.1096 / fj.01-0995fje

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Томсон Дж. А., Ицковиц-Элдор Дж., Шапиро С. С., Вакниц М. А., Свиергиль Дж. Дж., Маршалл В. С. и др.Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука (1998) 282: 1145 LP-7.

PubMed Аннотация | Google Scholar

25. Бальбоа Д., Велтнер Дж., Эурола С., Трокович Р., Вартиоваара К., Отонкоски Т. Условно стабилизированный активатор DCas9 для контроля экспрессии генов при репрограммировании и дифференцировке человеческих клеток. Stem Cell Rep. (2015) 5: 448–59. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2015.08.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26.Ватанабе К., Уэно М., Камия Д., Нишияма А., Мацумура М., Ватая Т. и др. Ингибитор ROCK обеспечивает выживание диссоциированных эмбриональных стволовых клеток человека. Nat Biotechnol. (2007) 25: 681. DOI: 10.1038 / nbt1310

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): высокопроизводительная визуализация и исследование данных геномики. Брифинги Биоинформ. (2013) 14: 178–92. DOI: 10.1093 / bib / bbs017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Varjosalo M, Sacco R, Stukalov A, van Drogen A, Planyavsky M, Hauri S, et al. Межлабораторная воспроизводимость крупномасштабного анализа белковых комплексов человека с помощью стандартизированной AP-MS. Nat Methods (2013) 10: 307–14. DOI: 10.1038 / nmeth.2400

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Меллачеруву Д., Райт З., Кузенс А. Л., Ламберт Дж. П., Сен-Дени Н. А., Ли Т. и др.CRAPome: хранилище загрязняющих веществ для данных аффинной очистки и масс-спектрометрии. Nat Methods (2013) 10: 730–6. DOI: 10.1038 / nmeth.2557

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Орчард С., Керриен С., Аббани С., Аранда Б., Бхате Дж., Бидвелл С. и др. Курирование данных о взаимодействии белков: консорциум международного молекулярного обмена (IMEx). Nat Methods (2012) 9: 345–50. DOI: 10,1038 / Nmeth.1931

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32.Хуанг Д.В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Систематический и комплексный анализ больших списков генов с использованием ресурсов биоинформатики DAVID. Nat Protoc. (2009) 4: 44–57. DOI: 10.1038 / nprot.2008.211

CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Перри JR, Day F, Elks CE, Sulem P, Thompson DJ, Ferreira T. и др. Аллельные ассоциации, специфичные для родителей по происхождению, среди 106 геномных локусов для возраста менархе. Nature (2014) 514: 92–7. DOI: 10.1038 / природа13545

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34.Дэй FR, Томпсон Д.И., Хелгасон Х., Часман Д.И., Финукейн Х., Сулем П. и др. Геномный анализ выявляет сотни вариантов, связанных с возрастом начала менархе, и подтверждает роль времени полового созревания в риске рака. Nat Genet. (2017) 49: 834–41. DOI: 10,1038 / нг.3841

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Бем У., Булу П.М., Даттани М.Т., де Ру Н., Доде С., Дункель Л. и др. Европейское консенсусное заявление о врожденном гипогонадотропном гипогонадизме — патогенез, диагностика и лечение. Nat Rev Endocrinol. (2015) 11: 547–64. DOI: 10.1038 / nrendo.2015.112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Буйи Дж., Мессина А., Пападакис Дж., Кассателла Д., Сюй С., Асьерно Дж. С. и др. Мутации комплекса DCC / NTN1 у пациентов с врожденным гипогонадотропным гипогонадизмом нарушают развитие нейронов ГнРГ. Hum Mol Genet. (2018) 27: 359–72. DOI: 10.1093 / hmg / ddx408

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37.Говард С.Р., Гуасти Л., Руис-Бабот Дж., Манчини А., Дэвид А., Сторр Г. Л. и др. Мутации IGSF10 нарушают регуляцию миграции нейронов гонадотропин-рилизинг-гормона, что приводит к задержке полового созревания. EMBO Mol Med. (2016) 8: 626–42. DOI: 10.15252 / emmm.201606250

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Сюй Ц., Мессина А., Сомм Э, Мирауи Х., Киннунен Т., Асьерно Дж. И др. KLB Encoding? -Klotho мутирует у пациентов с врожденным гипогонадотропным гипогонадизмом. EMBO Mol Med (2017) 9: 1397–79. DOI: 10.15252 / emmm.201607376

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Ричардс М.Р., Пламмер Л., Чан Ю.М., Липпинкотт М.Ф., Куинтон Р., Куманов П. и др. Фенотипический спектр мутаций POLR3B: изолированный гипогонадотропный гипогонадизм без неврологических или стоматологических аномалий. J Med Genetics (2017) 54: 25–19. DOI: 10.1136 / jmedgenet-2016-104064

CrossRef Полный текст | Google Scholar

40.Маркос С., Монье С., Ровира Х, Фуво С., Питтелуд Н., Анго Ф. и др. Дефектная передача сигналов через plexin-A1 ставит под угрозу развитие периферической обонятельной системы и нейроэндокринной репродуктивной оси у мышей. Hum Mol Genet. (2017) 26: 2006–17. DOI: 10.1093 / hmg / ddx080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Келли К.Г., Лаворгна Г., Кларк М.Э., Бончинелли Е., Меллон П.Л. Гомеопротеин Otx2 регулирует экспрессию проксимального промотора гонадотропин-рилизинг-гормона. Мол эндокринол. (2000) 14: 1246–56. DOI: 10.1210 / исправление.14.8.0509

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Burger LL, Vanacker C., Phumsatitpong C, Wagenmaker ER, Wang L, Olson DP, et al. Идентификация генов, обогащенных нейронами GnRH, путем трансляции аффинной очистки рибосом и RNAseq у мышей. Эндокринология (2018) 159: 1922–40. DOI: 10.1210 / en.2018-00001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43.Марголин Д.Х., Куси М., Чан Ю.М., Лим Е.Т., Шмахманн Д.Д., Хадживассилиу М. и др. Атаксия, деменция и гипогонадотропизм, вызванные нарушением убиквитинирования. N Engl J Med. (2013) 368: 1992–2003. DOI: 10.1056 / NEJMoa1215993

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Hagen CP, Sørensen K, Mieritz MG, Johannsen TH, Almstrup K, Juul A. Уровни циркулирующего MKRN3 снижаются до наступления полового созревания и в период полового созревания: продольное исследование здоровых девочек. J Clin Endocrinol Metabol. (2015) 100: 1920–6. DOI: 10.1210 / jc.2014-4462

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Варимо Т., Дункель Л., Вааралахти К., Миеттинен П.Дж., Герой М., Райвио Т. Уровень циркулирующего белка-3 безымянного пальца макорина (MKRN3) снижается у мальчиков до клинического наступления половой зрелости. Eur J Endocrinol. (2016) 174, 785–90. DOI: 10.1530 / EJE-15-1193

CrossRef Полный текст | Google Scholar

50.Лин Ю.К., Бун М., Меурис Л., Лемменс И., Ван Рой Н., Соете А. и др. Динамика генома клона 293 эмбриональной почки человека в ответ на манипуляции клеточной биологии. Nat Commun. (2014) 5: 4767. DOI: 10.1038 / ncomms5767

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Соренсен К., Моуритсен А., Могенсен С.С., Аксгладе Л., Юул А. Чувствительность к инсулину и липидные профили у девочек с центральным преждевременным половым созреванием до и во время подавления гонад. J Clin Endocrinol Metabol. (2010) 95: 3736–44. DOI: 10.1210 / jc.2010-0731

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Moret M, Stettler R, Rodieux F, Gaillard RC, Waeber G, Wirthner D, et al. Инсулиновая модуляция секреции лютеинизирующего гормона у здоровых женщин-добровольцев и пациентов с синдромом худых поликистозных яичников. Нейроэндокринология (2009) 89: 131–39. DOI: 10.1159 / 000160911

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Roth CL, Mastronardi C, Lomniczi A, Wright H, Cabrera R, Mungenast AE и др. Экспрессия связанной с опухолью генной сети увеличивается в гипоталамусе млекопитающих во время полового созревания самок. Эндокринология (2007) 148: 5147–61. DOI: 10.1210 / en.2007-0634

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Elks CE, Perry JR, Sulem P, Chasman DI, Franceschini N, He C, et al. Тридцать новых локусов возраста начала менархе идентифицированы с помощью метаанализа полногеномных ассоциативных исследований. Nat Genetics (2010) 42: 1077–85. DOI: 10,1038 / нг.714

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Avendaño MS, Vazquez MJ, Tena-Sempere M. Распутывание полового созревания: новые нейроэндокринные пути и механизмы контроля полового созревания млекопитающих. Hum Reproduc Update (2017) 23: 737–63. DOI: 10.1093 / humupd / dmx025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Перри Дж. Р., Столк Л., Франческини Н., Лунетта К. Л., Жай Дж., МакАрдл П. Ф. и др.Мета-анализ данных ассоциации по всему геному идентифицирует два локуса, влияющих на возраст наступления менархе. Nat Genetics (2009) 41: 648–50. DOI: 10,1038 / нг.386

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Сулем П., Гудбьяртссон Д. Ф., Рафнар Т., Холм Х., Олафсдоттир Э. Дж., Олафсдоттир Г. Х. и др. Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует варианты последовательности на 6q21, связанные с возрастом начала менархе. Nat Genet. (2009) 41: 734–8. DOI: 10,1038 / нг.383

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58.He C, Kraft P, Chen C, Buring JE, Paré G, Hankinson SE и др. Полногеномные ассоциативные исследования определяют локусы, связанные с возрастом менархе и возрастом естественной менопаузы. Nat Genet. 41: 724–8. DOI: 10,1038 / нг.385

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

59. Онг К.К., Элкс К.Э., Ли С., Чжао Дж. Х., Луан Дж., Андерсен Л. Б. и др. Генетическая изменчивость LIN28B связана со сроками полового созревания. Nat Genetics (2009) 41: 729–33. DOI: 10,1038 / нг.382

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60.Cousminer DL, Berry DJ, Timpson NJ, Ang W, Thiering E, Byrne EM и др. Полногеномный ассоциативный и продольный анализ выявляют генетические локусы, связывающие рост в пубертатном периоде, время полового созревания и детское ожирение. Hum Mol Genetics (2013) 22: 2735–47. DOI: 10.1093 / hmg / ddt104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Gajdos ZK, Henderson KD, Hirschhorn JN, Palmert MR. Генетические детерминанты пубертатного возраста в общей популяции. Mol Cell Endocrinol. (2010) 324: 21–9. DOI: 10.1016 / j.mce.2010.01.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Корре С., Шинода Дж., Чжу Х., Кусминер Д.Л., Кроссман С., Беллиссимо С. и др. Полозависимая регуляция веса и полового созревания по оси Lin28 / Let-7. J Endocrinol. (2016) 228: 179–91. DOI: 10.1530 / JOE-15-0360

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Саньяо-Альвареллос С., Манфреди-Лозано М., Руис-Пино Ф., Наварро В.М., Санчес-Гарридо М.А., Леон С. и др.Изменения в гипоталамической экспрессии системы Lin28 / Let-7 и родственных микроРНК во время постнатального созревания и после экспериментальных манипуляций в период полового созревания. Эндокринология (2013) 154: 942–55. DOI: 10.1210 / en.2012-2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Grieco A, Rzeczkowska P, Alm C, Palmert MR. Исследование перипубертатной экспрессии Lin28a и Lin28b у самок мышей C57BL / 6. Mol Cell Endocrinol. (2013) 365: 241–8.DOI: 10.1016 / j.mce.2012.10.025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Lomniczi A, Wright H, Castellano JM, Matagne V, Toro CA, Ramaswamy S, et al. Эпигенетическая регуляция полового созревания посредством репрессии транскрипции, опосредованной белком цинкового пальца. Nat Commun. (2015) 6: 1–16. DOI: 10.1038 / ncomms10195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Final_FMCT_April10.indd

% PDF-1.6 % 481 0 объект > эндобдж 478 0 объект > поток Акробат Дистиллятор 8.1.0 (Windows) PScript5.dll Версия 5.22010-06-03T17: 40: 36 + 02: 002010-04-30T11: 42: 31 + 02: 002010-06-03T17: 40: 36 + 02: 00application / pdf

  • Final_FMCT_April10. indd
  • блетры
  • uuid: 7c8c673a-cc61-47a1-9e79-324ffe2ad5e0uuid: a8a78f49-1e99-4137-b499-42070aeee112 конечный поток эндобдж 821 0 объект > / Кодировка >>>>> эндобдж 460 0 объект > эндобдж 601 0 объект > эндобдж 457 0 объект > эндобдж 458 0 объект > эндобдж 670 0 объект > эндобдж 661 0 объект > эндобдж 662 0 объект > эндобдж 663 0 объект > / Pa2 + 1> / A5 + 1> / A2 + 1> / Pa3 + 1> / A0 666 0 R / A1 667 0 R / A2 668 0 R / A5 669 0 R / A0 + 1 >>> эндобдж 664 0 объект > эндобдж 665 0 объект > эндобдж 666 0 объект > эндобдж 667 0 объект > эндобдж 668 0 объект > эндобдж 669 0 объект > эндобдж 764 0 объект > эндобдж 774 0 объект > эндобдж 775 0 объект

    Контроль над вооружениями сегодня | Ассоциация по контролю над вооружениями


    июль / август 2021 года
    Кингстон Рейф

    Поскольку администрация Байдена готовится начать проверку У.S. политика в отношении ядерного оружия, его первый бюджетный запрос будет продолжать дорогостоящие и вызывающие споры усилия по поддержанию и модернизации ядерного оружия, унаследованные от администрации Трампа.

    Представление вызвало неоднозначную реакцию в Конгрессе. Республиканцы в целом выражали поддержку, но некоторые демократы заявили, что это несовместимо с опасениями, высказанными президентом Джо Байденом в ходе предвыборной кампании, по поводу амбиций и цен на планы модернизации, которые значительно выросли за последние четыре года.

    В отчете Бюджетного управления Конгресса (CBO), опубликованном в мае, стоимость подхода администрации Трампа с 2021 по 2030 финансовый год оценивается в 634 миллиарда долларов (см. ACT , июнь 2021 года). Это увеличение на 140 миллиардов долларов, или 28 процентов, от предыдущего 10-летнего прогноза CBO два года назад. (См. ACT , март 2019 г.)

    Будет ли бюджетное предложение на 2022 финансовый год замещающим в ожидании результатов предстоящего обзора ядерной политики (NPR) администрации или предвестником того, что Байден намерен придерживаться планов Трампа, еще предстоит увидеть.

    Администрация запрашивает 43,2 миллиарда долларов в 2022 году для министерств обороны и энергетики на поддержание и модернизацию американских систем доставки ядерного оружия и боеголовок и их вспомогательной инфраструктуры. Это включает 27,7 миллиарда долларов для Пентагона и 15,5 миллиарда долларов для полуавтономного Национального управления по ядерной безопасности (NNSA) министерства энергетики.

    Предлагаемые расходы на ядерное оружие составляют около 5,7% от общей потребности национальной обороны в 753 миллиарда долларов.

    Прямое сравнение представления Байдена с тем, что президент Дональд Трамп запросил и Конгресс в значительной степени поддержал в 2021 финансовом году (44,5 млрд долларов), и с тем, что Трамп прогнозировал запросить на 2022 год (45,9 млрд долларов), трудно, потому что предложение Байдена, похоже, переклассифицирует, как расходы на Учитываются программы ядерного командования, управления и связи, что приводит к меньшей запрашиваемой сумме.

    «Ядерная триада остается краеугольным камнем нашей национальной обороны и стратегического сдерживания», — заявил 10 июня министр обороны Ллойд Остин комитету Сената по вооруженным силам.

    В бюджете на 2022 год «вкладываются средства в модернизацию ядерной энергетики, и департамент всегда будет стремиться найти баланс между лучшими возможностями и наиболее экономичным решением», — добавил он.

    Бюджетный запрос, в частности, продолжит противоречивые предложения Трампа о расширении ядерного потенциала США. (См. ACT , март 2018 г.) Он включает 15 миллионов долларов на начало разработки новой маломощной ядерной крылатой ракеты морского базирования (КРМБ), почти 134 миллиона долларов на новую боеголовку баллистической ракеты большой мощности, запускаемой с подводных лодок ( W93) и сопутствующий аэрозольный снаряд, 98 долларов.5 миллионов долларов на бессрочную поддержку гравитационной бомбы мегатонного класса B83-1 и почти 1,9 миллиарда долларов на создание мощностей по увеличению производства плутониевых ям или ядер для ядерных боеголовок до 80 в год.

    Как и в случае с большинством новых администраций, у администрации Байдена было время только для быстрого пересмотра бюджетных планов на 2022 финансовый год, завещанных его предшественником. Но Пентагон действительно рассмотрел некоторые программы создания ядерного оружия, в частности планы Трампа по созданию нового варианта боеголовки баллистических ракет малой мощности, запускаемого с подводных лодок, известного как W76-2, и нового КРМБ с ядерным вооружением.(См. Закон ACT , апрель 2021 г.)

    ВМС начали развертывание W76-2 в конце 2019 г. (См. ACT , март 2020 г.) Новая крылатая ракета проходит анализ альтернатив для определения возможных вариантов системы вооружения.

    Судя по всему, будущее новой крылатой ракеты является спорным вопросом в Пентагоне. Несмотря на включение финансирования для этого в запрос бюджета, руководство, выпущенное 4 июня исполняющим обязанности министра ВМФ Томасом Харкером, призвало службу не финансировать систему вооружений в 2023 финансовом году.

    Бюджетный запрос также поддержит планы, начатые при администрации Обамы, по замене систем доставки дальнего действия для всех трех звеньев ядерной триады.

    Три из этих программ — программа противоракетных ракет большой дальности для нового парка крылатых ракет воздушного базирования (КРВБ), программа класса Columbia для нового парка подводных лодок с баллистическими ракетами и программа стратегического сдерживания наземного базирования для новый парк межконтинентальных баллистических ракет (МБР) — в целом должен получить почти на 15 процентов больше, чем планировалось запросить администрация Трампа в 2022 году.

    Предлагаемый рост расходов на ядерное оружие по-прежнему заставляет Пентагон делать сложный выбор в отношении того, какие другие приоритеты следует сократить, особенно в то время, когда военные бюджеты остаются неизменными. В целом администрация изыскивает 753 миллиарда долларов на программы национальной обороны в 2022 году, что на 1,7 процента больше, чем в 2021 году, но на 0,8 процента меньше, чем прогноз Трампа по росту инфляции на 2022 год в размере 759 миллиардов долларов.

    Контр-адмирал Джон Гамблтон, директор по бюджету ВМФ, сказал репортерам 28 мая, что решение службы закупить один вместо двух новых эсминцев «было абсолютно вопросом финансовой доступности, где цель ведомства состояла в том, чтобы сбалансировать первоочередную задачу, которая была инвестиция в рекапитализацию [подводных лодок класса Columbia].”

    Запрос администрации о выделении около 15,5 миллиардов долларов на деятельность по ядерному оружию в NNSA — это рост на 139 миллионов долларов по сравнению с уровнем 2021 года, выделенный Конгрессом, но снижение примерно на 460 миллионов долларов по сравнению с прогнозом Трампа в 15,9 миллиарда долларов на 2022 год.

    Запрос на деятельность NNSA в области вооружений является первым уменьшением по сравнению с запросом предыдущего года с 2013 финансового года и с прогнозом предыдущего года с 2016 финансового года, хотя и с гораздо более значительным исходным уровнем. В прошлом году Конгресс выделил примерно 15 долларов.4 миллиарда, что на 2,9 миллиарда долларов больше ассигнований на 2020 финансовый год. (См. ACT , январь / февраль 2020 г.)

    В дополнение к финансированию проектов новых боеголовок и объектов, впервые предложенных Трампом, запрос также отслеживает программы по модернизации боеголовки B61-12, межконтинентальной баллистической ракеты W87-1 и W80-4 ALCM.

    Запрос бюджета может показаться несовместимым с заявлениями Байдена, сделанными во время кампании по корректировке планов расходов Трампа.

    Байден сказал Совету за жизнеспособный мир в ответах на анкету кандидата 2019 года, что Соединенным Штатам «не нужно новое ядерное оружие» и что его «администрация будет работать над поддержанием сильного, надежного сдерживающего фактора, уменьшая нашу зависимость и чрезмерные расходы на ядерное оружие.”

    Член палаты представителей Прамила Джаяпал (штат Вашингтон) выразила озабоченность тем, что бюджетная заявка «расширяет почти все ядерные [оружейные] программы, предложенные предыдущей администрацией» на слушаниях 9 июня по бюджетной заявке с исполняющим обязанности директора Управления управления и бюджета Шаландой. Молодой.

    Янг сказал, что, когда администрация начинает процесс NPR, Байден «по-прежнему привержен принятию мер по снижению роли ядерного оружия». Она добавила: «Итак, вы видите продолжение программы, но [это] определенно зависит от того, что [процесс NPR] завершится.”

    Остин сказал, что процесс начнется «очень скоро», и другие официальные лица администрации указали, что он будет тесно связан с более крупным обзором оборонной стратегии Пентагона. Однако еще неизвестно, будет ли этот обзор отдельным обзором, как в прошлом, или включенным в комплексный обзор сдерживания, который также затрагивает вопросы противоракетной обороны, космоса и киберпространства.

    Сенатор Деб Фишер (Республика Небраска), высокопоставленный член подкомитета по стратегическим силам Сената по вооруженным силам, 10 июня поддержала других республиканцев, когда она хвалила просьбу об установлении приоритета ядерной модернизации и сохранении программ рекапитализации ядерной триады «на месте». отслеживать.”

    Но она и другие республиканские законодатели выразили озабоченность по поводу сообщений о том, что ВМС могут отменить программу SLCM до начала процесса NPR.

    «У нас есть серьезные вопросы к высокопоставленным руководителям Пентагона по поводу этого решения и того, как оно было достигнуто», — заявил член палаты представителей Майк Роджерс (штат Алабама), член комитета по вооруженным силам, и сенатор Джеймс Инхоф (справа). Okla.), Высокопоставленный член комитета Сената по делам вооруженных сил, говорится в совместном заявлении 9 июня.

    Остин сообщил комитету Сената по вооруженным силам, что меморандум был «предрешенным» и что судьба системы вооружений будет определена администрацией.

    % PDF-1.3 % 528 0 объект > эндобдж xref 528 130 0000000016 00000 н. 0000002952 00000 н. 0000004309 00000 н. 0000004544 00000 н. 0000004627 00000 н. 0000004736 00000 н. 0000004819 00000 н. 0000004944 00000 н. 0000004990 00000 н. 0000005051 00000 н. 0000005100 00000 н. 0000005144 00000 п. 0000005508 00000 н. 0000005648 00000 н. 0000005788 00000 н. 0000005928 00000 н. 0000006068 00000 н. 0000006208 00000 н. 0000006348 00000 п. 0000006487 00000 н. 0000006626 00000 н. 0000006766 00000 н. 0000006906 00000 н. 0000007046 00000 н. 0000007186 00000 н. 0000007326 00000 н. 0000007466 00000 н. 0000007606 00000 н. 0000007746 00000 н. 0000007886 00000 н. 0000008025 00000 н. 0000008165 00000 н. 0000008305 00000 н. 0000008445 00000 н. 0000008585 00000 н. 0000008725 00000 н. 0000008865 00000 н. 0000009005 00000 н. 0000009145 00000 н. 0000009285 00000 п. 0000009425 00000 н. 0000009564 00000 н. 0000009704 00000 п. 0000009844 00000 н. 0000009984 00000 н. 0000010124 00000 п. 0000010264 00000 п. 0000010404 00000 п. 0000010544 00000 п. 0000010684 00000 п. 0000010823 00000 п. 0000010961 00000 п. 0000011100 00000 п. 0000011220 00000 н. 0000011339 00000 п. 0000011517 00000 п. 0000011733 00000 п. 0000012287 00000 п. 0000012789 00000 п. 0000012998 00000 н. 0000013039 00000 п. 0000013061 00000 п. 0000013888 00000 п. 0000013910 00000 п. 0000014755 00000 п. 0000014777 00000 п. 0000015557 00000 п. 0000015579 00000 п. 0000015803 00000 п. 0000015998 00000 н. 0000016810 00000 п. 0000016832 00000 п. 0000017715 00000 п. 0000017737 00000 п. 0000017955 00000 п. 0000018146 00000 п. 0000018940 00000 п. 0000018962 00000 п. 0000019705 00000 п. 0000019727 00000 н. 0000022159 00000 п. 0000044688 00000 п. 0000051303 00000 п. 0000056803 00000 п. 0000072580 00000 п. 0000073224 00000 п. 0000073364 00000 п. 0000073423 00000 п. 0000073482 00000 п. 0000073542 00000 п. 0000073602 00000 п. 0000073662 00000 п. 0000073722 00000 п. 0000073782 00000 п. 0000073842 00000 п. 0000073902 00000 п. 0000073962 00000 п. 0000074022 00000 п. 0000074082 00000 п. 0000074142 00000 п. 0000074203 00000 п. 0000074264 00000 п. 0000074325 00000 п. 0000074386 00000 п. 0000074447 00000 п. 0000074508 00000 п. 0000074569 00000 п. 0000074630 00000 п. 0000074691 00000 п. 0000074752 00000 п. 0000074813 00000 п. 0000074874 00000 п. 0000074935 00000 п. 0000074996 00000 п. 0000075057 00000 п. 0000075118 00000 п. 0000075179 00000 п. 0000075240 00000 п. 0000075301 00000 п. 0000075362 00000 п. 0000075423 00000 п. 0000075484 00000 п. 0000075545 00000 п. 0000075606 00000 п. 0000075667 00000 п. 0000075728 00000 п. 0000075789 00000 п. 0000075862 00000 п. 0000003109 00000 п. 0000004286 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 529 0 объект > эндобдж 656 0 объект > ручей HVmh [e> M ֤ kf7 [ZquLG «N] VdI | j? $ M7 *.? [up8a? P «{4It ‘9ss}

    % PDF-1.4 % 7943 0 объект > эндобдж xref 7943 76 0000000016 00000 н. 0000001894 00000 н. 0000002237 00000 н. 0000002393 00000 н. 0000002470 00000 н. 0000002623 00000 н. 0000005160 00000 н. 0000005594 00000 н. 0000005663 00000 п. 0000005753 00000 п. 0000005926 00000 н. 0000006025 00000 н. 0000006124 00000 н. 0000006277 00000 н. 0000006346 00000 п. 0000006457 00000 н. 0000006526 00000 н. 0000006633 00000 н. 0000006702 00000 н. 0000006771 00000 н. 0000006841 00000 н. 0000006972 00000 н. 0000007042 00000 н. 0000007149 00000 н. 0000007219 00000 н. 0000007336 00000 н. 0000007406 00000 н. 0000007520 00000 н. 0000007590 00000 н. 0000007699 00000 н. 0000007769 00000 н. 0000007877 00000 н. 0000007947 00000 н. 0000008058 00000 н. 0000008128 00000 н. 0000008237 00000 н. 0000008306 00000 н. 0000008417 00000 н. 0000008486 00000 н. 0000008595 00000 н. 0000008664 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000008804 00000 н. 0000009296 00000 н. 0000010057 00000 п. 0000010087 00000 п. 0000010450 00000 п. 0000010681 00000 п. 0000010712 00000 п. 0000010735 00000 п. 0000011387 00000 п. 0000011787 00000 п. 0000012071 00000 п. 0000012094 00000 п. 0000012670 00000 п. 0000012693 00000 п. 0000013265 00000 п. 0000013288 00000 п. 0000013843 00000 п. 0000013866 00000 п. 0000014439 00000 п. 0000014462 00000 п. 0000015011 00000 п. 0000015195 00000 п. 0000015410 00000 п. 0000015433 00000 п. 0000015975 00000 п. 0000015998 00000 н. 0000016600 00000 п. 0000016755 00000 п. 0000017423 00000 п. 0000017631 00000 п. 0000031317 00000 п. 0000031488 00000 п. 0000003026 00000 н. 0000005136 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 7944 0 объект Wƫ) >> >> / LastModified (} \ (c / MWƫ) / MarkInfo> >> эндобдж 7945 0 объект + \) и \ nQgG] ӿ%;) / U (N «7P * 7u \ (? V1KW6k}) / П-12 / V 1 / Длина 40 >> эндобдж 7946 0 объект > эндобдж 7947 0 объект > / Кодировка> >> / DA (¼_7J \\ M) >> эндобдж 7948 0 объект > эндобдж 8017 0 объект > ручей jw> mN% {9TnTPp # 4n \ 2 | Bk}

    5hD] ~ & t] BZskFn #) yKav? Q5 > @cNcaqi? L | dʦ.х / ск] ҲǿHe-Xk` H ~ ​​# v = fDSb 8gV + — # (( ) _

    Страница не найдена | Alstom

    Полный портфель мобильных решений

    Мы предлагаем полный спектр оборудования и услуг, от высокоскоростных поездов, метро, ​​трамваев и электронных автобусов до интегрированных систем, индивидуальных услуг, инфраструктуры, сигнализации и решений цифровой мобильности.

    Откройте для себя наши решения

    Современные и проверенные решения

    Мы предлагаем обширный ассортимент проверенных и модульных компонентов для всех типов железнодорожного подвижного состава.Непрерывные исследования и разработки в сочетании с надежным оборудованием для проверки и многолетним опытом эксплуатации поездов Alstom и других производителей гарантируют, что наши клиенты получат как современные, так и проверенные решения.

    Выучить больше

    Цифровизация мобильности

    Инновации на трассе

    Мы предлагаем полный спектр экологически безопасных решений для прокладки путей, электрификации, а также поставки и установки электромеханических материалов по всему пути, на станциях и депо.Эти инфраструктурные решения, как для городских, так и для магистральных проектов, облегчают интеграцию продуктов в составе готовых решений.

    Выучить больше

    Новое изобретение мобильности

    Alstom использует свой технологический опыт и инновационные возможности для удовлетворения текущих и будущих потребностей операторов и пассажиров.Его решения охватывают весь спектр услуг, включая городской транспорт, магистральные перевозки, региональный транспорт, сети добычи полезных ископаемых и грузовые перевозки.

    Выучить больше

    Индивидуальная поддержка

    Мы предлагаем полный спектр индивидуальных услуг, включая техническое обслуживание, модернизацию, запчасти, ремонт и поддержку.Все это обеспечивает операторам высочайший уровень доступности их парков, инфраструктуры и систем сигнализации.

    Выучить больше

    Улучшение транспортного потока

    Наши современные сигнальные решения позволяют операторам обеспечивать высочайшие стандарты безопасного и беспрепятственного передвижения с помощью городских и магистральных решений, отвечающих конкретным потребностям каждой производственной среды.

    Выучить больше

    Повышение эффективности

    Опираясь на наши взаимодополняющие направления деятельности, мы предлагаем комплексные и полностью интегрированные системы, которые включают подвижной состав, сигнализацию, инфраструктуру и услуги. Такой подход «под ключ» оптимизирует выполнение проекта и производительность транспортной системы.

    Выучить больше

    Решения Bombardier

    Alstom приобрела Bombardier Transportation. Посетите сайт rail.bombardier.com, чтобы узнать о решениях Bombardier Transportation.

    % PDF-1.4 % 7943 0 объект > эндобдж xref 7943 76 0000000016 00000 н. 0000001894 00000 н. 0000002237 00000 н. 0000002393 00000 н. 0000002470 00000 н. 0000002623 00000 н. 0000005160 00000 н. 0000005594 00000 н. 0000005663 00000 п. 0000005753 00000 п. 0000005926 00000 н. 0000006025 00000 н. 0000006124 00000 н. 0000006277 00000 н. 0000006346 00000 п. 0000006457 00000 н. 0000006526 00000 н. 0000006633 00000 н. 0000006702 00000 н. 0000006771 00000 н. 0000006841 00000 н. 0000006972 00000 н. 0000007042 00000 н. 0000007149 00000 н. 0000007219 00000 н. 0000007336 00000 н. 0000007406 00000 н. 0000007520 00000 н. 0000007590 00000 н. 0000007699 00000 н. 0000007769 00000 н. 0000007877 00000 н. 0000007947 00000 н. 0000008058 00000 н. 0000008128 00000 н. 0000008237 00000 н. 0000008306 00000 н. 0000008417 00000 н. 0000008486 00000 н. 0000008595 00000 н. 0000008664 00000 н. 0000008733 00000 н. 0000008804 00000 н. 0000009296 00000 н. 0000010057 00000 п. 0000010087 00000 п. 0000010450 00000 п. 0000010681 00000 п. 0000010712 00000 п. 0000010735 00000 п. 0000011387 00000 п. 0000011787 00000 п. 0000012071 00000 п. 0000012094 00000 п. 0000012670 00000 п. 0000012693 00000 п. 0000013265 00000 п. 0000013288 00000 п. 0000013843 00000 п. 0000013866 00000 п. 0000014439 00000 п. 0000014462 00000 п. 0000015011 00000 п. 0000015195 00000 п. 0000015410 00000 п. 0000015433 00000 п. 0000015975 00000 п. 0000015998 00000 н. 0000016600 00000 п. 0000016755 00000 п. 0000017423 00000 п. 0000017631 00000 п. 0000031317 00000 п. 0000031488 00000 п. 0000003026 00000 н. 0000005136 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 7944 0 объект Wƫ) >> >> / LastModified (} \ (c / MWƫ) / MarkInfo> >> эндобдж 7945 0 объект + \) и \ nQgG] ӿ%;) / U (N «7P * 7u \ (? V1KW6k}) / П-12 / V 1 / Длина 40 >> эндобдж 7946 0 объект > эндобдж 7947 0 объект > / Кодировка> >> / DA (¼_7J \\ M) >> эндобдж 7948 0 объект > эндобдж 8017 0 объект > ручей jw> mN% {9TnTPp # 4n \ 2 | Bk}

    5hD] ~ & t] BZskFn #) yKav? Q5 > @cNcaqi? L | dʦ.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *